一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学、分子生物学和医学领域的研究领域，设及一种造血干细 胞体外扩增培养的无血清培养基，更具体地说，设及用于造血干细胞体外扩增培养的无血 清培养基及其应用。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞化ematopoietic stem cell，HSC)是指体内尚未发育成熟并且负责生 成所有各系血细胞的最原始的细胞群。HSC是多功能干细胞，医学上称其为巧能细胞"。造 血干细胞有高度自我更新能力和多种分化潜能，可产生所有成熟的血细胞，如红细胞、白细 胞、血小板和淋己细胞等。HSC是一种不均一、不成熟造血前体细胞，在生命过程中能重建整 个造血系统，具有向B细胞和粒细胞两种途径分化，并且有维持长期造血的功能。近年来， HSC越来越多地被应用于临床治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病及一些先天 性疾病等，在儿科的血液病、肿瘤、遗传病的治疗中也表现出一定的应用前景。临床发现 HSCT时造血干细胞的数量与移植后造血和免疫功能的重建有密切关系，并且大剂量的造血 干细胞的输注利于供者造血干细胞在受体内的植入。所W在HSC用于治疗时，也面临着一个 严峻的问题:没有足够多的HSC用于移植。
[0003] 服C进行体外扩增培养是一个很好的解决方法，同时也是一项极具挑战的技术，基 于W下几种原因：① HSC的体外扩增要求保持持续的自我更新能力的同时，也在扩增中阻止 其分化;但是，关于调节HSC的自我更新和阻止HS讶广增的生理学机制的认识有限;②扩增干 细胞的数量与移植的成功率密切相关。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于培养细胞的无血清培养基。
[0005] 本发明提供的用于培养细胞的无血清培养基包括重组人膜岛素、重组人转铁蛋 白、重组人血白蛋白、0-琉基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸和油酸。
[0006] 上述无血清培养基中，所述重组人膜岛素、所述重组人转铁蛋白和所述重组人血 白蛋白均指能通过基因工程手段进行体外表达得到的，是能够重复人工制备的。
[0007] 上述无血清培养基中，
[000引所述重组人膜岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述0-琉基乙 醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为5-30:20-80:50-300:10-100:1-10:1-10:0.1-5:1.50
[0009] 上述无血清培养基中，
[0010] 所述重组人膜岛素、所述重组人转铁蛋白、所述重组人血白蛋白、所述e-琉基乙 醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸和所述油酸的质量比为10 : 50 :100 : 40 : 5 : 5 : 1: 1.5。
[0011] 上述无血清培养基中，
[0012] 所述培养基还包括基础培养基、谷氨酷胺、干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介 素6、血小板生成素、促红细胞生成素、粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因 子；
[0013] 所述基础培养基为细胞基础培养基；所述细胞基础培养基具体为IMDM基础培养 基。
[0014] 所述培养基由所述IMDM基础培养基、所述重组人膜岛素、所述重组人转铁蛋白、所 述重组人血白蛋白、所述0-琉基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所 述心谷氨酷胺、所述干细胞因子、所述白细胞介素3、所述白细胞介素6、所述血小板生成素、 所述促红细胞生成素、所述粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子和所述粒细胞集落刺激因子组 成。其中，所述k谷氨酷胺在细胞临培养前加入;所述干细胞因子、所述白细胞介素3、所述 白细胞介素6、所述血小板生成素、所述促红细胞生成素、所述粒细胞-巨隧细胞集落刺激因 子和所述粒细胞集落刺激因子均在细胞培养的过程中加入。
[0015] 上述无血清培养基中，所述培养基的抑为6.8-7.2。
[0016] 上述无血清培养基中，
[0017] 所述重组人膜岛素在所述无血清培养基中的浓度为5-30mg/l;
[0018] 所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为20-80mg/l;
[0019] 所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为50-300mg/L
[0020] 所述e-琉基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为lo-ioomg/i;
[0021] 所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为l-lOmg/l;
[0022] 所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为l-iomg/l;
[0023] 所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0. l-5mg/l;
[0024] 所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0. l-5mg/l;
[0025] 所述k谷氨酷胺在所述无血清培养基中的浓度为100-800mg/L
[0026] 所述干细胞因子在所述无血清培养基中的浓度为lO-lOOng/mL
[0027] 所述白细胞介素3在所述无血清培养基中的浓度为10-1 OOng/mL [00%]所述白细胞介素6在所述无血清培养基中的浓度为lO-lOOng/mL
[0029] 所述血小板生成素在所述无血清培养基中的浓度为1-lOU/ml;
[0030] 所述促红细胞生成素在所述无血清培养基中的浓度为1-lOU/ml;
[0031] 所述粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为IO-SOng/ ml ；
[0032] 所述粒细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为10-5化g/ml。
[0033] 上述无血清培养基中，
[0034] 所述重组人膜岛素在所述无血清培养基中的浓度为lOmg/l;
[0035] 所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为50mg/l;
[0036] 所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为1 OOmg/l;
[0037] 所述(6-琉基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为40mg/l;
[0038] 所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为5mg/l;
[0039] 所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为5mg/l;
[0040] 所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为Img/l;
[0041] 所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为1.5mg/l;
[0042] 所述k谷氨酷胺在所述无血清培养基中的浓度为584mg/l;
[0043] 所述干细胞因子在所述无血清培养基中的浓度为50ng/mL
[0044] 所述白细胞介素3在所述无血清培养基中的浓度为20ng/mL
[0045] 所述白细胞介素6在所述无血清培养基中的浓度为20ng/mL
[0046] 所述血小板生成素在所述无血清培养基中的浓度为4U/ml;
[0047] 所述促红细胞生成素在所述无血清培养基中的浓度为3U/ml;
[0048] 所述粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为14ng/ml;
[0049] 所述粒细胞集落刺激因子在所述无血清培养基中的浓度为20ng/ml。
[0050] 本发明的无血清培养基在具体的使用中，先将1000 ml IMDM基础培养液（Gibco 31980030)、重组人膜岛素（大肠杆菌重组表达，LWE公司）、重组人转铁蛋白（酵母重组表 达，Invitria公司）、重组人血白蛋白（Invitria公司，Cellastim)、0 -琉基乙醇 (Invitrogen,21985-023)、乙醇胺（Sigma,E0135)、胆固醇（Sigma,C1231)、亚油酸（Sigma, LI 012)和油酸(S i gma，01383)混匀，得到造血干细胞IMDM培养体系1;在细胞临培养前向上 述造血干细胞IMDM培养体系中加入心谷氨酷胺，得到造血干细胞IMDM培养体系2;再将待培 养的免疫细胞加入上述造血干细胞IMDM培养体系2中，并在细胞培养的过程中，加入干细胞 因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、血小板生成素(TP0)、促红细胞生成 素巧PO)、粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，得到造 血干细胞无血清培养基。
[0051] 本发明的另一个目的是提供上述培养基的新用途。
[0052] 本发明提供了上述培养基在细胞体外扩增培养中的应用。
[0053] 本发明的最后一个目的是提供一种细胞的培养方法。
[0054] 本发明提供的细胞的培养方法包括如下步骤:用上述培养基培养细胞。
[0055] 上述培养基或上述应用或上述方法中，所述细胞为造血干细胞，所述造血干细胞