造血干细胞的体外扩增培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种造血干细胞的体外扩增培养 方法。
【背景技术】
[0002] 目前造血干细胞通常有三个来源：骨髓、外周血及脐带血。与骨髓和外周血造血 干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有富含更早期的 造血干细胞、采集方便，造血干细胞免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中 不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及 副作用、⑶34+⑶38-与⑶34+⑶33-的比例较高等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的 临床应用价值。但是，单份脐血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者 的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。
[0003] 而造血干细胞的体外扩增需要基质细胞的滋养，有关基质细胞和造血干细胞共 培养的研究，目前现有技术中大部分都采用了直接接触共培养的方法。在直接接触共培养 中造血干细胞会粘附在基质细胞上或进入滋养细胞层内部，虽然两种细胞呈弱结合，但是 实现两种细胞完全分离非常困难，而在临床应用中又必须使用不含基质细胞的纯净造血 干细胞，因此，这种直接接触共培养的方法在临床应用中存在着纯化细胞困难或免疫安全 性低等安全性问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中造血干细胞与基质细胞直接接触 共培养扩增造血干细胞的方式存在纯化造血干细胞困难、免疫安全性低等缺陷，提供一种 便于纯化造血干细胞、免疫较安全的造血干细胞的体外扩增方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞的体外扩增培 养方法，所述培养方法包括以下步骤：
[0006] 分别获取造血干细胞和基质细胞；
[0007] 所述造血干细胞和基质细胞被具有生物相容性的培养件隔开进行共培养；
[0008] 其中，所述培养件具有若干通孔，所述通孔的孔径小于或等于3. 0微米。
[0009] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞与基质细胞 的浓度比为5 :1-3 :1。
[0010] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述通孔的孔径大小在 0. 4-3. 0微米范围内。
[0011] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件呈板状将所述造 血干细胞和基质细胞隔开。
[0012] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件呈开口状且具有 一容纳空间，套设在细胞培养容器内。
[0013] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件底部与培养孔底 部的间距为10-450ym。
[0014] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件底部与细胞培养 容器底部的间距为150-350ym。
[0015] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件由聚碳酸酯材料 制成。
[0016] 在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞为脐带血干 细胞，所述基质细胞为脂肪干细胞。
[0017] 实施本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果：通过 采用具有生物相容性和通透性的培养件将造血干细胞和基质细胞隔开，并且仅能通过培养 件进行物质交流，造血干细胞可通过培养件与基质细胞进行胞质绒毛间接接触，也可以是 非接触，不仅解决了现有技术中造血干细胞和基质细胞直接接触共培养难分离的问题，而 且也提高了造血干细胞的扩增倍数，并增强造血干细胞的免疫安全性。
【附图说明】
[0018] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0019] 图1为本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法中，第一种培养容器及培养件 的截面示意图；
[0020] 图2为本发明提供的第二种培养容器及培养件的截面示意图；
[0021] 图3为本发明提供的第三种培养件的结构示意图；
[0022] 图4为本发明提供的第四种培养容器及培养件的截面示意图。
【具体实施方式】
[0023] 为解决现有技术中造血干细胞与基质细胞直接接触共培养扩增造血干细胞的方 式存在纯化干细胞困难、免疫安全性低等缺陷，本发明的创新点在于在造血干细胞和基质 细胞共培养体系中，提供一种具有通透性的培养件，用于隔开造血干细胞和基质细胞，防止 两者直接接触，使得造血干细胞和基质细胞可通过细胞绒毛接触间接式培养或非接触式培 养，而培养液及基质细胞的分泌物可自由穿过培养件为造血干细胞和基质细胞提供营养， 从而解决了现有技术中，难以分离造血干细胞和基质细胞的难题，也提高了造血干细胞的 免疫安全性。
[0024] 具体地，本发明提供的一种造血干细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：
[0025] S1、分别获取造血干细胞和基质细胞；
[0026] S2、采用具有生物相容性的培养件隔开造血干细胞和基质细胞，再对造血干细胞 和基质细胞进行共培养；
[0027] 其中，培养件具有若干通孔，且通孔的孔径小于或等于3. 0微米。
[0028] 进一步地，在步骤S1中，造血干细胞可来源于骨髓、外周血及脐带血，与骨髓和外 周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，采集方便，免疫原 性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集 和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、⑶34+⑶38-与⑶34+⑶33-的比例 较高等优点；因此，在本发明中，优先采用脐带血造血干细胞，具体地，造血干细胞的来源过 程为：
[0029]Slla、采集脐带血；
[0030] S12a、分离获取脐带血单个核细胞；
[0031] S13a、将脐带血单个核细胞诱导培养成脐带血造血干细胞。
[0032] 在步骤Slla中，脐带血均来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次采集 量为50-100mL;在步骤S12a中，首先将步骤Slla中采集的脐带血与PBS缓冲液以1 :1混 合稀释得到脐带血稀释液；然后，在15mL无菌塑料离心管内加入4mL密度为1. 077g/mL的 Ficoll分离液（Ficoll分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进 行细胞的分离纯化的常用试剂，购自于Sigma公司），然后用吸管轻轻地将脐带血稀释液滴 加到Ficoll液面上，以2500转/分钟的转速密度梯度离心25分钟，其中Ficoll分离液与 脐带血稀释液的比例为1: (1-2);离心结束后，用吸管吸取中间白膜层，获得UCB-MNCS(脐 带血单个核细胞）；分离后的细胞用頂DM基础培养基离心洗涤两次（1000rpm，5分钟），调 整单个核细胞密度为2X105cells/ml备用。由于脐带血中含有大量的造血干细胞，因此，在 该步骤中获得单个核细胞中已含有脐带造血干细胞，将其与单个核细胞一起共培养，能够 模拟一个脐带造血干细胞的微环境，更有助于脐带造血干细胞的扩增。在步骤S13a中，将 步骤S12a中获取的单个核细胞以2X105cells/ml的密度接种在底面积为25cm2并装有培 养液的组织培养瓶（T-flask)中，并在37°C、5%C02、20% 02、饱和湿度条件下培养7天， 至单个核细胞转化成造血干细胞，并采用流式细胞仪分离出脐带血来源的