人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体而言，设及一种人巨细胞病毒感染性克隆及其构 建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒化Uman巧tomegalovirus，HCMV)属于瘤疹病毒0亚科，其基因组 约230化，编码超过200个开放阅读框（open reading化ame, 0RF)，是目前已知最大的人类 瘤疹病毒。HCMV的基因在宿主细胞内的转录具有时相性，分为立即早期（immediate early， IE)、早期（early,巧和晚期（late,L) S类。其中，立即早期基因表达的病毒蛋白如IEl和 IE2 (又名UL123和化122)是病毒复制时最重要转录激活因子，也是之后的早期和晚期基 因表达所必需的调控因子；早期基因编码的蛋白如化44和pp65等主要与基因的复制相关； 而晚期蛋白如浊和MCP等主要参与包装病毒的基因组形成完整的病毒粒子。
[000引肥MV只能感染人类，可通过日腔，生殖道，胎盘，输血或器官移植等多途径传播，感 染非常普遍，且多呈隐性或潜伏感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器 官和系统产生严重疾病。在我国，HCMV感染率高达90 % W上。该病毒感染在免疫功能正常 者几乎无任何临床症状，但多数HCMV感染可由原发性感染转为潜伏感染，并在免疫功能受 损或抑制时被激活，因此对免疫低下者如艾滋病患者和器官移植受者则可能是致命的。
[0004] HCMV潜伏于唾液腺、骨髓、神经节、外周血单个核细胞（PBMC)等处，然而仅 0. 004 % -0.0 l %的PBMC携带2-13个拷贝的HCMV基因组，因此通过PBMC样本进行研 究是有限的。此外，相关技术中，研究人员先后利用小鼠和恒河猴建立了 MCMV (murine 巧tomegalovirus)和MiCMVCrhesus巧tomegalovirus)的动物模型，证实了脑是先天性 CMV感染的祀器官，运些研究结果和研究工具，对于HCMV的研究具有重要的指导和借鉴作 用。然而，由于严格的感染种属特异性，HCMV的致病机理研究受到实验材料的限制，因此继 续发展新的HCMV研究手段和工具是非常必要的。
[0005] 目前，对瘤疹病毒感染的控制尚无特异性有效措施。寄希望于疫苗，特别是新型 疫苗，如亚单位疫苗、重组活疫苗、DNA疫苗的研究。试验证明，疫苗对阻止原发感染有作 用，但重组HCMV糖蛋白疫苗虽能诱生高水平中和抗体，却不能保护机体的再感染。在抗 HCMV的药物中，临床常用的有无环鸟巧（acyclovir)、丙氧鸟巧（ganciclovir)、阿糖腺巧 (Vidarabine)等。运些药物均能抑制病毒DNA合成，使病毒在细胞内不能复制，从而减轻临 床症状，但不能彻底防止潜伏感染的再发。
[0006] 瘤疹病毒是一类大分子量的DNA病毒，其基因组全长一般都超过100化，要在如此 巨大分子量的基础上研究病毒单个基因的功能和致病机理十分困难，基因组本身不能长时 间保存，且不能自我复制，更不能进行分子生物学的突变改造等一系列的实验手段。并且， 病毒长期在体外固定细胞系如肥L上进行传代扩增，可能丢失基因组上与细胞嗜性或毒性 相关的部分基因，从而无法长期稳定的保存原始形状。因此，提供一种研究瘤疹病毒（具体 为HCMV)局部片段或者病毒自身编码蛋白的功能和致病机理的感染性克隆（W期深入了解 HCMV病毒编码的蛋白的功能，有效地预防和治疗由于该病毒引起的疾病，并为HCMV病毒疫 苗的研发提供理论基础）是人们亟待解决的一个技术问题。
[0007] 有鉴于此，特突出本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，通过该构建方 法可W实现人巨细胞病毒感染性克隆，且该感染性克隆为深入开展HCMV病毒的复制机制 与致病机理等方面提供了研究工具，具有巨大的应用价值。
[0009] 本发明的第二目的在于提供上述方法构建的人巨细胞病毒感染性克隆，该感染性 克隆具有稳定产生HCMV的能力，产生的HCMV重组病毒的生物学特性与野生型病毒相似，而 且还可W通过GFP报告基因的表达来观察病毒株感染性克隆在细胞内的感染情况。
[0010] 该感染性克隆发生抗原抗体反应后，与野生型HCMV Han病毒相比，不但检测灵敏 性和特异性没有减弱，反而因为本身的巧光蛋白使得该病毒在IFA的实验中光强度更高， 在显微镜下更利于视野的捕捉。巧光效率高，巧光色泽与背景色泽对比鲜明，标记后能保持 生物学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。
[0011] 本发明的第=目的在于提供上述的人巨细胞病毒感染性克隆的用途，W实现其应 用价值。
[0012] 本发明所构建的带有GFP标签的HCMV-Han感染性克隆可W用于HCMV病毒编码的 蛋白功能的研究中，从而为流行病学研究W及HCMV毒株疫苗的开发提供了材料。
[0013] 为了实现W上目的，本发明采用的技术方案如下：
