专利名称：一种高通量克隆构建重组杆状病毒的方法
技术领域：
本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种高通量直接定向克隆构建重组杆状病毒的方法。特别适合用于表达来源真核生物的基因和构建基于真核生物cDNA的表达文库。
背景技术：
随着更多物种全基因组测序的完成，发展高通量的表达克隆技术研究基因和蛋白质的功能受到了人们的迫切关注。目前已有一些公司和研究单位构建了杆状病毒的克隆表达系统，如Invitrogen公司的Bac-to-BacTM系统，BD公司的BaculoGoldTMBright系统，奥地利农业大学Ernst等人提出的直接克隆的方法。这几个方法采用的技术路线各不相同，但代表了当前构建杆状病毒3种主要的方法。第一种是以BaculoGoldTMBright为代表，通过将目的基因首先克隆到穿梭载体上，带外源基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒基因组质粒在昆虫细胞进行重组，经过筛选得到重组杆状病毒。第二种以Bac-to-BacTM系统为代表，将目的基因首先克隆到穿梭载体上，在含有辅助质粒的大肠杆菌中带外源基因的穿梭载体将表达盒式结构转座到杆状病毒基因组质粒上，得到的重组杆状病毒质粒在昆虫细胞内包装得到重组杆状病毒。第三种以直接连接的方法为代表，在杆状病毒基因组上引入稀有的限制性内切酶I-Sce I，将目的基因克隆到经I-Sce I消化的杆状病毒基因组载体上，在昆虫细胞内包装得到重组杆状病毒。这些方法在一定程度上提高了实验效率，降低了实验成本，但这些方法存在不足，主要表现在以下三方面一、实验周期长，得到重组杆状病毒的效率低。这两种方法都需要借助一种中间载体实现目的基因的克隆，然后通过在昆虫细胞或大肠杆菌内重组。因此整个构建过程需要多次连接和转化。第一种方法需要在昆虫细胞内重组，这种重组效率是很低的，因此在后续阶段需要对病毒进行鉴定，将带有目的基因的重组病毒与不带目的基因的杆状病毒分开，需要经过多轮的空斑纯化，这个过程费时费力。第二种方法需要在大肠杆菌内发生转座，这种转座的效率也很低，需要用蓝白斑的方法筛选成功转座的重组杆状病毒质粒，最后在昆虫细胞内包装得到重组杆状病毒。第三种方法虽然可以直接克隆目的基因，但杆状病毒基因组不能在大肠杆菌中复制，需要用超速离心的方法分离杆状病毒基因组，并且需要用去磷酸化反应消除背景，实验过程复杂。
二、不适合于构建真核生物cDNA表达文库。前两种方法都需要先将目的基因通过限制性内切酶克隆于穿梭载体上，所得的重组质粒要与杆状病毒骨架载体在昆虫细胞内或大肠杆菌内重组而得到重组杆状病毒，经过二次转化，导致库容量非常有限，很难满足构建文库对库容量的基本要求。第三种方法虽然可以建库，但需要超速离心的方法分离病毒基因组，需要用稀有酶进行连接克隆，需要用去磷酸化酶消除背景，并且需要设计很长的引物，实验成本较高，并不适合进行大规模的研究。
三、很难实现同时表达多个基因，前两种系统需要共转化，步骤繁琐并且鉴定过程复杂费时，后一种方法很难表达多基因。
(参见刊物“Journal of Virology 1993年第67卷4566-4579页”；“NucleicAcid Research 1994年第22卷2855-2856页”)发明内容本发明的目的是提供一种新的构建重组杆状病毒的技术，真正能做到高通量、直接、定向克隆表达目的基因，在构建过程中不需要依赖中间载体；无需任何同源重组和转座过程；也不需要费时费力的空斑纯化过程，就能方便迅速地构建重组杆状病毒，既能融合表达，也能非融合表达。
本发明是这样实现的。主要包括一个已有的杆状病毒表达载体系统和经PCR引物扩增的目的基因，通过对已有的杆状病毒表达载体系统进行转座和电转化筛选，在该载体上引入两个唯一的Bsu 36 I酶切位点序列和一个带有与前两个Bsu 36 I酶切位点序列不同的另一个Bsu 36 I识别序列的荧光基因表达单元；在扩增目的基因的一对PCR引物的5′端分别引进4个特定的碱基，在dGTP，或者dATP，或者dCTP，或者dTTP存在的条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体双酶切得到的粘性末端匹配，可以定向克隆在经Bsu 36I的酶切的载体上，转染昆虫细胞，在昆虫细胞内包装成重组杆状病毒粒子。
