造血干细胞。
[0033] 其中，培养液为IMDM培养基（Iscove，sModifiedDulbecco'sMedium,Gibco公司 生产），且頂DM培养基中添加有体积分数为10%的HS(马血清），10%FBS，16ng/mlSCF(人 类干细胞因子），7. 47ng/ml的FL(Flt-3配体），7. 47ng/ml的TP0 (血小板生成素），5. 33ng/ ml的IL-3 (白细胞介素3,造血干细胞生长因子），3. 33ng/ml的G-CSF(粒细胞集落刺激因 子），2. 13ng/ml的GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子）。
[0034] 另外，在步骤S1中，由于脂肪干细胞提供脂肪组织终生的自我更新，具有多向分 化潜能，可分泌多种已知和未知的生长因子，以维持和扩增造血干细胞，并且脂肪干细胞存 在于脂肪组织内，提取较方便等优点，因此，本发明优选选用脂肪干细胞作为基质细胞。
[0035] 脂肪干细胞的获取过程为：
[0036] S11b、获取脂肪组织；
[0037] S12b、从脂肪组织中提取脂肪干细胞；
[0038] S13b、对脂肪干细胞进行传代培养，并获取第三代脂肪干细胞。
[0039] 在步骤SIlb中，脂肪组织取自外科手术患者（年龄16-60岁）的皮下正常脂肪组 织。
[0040] 步骤S12b具体为：取步骤Sllb中获取的皮下脂肪约5g，用含有500U/mL双抗的 PBS缓冲液充分漂洗3遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，用眼科剪将其充分剪碎，再用 PBS反复冲洗，尽量除去红细胞。然后加入2倍体积的0.2%I型胶原酶，振荡混匀后，于 37°C的恒温水浴箱消化60min，加入等体积的含有体积分数为10 %胎牛血清的低糖DMEM 终止消化，1800r/min离心10min，离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织， 中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀。弃上层和中层，加入完全 培养基（完全培养基为低糖DMEM，其中，还含有体积分数为10%胎牛血清、1001]/1^青霉素 和100U/mL链霉素）重悬细胞沉淀，70ym细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为 1X10scells/L接种至60mm培养皿中，于37°C、体积分数5%C02，饱和湿度的条件下培养。 24h后半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次。
[0041] 步骤S13b具体为：原代培养7~9d生长融合达到90%，用0.25 %胰酶（含有 0. 2%EDTA)常规消化后，按1:2或1 : 3传代接种到含血清的培养液，放入37°C，5%C02 培养箱中进行体外传代扩增培养，获取第3代脂肪干细胞。
[0042] 可以理解的是，上述步骤S1中，造血干细胞和基质细胞的获取方式仅为本发明提 供的其中一种实施例，现有技术中用于获取造血干细胞和基质细胞的技术手段同样适用于 本发明。
[0043] 在S2步骤中，当培养件上的通孔的孔径大于3. 0微米时，基质细胞可穿过通孔迀 移到造血干细胞一侧，与造血干细胞直接接触共培养，此时，与现有技术中的造血干细胞与 基质细胞共培养方式基本相同；因此，本发明中限定通孔的孔径小于或等于3微米，优选 地，通孔的孔径大小在0. 4-3. 0微米范围内，而当孔径为0. 45微米时，基质细胞的胞质绒毛 可以穿过通孔与造血干细胞实现间接接触；培养基通过通孔传递基质细胞的旁分泌，促进 造血干细胞的扩增。