[0014] 本发明提供了一种人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，包括W下步骤：
[001引1)、将绿色巧光蛋白（GFP)基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；
[0016] 2)、W野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增 产物分别依次经过纯化、酶切后再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；
[0017] 3)、将所述同源重组臂全长序列与所述带有GFP的BAC载体进行连接后通过转化、 质粒提取W及酶切线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒；
[001引 4)、用野生型的HCMV Han病毒感染转染肥L细胞，并利用所述带有HCMV Han同源 序列的线性化BAC穿梭质粒转染感染的肥L细胞，再经过传代培养后提取发生了同源重组 且带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA ;
[0019] 5)、将所述带有HCMV Han-BAC重组病毒基因组的细胞总DNA电转化至感受态细胞 DHlOB中，并在含有氯霉素抗性的培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆。
[0020] 本发明所构建的感染性克隆可进行各种分子和细胞水平上的鉴定。通过细胞病变 的观察、GFP的检测、病毒特定基因的检测和病毒的激活等方法，证明了 HCMV Han-BAC全长 感染性克隆具有稳定产生HCMV的能力，产生的HCMV重组病毒的生物学特性与野生型病毒 相似。
[002。 该感染性克隆能够在间接免疫巧光法（IFA)和蛋白质印迹法（western blot) 的配合下深入了解HCMV病毒编码的蛋白等功能，可有效地预防和治疗由于该病毒引起 的疾病，还能为HCMV病毒疫苗的研发提供理论基础。此外，该方法构建的带有细菌人工 染色体基因的HCMV Han病毒感染性克隆HCMV Han-BAC,其序列为可参照NCBI数据库 (GenBank:KJ426589. I) 0
[0022] 可选的，在步骤I)中，具体包括：
[002引 11)、将mini-F质粒去掉Ba恤I位点，得到PUS-F2质粒；将PUS-F2质粒的其中一 个限制性酶切位点ClaI去除，得到PUS-F3质粒；
[0024] 12)、W去除Ba恤I位点的质粒PGET007为模板，扩增绿色巧光蛋白基因，并将该扩 增产物克隆至pGEM-T载体中，得到pGEM-GFP质粒；
[0025] 13)、W所述pGEM-GFP质粒为模板，继续扩增包括限制性酶切位点化ndIII和两个 ClaI位点的GFP片段，并克隆至所述PUS-F3质粒的ClaI位点处中，得到PUS-F4质粒；
[0026] 14)、将所述PUS-F4质粒的两个ClaI位点之间的HindIII位点去除，得到PUS-F5 质粒。
[0027] 可选的，在步骤2)中，具体包括：
[0028] 21)、提取野生型肥MV化n病毒基因组DNA ;
[0029] 22)、W所述野生型HCMV Han病毒基因组DNA为模板，W如沈Q ID NO: 1和沈Q ID N0:2所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，W如SEQ ID N0:3 和SEQ ID N0:4所示序列为引物，扩增位于HCMV Han基因组中US区域的左臂序列，分别得 到左臂片段和右臂片段两个同源重组臂；
[0030] 23)、将所述左臂片段和所述右臂片段分别进行纯化和BamHI酶切后进行连接反 应，并W该连接产物为模板进行PCR，得到同源重组臂全长序列。
[0031] 可选的，在步骤3)中，具体包括：
[0032] 31)、将所述同源重组臂全长序列与所述pUS-巧质粒分别利用HindIII进行酶切 和纯化，纯化后于15-17°C进行连接反应4-5小时后转化到E. COli DN5 a，于35-38°C培养 于含氯霉素抗性的培养基后，挑取单克隆提质粒，得到带有左右臂同源序列的BAC穿梭质 粒 pus-ra;
[0033] 32)、将所述PUS-F6穿梭质粒利用BamHI进行单酶切反应，35-38°C水浴反应4-5 小时后，向酶切反应体系中加入无水乙醇和醋酸钢，混匀后在-85°C~-75°C沉淀，经洗涂 并重悬于去离子水后，得到带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-ro质粒。
[0034] 可选的，在步骤4)中：具体包括：
[0035] 41)、用野生型的HCMV Han病毒感染肥L细胞；
[0036] 42)、感染5-6小时后，利用带有HCMV Han同源序列的线性化pUS-ro质粒转染经 HCMV Han病毒感染的肥L细胞，连续传代培养数次后，挑选带有GFP的病变隧斑；
[0037] 43)、用所述带有GFP的病变隧斑感染新鲜的肥L细胞并