一种免疫细胞及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种免疫细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止 生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其 明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并 常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最 终造成患者死亡。
[0003] 恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后， 肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的 肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从 病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机 体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细 胞疗法、TIL细胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥 举足轻重的作用。
[0004] CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下途径：①CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤 细胞，通过直接的细胞质颗粒穿透封闭的肿瘤细胞膜，实现对肿瘤细胞的裂解；②通过诱导 肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞；③CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN-y等多种抗肿瘤的细胞因 子；④CIK细胞回输后可激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。
[0005] DC-CIK细胞疗法联合应用将取得" 1+1>2"的疗效，可以显著地抑制肿瘤细胞的生 长、增殖，明显改善患者的生活质量，提高肿瘤患者的生存期，是继肿瘤手术、放疗、化疗后 又一种更加有效的新手段。该疗法既可单独使用，也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅 助手段，效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极 微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞，在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用；对于 部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行DC+CIK细胞治疗，提 高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。
[0006] 目前，自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备简要流程包括：①外周血离心提取血 清，加亮抑蛋白酶抑制蛋白降解，_20°C冷冻后，0_4°C复温；②灭活处理，过滤，加到DC细胞 培养液刺激DC细胞；③共培养DC-CIK，达到DC细胞高度呈递肿瘤抗原信息，发挥CIK杀伤 效果。
[0007] 在各种免疫细胞治疗方案中，细胞与靶向细胞的亲和能力以及免疫细胞的杀伤能 力是免疫细胞治疗的关键。而目前的DC-CIK细胞制备方法中，离心获得的血浆中含有的肿 瘤抗原物质含量很低，经低温处理再复温除去上清的方法进行抗原成分浓缩，效果不明显， 再经灭活处理，肿瘤抗原特性极低，所以加入DC细胞培养液中刺激DC发育，效果不佳。因 此急需提供一种能够得到和肿瘤细胞具有高亲和反应的免疫细胞培养方案。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种免疫细胞及其制备方法。本发明同时利用肿瘤细胞 核苷酸和蛋白致敏源，强化刺激DC细胞，发挥更强的抗原致敏作用，达到与肿瘤细胞更高 的亲和性，且不存在肿瘤细胞的危险因素。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤1 :将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1 ;
[0012] 取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
[0013] 步骤2 :贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；
[0014] 步骤3 :悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；
[0015] 步骤4 :将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，杀伤性免疫细胞为CIK细胞或NKT细胞。但本发 明所述杀伤性免疫细胞并非限定于此，本领域技术人员认为可行的杀伤性免疫细胞均在本 发明的保护范围之内。
[0017] 作为优选，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5%~20%的制剂1、10~ 20ng/mL的GM-CSF和5~10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5%的 制剂l、15ng/mL的GM-CSF和10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0019] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加 10%的制剂l、20ng/mL的GM-CSF和5ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0020] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加 20%的制剂1、10ng/mL的GM-CSF和8ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0021] 作为优选，步骤2中培养6天后添加TNF-a培养1~3天。
[0022] 作为优选，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100~200U/mLIL-2、10~20ng/ mLIL_15、8 ~20ng/mLIL-21 和 40 ~60ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0023] 作为优选，4天后补液按总体积添加100~200U/mLIL-2、10~20ng/mLIL-15、 8 ~20ng/mLIL-21 和 40 ~60ng/mL0KT-3。
[0024] 在本发明提供的一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括lOOU/mL IL-2、15ng/mLIL-15、20ng/mLIL-21 和 40ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0025] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括150U/mL IL-2、20ng/mLIL-15、8ng/mLIL-21 和 50ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0026] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括200U/mL IL-2、10ng/mLIL-15、15ng/mLIL-21 和 60ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0027] 作为优选，共培养采用的培养基中添加100~200U/mLIL-2、10~20ng/mL IL-15,每3天补液一次。
[0028] 作为优选，在共培养中，补液的密度为（1~2)X106cell/mL。
[0029] 作为优选，共培养的时间至少为14天。
[0030] 作为优选，步骤1中PBMC的培养条件为：选用X-VIV015无血清培养基，接种密度 为（0.5 ~1)\10\611/1^，37°(：，5%〇)2条件下培养2~411。
[0031] 在本发明提供的一些实施例中，肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿 瘤细胞。
[0032] 作为优选，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量比为1:5~5:1混合。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量 比为1:1混合。
[0034] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质 量比为1:5混合。
[0035] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质 量比为5:1混合。
[0036] 本发明还提供了一种免疫细胞，其制备方法包括如下步骤：
[0037] 步骤1 :将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1 ;
[0038] 取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
[0039] 步骤2 :贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；
[0040] 步骤3 :悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；
[0041] 步骤4 :将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。
[0042] 作为优选，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5%~20%的制剂1、10~ 20ng/mL的GM-CSF和5~10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0043] 在本发明提供的一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5%的 制剂l、15ng/mL的GM-CSF和10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0044] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加 10%的制剂l、20ng/mL的GM-CSF和5ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0045] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加 20%的制剂1、10ng/mL的GM-CSF和8ng/mL的IL-4的无血清培养基。
[0046] 作为优选，步骤2中培养6天后添加TNF-a培养1~3天。
[0047] 作为优选，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100~200U/mLIL-2、10~20ng/ mLIL_15、8 ~20ng/mLIL-21 和 40 ~60ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0048] 作为优选，4天后补液按总体积添加100~200U/mLIL-2、10~20ng/mLIL-15、 8 ~20ng/mLIL-21 和 40 ~60ng/mL0KT-3。
[0049] 在本发明提供的一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括lOOU/mL IL-2、15ng/mLIL-15、20ng/mLIL-21 和 40ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0050] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括150U/mL IL-2、20ng/mLIL-15、8ng/mLIL-21 和 50ng/mL0KT-3,4 天后补液。
[0051] 在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培