具体做法是，对已有的一套杆状病毒载体系统(包括杆状病毒基因组载体、转运载体)进行分析，选择合适的酶切位点Bsu 36 I，应满足的条件为1.酶切能得到5′突出的粘性末端的碱基种类不超过3种；2.载体本身存在的该酶切位点的数目尽可能的少。由于已有的杆状病毒的基因组上不存在Bsu 36 I酶切位点，因此在一个荧光蛋白基因的两端设计一个多核苷酸的接头，使其两端分别引进一个Bsu 36 I酶切位点；通过该接头使荧光蛋白基因克隆到转运载体上并将Bsu 36 I酶切位点引入。在大肠杆菌中带有Bsu 36 I酶切位点的转运载体将荧光蛋白基因表达单元转座到杆状病毒基因组上得到最终目标载体，该载体经Bsu 36 I酶切后，产生这样两个粘性末端3′ CC —— CCACT 5′5′TAAGG —— GG3′目的基因一对PCR引物的5′端分别引入5′TTAC3′和5′TGAC3′这样4个核苷酸，PCR扩增到的产物加dGTP，经T4DNA聚合酶处理，产生这样的粘性末端5′ TTAC —— G3′3′G —— CAGT 5′该粘性末端正好可与载体双酶切产生的粘性末端匹配，从而使PCR产物直接克隆到载体上，转染昆虫细胞，在昆虫细胞内包装得到重组杆状病毒病毒粒子。
多核苷酸的接头两端的限制性内切酶可以是Asc I、Bsu 36 I、Cla I、CpoI、Ear I、Not I、Sap I、Sty I等中的任意两种或Asc I、Bsu 36 I、Cla I、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I等中的任意一种。任何酶切后能得到的5′突出的粘性末端的碱基种类不超过3种(含3种)的限制性内切酶均能使用。
由于在荧光蛋白基因内定点诱变出一个与用于克隆目的基因的两个限制性内切酶不同的Bsu 36 I酶切位点。最终杆状病毒基因组载体经Bsu 36 I完全酶切，使得荧光蛋白基因被破坏，排除因为荧光蛋白基因重新连接到杆状病毒载体而产生的载体背景。
本发明可以对已有的杆状病毒载体进行修饰，消除载体本身带有的用于克隆的目的基因的限制性内切酶酶切位点，如Bsu 36 I，便于克隆目的基因。
本发明可与所有基于PCR建库的方法相容。
本发明可用于构建包括人在内的多种真核生物细胞或组织作为宿主的重组杆状病毒。
本发明与现有的技术相比具有明显的优势一、特殊设计的引物扩增所得的PCR产物用T4DNA聚合酶消化，然后与经过特殊的限制性内切酶消化的被修饰过的杆状病毒基因组载体直接并且定向进行连接和转染，从而一步构建得到重组杆状病毒粒子。整个构建过程不需要任何中间载体，也不需要在昆虫细胞系中或大肠杆菌中进行同源重组或转座的步骤，更不需要使用昂贵的稀有酶，操作简便，无需二次连接和转化，缩短了实验周期，简化构建重组杆状病毒的步骤。利用该方法大大提高了实验效率，构建一个重组杆状病毒的工作可在一周内完成。
二、在荧光蛋白基因内定点诱变出一个与用于克隆目的基因的两个限制性内切酶不同的Bsu 36 I酶切位点。最终杆状病毒基因组载体经Bsu 36 I完全酶切，使得荧光蛋白基因被破坏，排除因为荧光蛋白基因重新连接到杆状病毒载体而产生的载体背景，真正做到零背景构建重组杆状病毒。
三、与目前报道的所有基于PCR建库的方法相容，能够用来高通量的构建基于杆状病毒的真核生物cDNA表达文库，可以尽可能真实的表达真核生物的cDNA。
四、如果在杆状病毒基因组上引进两种以上特定的限制性内切酶酶切位点，可以实现多基因的同时克隆表达。
具体实施例方式
下面以实施例对本发明进一步说明实施例1利用该方法在昆虫细胞Sf9细胞系中表达枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶。
选择一套杆状病毒载体(包括杆状病毒基因组载体Bacmid和转运载体pFast)进行分析，由于在Bacmid上没有Bsu 36 I位点，所以选择Bsu 36 I酶切位点作为目的基因的克隆位点。设计两个多核苷酸接头，分别引进不同的Bsu 36 I酶切位点，中间连接一个荧光蛋白基因，将此接头引入到pFast上，得到的重组质粒在大肠杆菌DH10Bac中将荧光蛋白表达单元转座到Bacmid，得到的混合质粒电转化大肠杆菌DH10B筛选得到最终的目标载体pHBMBacmid1.1。针对目标基因甘露聚糖酶基因序列设计一对引物，其5′端分别引进5′TTAC3′和5′TGAC3′这几个额外的核苷酸，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶(Pfu)进行PCR扩增，得到的产物在dGTP存在的情况下，经T4DNA聚合酶处理后，其PCR产物两端各有一个5′端突出3个碱基的粘性末端，该产物能定向克隆到经Bsu 36I酶切的pHBMBacmid1.1上，直接转染昆虫细胞系Sf9细胞，72小时后检测到酶活，五天后收集重组杆状病毒粒子重新感染Sf9细胞，检测到甘露聚糖酶蛋白的高水平表达。
实施例2红荧光蛋白在Sf9细胞中表达。
