携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQIDNO.22所示。该全长感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒。本发明成功获得的携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
【专利说明】携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒及制备方法和应用，应用包括在解析脑神经环路、乙型脑炎病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选中的应用。
【背景技术】
[0002]人脑是自然界中最为复杂的系统之一，而神经网络是大脑行使功能的基础，成年人的大脑中约有111个神经元，并经115个突触相互连接而构成脑神经网络。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如:阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一，有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。
[0003]乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型脑炎病毒具有广泛的宿主范围，包括:人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够进入神经系统而引起脑炎。给人类的健康和农业生产带来了巨大损失。目前，有预防该病毒感染的疫苗，对于保障人类的健康和提高农业生产的效率发挥了重要作用。但是，目前还没有有效的药物来特异的治疗该病毒感染引起的疾病。另外，乙型脑炎病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。
[0004]随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了具有表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、抗原表位分析、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一种携带绿色突光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein,EGFP)基因的乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO:22所示。
[0006]本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。
[0007]本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
[0008]为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下:
[0010](I)拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列；
[0011]①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA:以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。
[0012]F1、F2、F3 和 F4 片段的序列分别为 SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4 所示。
[0013]②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接:用SalI和KpnI酶切P丽118，采用胶回收的方法回收PMW118的大片段,采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将Fl和F2片段插入到pMWl 18，将重组产物转化感受态HBlOl，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2 ;然后使用NaeI和KpnI酶切PJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收PJEVF1-F2的大片段，使用浓度为I % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到PJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆PJEVFL ；
[0014](2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；
[0015]①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NSl基因之间:合成序列SEQ ID勵:14，并将该片断连接进入？此57。以pEGFP-Cl质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ IDNO: 19所示。
[0016]使用SacI酶切pJEVFL,然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。
[0017]携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的应用，包括以下应用:
[0018](I)携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆(本发明或称pJEVFL-EGFP)制备病毒的能力:
[0019]用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，回收被酶切的产物，使用MEGAscriptT7Transcript1n Kit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP成为RNA，并转染BHK21细胞，37°C ,5% (v/v) CO2培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。本发明的全长感染性克隆成功制备表达EGFP的重组JEV (本发明或称JEV-EGFP)。
[0020](2) JEV-EGFP在研究脑神经环路平台中的应用:
[0021]取0.3μ1 JEV-EGFP病毒定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用
0.9% (V/V)生理盐水灌流，然后用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4% (V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然后置于30% (V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻Ih后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。
[0022]所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。
[0023](3) JEV-EGFP在分析抗原表位和抗乙型脑炎病毒药物(抗体药)筛选中的应用:
[0024]在6孔细胞培养板中接种8Χ 105ΒΗΚ21细胞/孔，在37°C，5% (v/v) CO2培养条件下，汇合度达到90%时。将50 μ I pJEVFL-EGFP PO代病毒液与50 μ I乙型脑炎病毒的抗体混合，37°C吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37°C ,5% (v/v) CO2的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。
[0025]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0026]1.本发明制备了表达EGFP的乙型脑炎病毒(JEV-EGFP)，其具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有用于表达绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒，本发明填补了该空白。
[0027]2.本发明对于开展JEV的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；
[0028]3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。JEV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图。
[0030]图2为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。