[0044] 进一步地，培养件是由聚碳酸酯膜或具有生物相容性的半透膜制成，由于聚碳酸 酯具有良好的生物相容性，且可溶性溶液可自由通过，与细胞培养液接触不会释放毒素或 黏附培养基中的关键成分，较适宜造血干细胞的扩增培养环境，因此，本发明中优先采用聚 碳酸酯膜制成培养件，当然培养件的材料也并不局限于此，可根据共培养的细胞类型及所 采用的培养液类型进行选择，以不影响造血干细胞扩增效果为宜，具有生物相容性及通透 性材料均可。
[0045] 进一步地，培养件可以呈板状或与细胞培养容器同轴的管状将细胞培养容器分成 两个或多个培养区，不同培养区之间仅可通过培养件上的通孔进行物质交流。由于造血干 细胞和基质细胞均为贴壁生长，因此，当培养件呈板状时，优选地，培养件将细胞培养容器 分隔成其轴向上的不同培养区，即竖直方向上的不同培养区，便于控制造血干细胞与基质 细胞的距离，提高基质细胞对造血干细胞的营养支持作用；同时，为保证培养液的高渗透 性，培养件的厚度小于20微米。而培养件与细胞培养容器内壁可活动连接，便于在不同培 养区内接种细胞，在细胞培养容器2内壁设置用于安放培养件100的凸台21 (如图1所示） 或在细胞培养容器2内壁开设用于卡设培养件110的凹槽22 (如图2所示）亦或是如图3 所示，培养件120底部设置用于支撑培养件120的支撑部121，支撑部121由两个或多个支 撑腿组成的支架，可将培养件120直接放置于细胞培养容器2中，方便培养件120的取放。 另外，为防止造血干细胞和基质细胞通过培养件与细胞培养容器之间的缝隙迀移至两种细 胞直接接触，在培养件的四周设置有密封胶圈，以密封两者之间的缝隙，密封胶圈的材质以 不与扩增培养体系发生化学反应为宜。
[0046] 可以理解的是，培养件与细胞培养容器内壁也可固定连接，此时，在细胞培养容器 靠近其底部的侧壁上开设接种口，并配置密封塞，接种时可拔出密封塞，将基质细胞或造血 干细胞加入位于细胞培养容器底部的培养区内；接种完成，将用密封塞密封接种口防止培 养液流出。
[0047] 如图4所示，培养件130也可以呈开口状并具有一容纳空间，套设在细胞培养容器 2内，并沿细胞培养容器2轴向将细胞培养容器2分成不同的培养区；优选地，培养件130呈 杯状，杯状培养件130的底部为通透性膜，为保证培养液及基质细胞分泌物的高渗透性，膜 的厚度小于20微米；杯状培养件130的侧壁材料与细胞培养容器2相同或同样由聚碳酸酯 膜制成，可直接套设在细胞培养容器2内；也可在培养件130开口处向外延伸出一支撑平台 131，培养件可通过该支撑平台131与细胞培养容器2开口处配合，使得培养件130可直接 套设或悬挂于细胞培养容器2中，对培养件130进一步支撑限位以避免培养件130不至于 接触到细胞培养容器2底部，当然也可使培养件130与细胞培养容器2过盈配合等方式来 实现培养件的固定；基质细胞接种于细胞培养容器2中，培养件130的外部；造血干细胞接 种于培养件130内，由于细胞培养容器2中放置了培养件130,因此培养件130中的容纳空 间相对于细胞培养容器2中的剩余空间较大，较适于为造血干细胞提供一个相对适宜的扩 增空间；当然造血干细胞和基质细胞的相对位置也并不局限于此，可根据具体需要进行配 置。可以理解的是，培养件的形状结构也并不局限于此，也可为膜滤器或通透性支架。
[0048] 进一步地，当培养件将细胞培养容器分成竖向上的不同培养区时，培养件底部与 细胞培养容器底部之间的间距过大或过小，均会影响基质细胞旁分泌对造血干细胞的支持 和扩增作用，因此，在本发明中，培养件底部与细胞培养容器底部的间距为10-450ym，使得 基质细胞与造血干细胞通过细胞绒毛间接接触或非接触，同时，培养件与细胞培养容器底 部之间的距离也决定了基质细胞近分泌和/旁分泌的浓度，进而影响其对造血干细胞扩增 的支持作用的强弱；而当培养件与细胞培养容器底部的间距为150-350ym时，造血干细胞 和基质细胞既能进行细胞信号传递，有旁分泌和近分泌，并且旁分泌占主导作用，在这个间 距下单个核细胞所需的养分被基质细胞吸收