一种nkt细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞领域，具体涉及一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT 细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤T(naturalkillerT，NKT)细胞，是一群细胞表面既有T细胞受体TCR， 又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT细胞能够表达NKT细胞标志NKT1. 1的T细胞，其 机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及 INF-y，对肿瘤细胞有杀伤作用。
[0003] NKT细胞主要包括免疫调节和细胞毒作用，NKT细胞的抗原识别与传统的T细胞 不同，不能识别由经典的MHC-I、II类分子提呈的脂类、蛋白质抗原，在这些抗原的刺激下 NKT细胞被激活，并迅速的产生IL-4、IFN-y、IL-10、IL-13等细胞因子，从而在抗肿瘤、抗 感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫中发挥重要的作用。NKT细胞是联系固有免疫和获得 性免疫的桥梁之一。
[0004]NKT细胞以双刃剑的方式调节着免疫系统，越来越引起人们的关注，对NKT细胞的 免疫活化及与疾病的关联的进一步研究将为人们在抗肿瘤、抗自身免疫性疾病及移植耐受 中提供一新的有效的治疗手段，具有广泛的应用前景。
[0005]目前，诱导培养NKT细胞的方法是从外周血中分离出单个核细胞，然后使用含有 10%胎牛血清的1?^11640培养基以及11-2和11-15两种细胞因子联合诱导培养得到疆丁 细胞。但现有的诱导培养NKT细胞的方法NKT细胞的扩增倍数不够大，用于免疫治疗或者 亚健康保健的话很大程度影响免疫治疗效果。而且现有的诱导培养NKT细胞的方法使用胎 牛血清，可能会引入一些支原体和病毒，存在一定的安全隐患。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NKT细胞诱导 培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂能促进 NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL-2UIL-7和0KT-3。生长因子 IL-21、IL-7和0KT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和 促进NKT细胞的增殖。
[0009] 其中，在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子 IL-21的用量为10ng/mL~100ng/mL。
[0010] 在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-7的 用量为 10ng/mL~100ng/mL。
[0011] 在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子0KT-3 的用量为 20ng/mL~100ng/mL。
[0012] 在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括X-VIV0-15培养基。 X-VIV0 15无血清培养基，不含任何外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添 加剂，可提供一个营养成分完全且平衡的体外环境，利于NKT细胞的生长和增殖。
[0013] 在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括生长因子IL-2和 IL-15〇
[0014] 在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-2的 用量为l〇〇U/mL~1000U/mL。
[0015] 在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-15 的用量为 10ng/mL~100ng/mL。
[0016] 在一些具体实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIV0-15培养基、生 长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和0KT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述 生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和0KT-3的用量均为50ng/ mL〇
[0017] 本发明还提供了 一种诱导培养NKT细胞的方法，取外周血单个核细胞，按 IX106cell/mL接种于NKT细胞诱导培养的添加剂中，放置37°C、5% 0)2恒温培养箱中诱 导培养；其中所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIV0-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、 IL-21、IL-7和0KT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的 用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和0KT-3的用量均为50ng/mL。
[0018] 在一些实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法，还包括每隔2~3天对细胞进 行补液的步骤。
[0019] 在一些优选实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法中所述补液具体为按照 lX106cell/mL密度添加X-VIV0 15 培养基以及IL-2、IL15、IL-21、IL-7 和 0KT-3,第七天 后的补液只添加X-VIV0 15培养基和IL-2、IL15 ;其中各生长因子的添加量均为培养基体 积的1%。
[0020] 在一些具体实施方案中，所述在一些具体实施方案中补液时生长因子IL-2的用 量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-2UIL-7和0KT-3 的用量均为50ng/mL;第七天后的补液的生长因子IL-2的用量为200U/mL，所述生长因子 IL-15 的用量为 30ng/mL。
[0021] 在一个具体实施例中，本发明采用添加不同生长因子及不同培养基的NKT细胞诱 导培养的添加剂培养单个核细胞，比较细胞活力。结果显示本发明所述NKT细胞诱导培养 的添加剂培养的细胞增殖了 45. 5倍，远高于其它组细胞诱导培养添加剂，而细胞活力相 当。表明本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂对NKT细胞具有很好的诱导增殖作用，而 且保持着较高的活性。
[0022] 乳酸脱氢酶（LDH)是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式 与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH在培养基上清中，可通过 30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐（INT)转化为红色的甲臜 (formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。
[0023] 在一个具体实施例中，本发明通过定量测量LDH来检测细胞的杀伤作用。结果显 示本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养的细胞毒性增强，远高于其它组细胞诱导培 养添加剂，表明用本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养NKT细胞可以提高NKT细胞 对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0024] 由上述技术方案可知，本发明提供了NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT 细胞的方法。本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂包括生长因子IL-21、IL-7和0KT-3。 生长因子IL-21、IL-7和0KT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好 地诱导和促进NKT细胞的增殖，能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀 伤效果。本发明所述诱导培养NKT细胞的方法，操作简单，能促进NKT细胞大量增殖，适合 NKT细胞的规模化生产。
【附图说明】
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0026] 图1示实施例2中经组一NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态 图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100 倍；
[0027] 图2示实施例2中经组二NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态 图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100 倍；
[0028] 图3示实施例2中经组三NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态 图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100 倍。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0030] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0031] 实施例1、外周血分离得到PBMC:
[0032] 1)取40mL人外周血至两个50mL离心管中，用生理盐水对外周血血液进行1:1稀 释并混合均匀；
[0033] 2)另取两个新的50mL离心管，加入15mL淋巴细胞分离液，然后按淋巴细胞分离 液：血液稀释液体积比为1:2,把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层， 注意不要冲破分离液层；
[0034] 3)放入冷冻离心机中（Eppendorf)，3000rpm/min离心30min，升降速调为0 ;
[0035] 4)离心结束后，用巴氏吸管吸取单个核细胞至15mL离心管中，用10