按实施例1的方法在质粒pDsRed2-1上设计扩增红荧光蛋白基因DsRed的PCR引物，用高保真DNA聚合酶(Pfu)扩增红荧光蛋白基因，扩增产物在dGTP存在的情况下，同样经T4DNA聚合酶处理后，定向克隆到经Bsu 36 I酶切的pHBMBacmid1.1上，直接转染昆虫细胞系Sf9细胞，72小时后用荧光显微镜观察，经激光激发，可以观察到有细胞发出的红色荧光，五天后收集重组杆状病毒粒子重新感染Sf9细胞，观察到感染的细胞发出明显的红色荧光。
中间载体(转运载体)pFast是购置于美国Invitrogen公司，用于发生转座的大肠杆菌DH10Bac及用于电转化筛选的大肠杆菌DH10B均购置于美国Invitrogen公司，杆状病毒基因组载体Bacmid是大肠杆菌DH10Bac内自身带有的质粒。红荧光蛋白基因是从我们购买的美国BD公司质粒pDsRed2-1上PCR扩增得的。
权利要求
1.一种高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，主要包括一个已有的杆状病毒表达载体和经PCR引物扩增目的基因，其特征在于通过对已有的杆状病毒载体系统进行电转化大肠杆菌筛选得到可自主复制的杆状病毒载体，在该载体上引入了两个唯一的特殊限制性内切酶酶切位点序列和荧光蛋白基因表达单元，在扩增目的基因的一对PCR引物的5′端分别引进3-4个特定的碱基，在dGTP，或者dATP，或者dCTP，或者dTTP存在条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体的双酶切得到的粘性末端匹配，从而可以与在经Bsu 36 I双酶切的载体连接，连接物可直接转染昆虫细胞系，得到重组杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，其特征在于在一个荧光蛋白表达单元的两端设计一个多核苷酸的接头，使其两端分别引进两个不同的Bsu 36 I酶切位点分别是5′CCTTAGG3′和5′CCTCAGG 3′；通过定点诱变在荧光蛋白基因内产生一个与前两个限制性内切酶Bsu 36 I识别序列不同的Bsu 36 I酶切位点5′CCTAAGG 3′；通过该接头使荧光蛋白基因克隆到转运载体上并将Bsu 36 I酶切位点引入；转运载体通过转座子转座以及电转化筛选，从而得到最终的杆状病毒载体，最终的载体经Bsu 36 I完全酶切，产生这样的两个粘性末端3′ CC——————CCACT 5′5′TAAGG——————GG3′目的基因一对PCR引物的5′端分别引入5′TTAC3′和5′TGAC3′这样4个核苷酸，PCR扩增到的产物加dGTP，经T4DNA聚合酶处理，产生这样的粘性末端5′TTAC——————G 3′3′ G——————CAGT 5′该粘性末端正好可与载体双酶切产生的粘性末端匹配，从而使PCR产物直接克隆到载体上。
3.根据权利要求1或2所述的高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，其特征在于两个特殊的限制性内切酶，可以是酶切后能得到的5′突出粘性末端的碱基种类不超过3种(含3种)的限制性内切酶，两个特殊的限制性内切酶具体可以是Asc I、Bsu 36 I、Cla I，、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I中的任意两种或Asc I、Bsu 36 I、Cla I、Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I中的任意一种。
4.根据权利要求1或2所述的高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，其特征在于在荧光蛋白基因内定点诱变出一个与用于克隆目的基因的两个限制性内切酶不同的Bsu 36 I酶切位点。最终杆状病毒载体经Bsu 36 I完全酶切，使得荧光蛋白基因被破坏，排除因为荧光蛋白基因重新连接到杆状病毒载体而产生的载体背景。
5.根据权利要求1或2所述的高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，其特征在于可与所有基于PCR建库的方法相容。
6.根据权利要求1或2所述的高通量克隆构建重组杆状病毒的方法，其特征在于可用于构建包括人在内的多种真核生物细胞或组织作为宿主的重组杆状病毒。
全文摘要
本发明提出了一种高通量克隆构建重组杆状病毒的方法。它是利用特定限制性内切酶双酶切杆状病毒载体与T
文档编号C12N7/01GK1624117SQ20041006108
公开日2005年6月8日 申请日期2004年11月8日 优先权日2004年11月8日
发明者马立新, 周莉, 马琪 申请人:湖北大学