[0031]A:未感染病毒的细胞；
[0032]B JEV-EGFP感染BHK21细胞产生的细胞病变；
[0033]C JEV-EGFP感染BHK21细胞表达荧光蛋白。
[0034]图3为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒解析鼠脑神经环路的示意图。
[0035]A: JEV-EGFP 标记鼠嗅球；
[0036]B JEV-EGFP标记鼠梨状皮层；
[0037]C JEV-EGFP标记鼠前嗅核。
[0038]图4为一种携带EGFP基因的JEV用于抗原表位分析和抑制乙型脑炎病毒的抗体药的作用示意图。
[0039]A:不含抗体而含有JEV-EGFP的对照孔；
[0040]B:1:10稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；
[0041 ] C:1:100稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；
[0042]C:不含抗体和病毒的对照孔。
【具体实施方式】
[0043]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术
[0044]实施例1:携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下:
[0045](I)拼接JEV全长基因组序列；
[0046]①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA:以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。片段的序列为 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID N0:4 所示。为了大量富集目标片段用于后续的基因组组装，分别采用PCR的方法富集片段EQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4。DNA片段Fl 的引物:SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，DNA 片段F2的引物:SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:8，DNA 片段 F3 的引物:SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10，DNA 片段 F4 的引物:SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12，另外 SEQ ID NO: 5 含有 T7RNA 聚合酶启动子序列SEQ ID NO: 13 ；
[0047]本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR的反应体系均为 50 μ 1:5XQ5React1n Buffer:10 μ I, 1mM dNTPs:1 μ 1,10 μ M ForwardPrimer:2.5 μ 1,10 μ M Reverse Primer:2.5 μ I,Template DNA:0.5 μ I,Q5High-FideIityDNA Polymerase:0.5 μ I, Nuclease-Free Water:33 μ I。扩增条件为:98°C 30s,98°C 5s,55°C 10s,72°C 40s, 72°C 2min,4°C 10min，30 个循环；
[0048]②JEV基因组四个片段的拼接:采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组的方法，将扩增的四个片段连接到低拷贝载体P丽118。用SalI和KpnI酶切p丽118，采用胶回收的方法回收P丽118的大片段，使用浓度为1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，米用Gibson Assembly Cloning Kit将Fl和F2片段插入到pMWl 18,将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2；
[0049]然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVFl_F2，采用胶回收的方法回收pJEVFl_F2的大片段，使用浓度为1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,采用Gibson Assembly CloningKit将F3和F4片段插入到PJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2-F3-F4，即为JEV病毒的全长感染性克隆PJEVFL ；
[0050]鉴定PJEVF1-F2所用的引物为片段Fl的引物为SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO:6 ；
[0051]鉴定PJEVF1-F2-F3-F4所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID N0:9和SEQ IDNO:10 ；
[0052](2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；
[0053]①将EGFP基因插入到JEV的E基因和NSl基因之间:为了便于后续克隆的构建和避免病毒内部发生同源重组，采用基因片段合成的方法合成序列SEQ ID N0:14，并将该片断连接进入 PUC57。使用 NEB Q5High-Fidelity DNA Polymerase 扩增 SEQ ID NO: 14。DNA片段 SEQ ID N0:14的引物:SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16。SEQ ID NO: 14 含有合成的 E基因的C端部分序列SEQ ID NO: 17，合成的NSl基因的N端部分序列SEQ ID NO: 18。
[0054]另外，以pEGFP-Cl质粒为模板，扩增EGFP片段SEQ ID NO: 19。扩增DNA片段SEQID NO: 19的引物:SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21。使用浓度为1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收DNA片断,使用Thermo ScientificNanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用浓度为I % (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用；
[0055]PCR 的反应体系均为 50μ 1:5XQ5React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ I,10 μ M Forward Primer:2.5 μ 1,10 μ M Reverse Primer:2.5 μ I, Template DNA:0.5 μ I,Q5High-Fidelity DNA Polymerase:0.5μ I, Nuclease-Free Water:33 μ L.扩增条件为:98°C 30s, 98°C 5s, 55°C 10s,72°C 40s, 72°C 2min,4°C 10min，30 个循环；
[0056]使用SacI 酶切 pJEVFL,然后米用 Gibson Assembly Cloning Kit 将 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。
[0057]实施例2:pJEVFL-EGFP成功制备出表达EGFP的JEV，其步骤是:
[0058]用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，使用浓度为I % (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收被酶切的产物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用浓度为1% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用；使用MEGAscript T7Transcript1n Kit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP,成为RNA，并转染BHK21细胞，37°C，5% (v/v) CO2培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过倒置荧光显微镜(Olympus)观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达。
[0059]未转染pJEVFL-EGFP RNA的细胞，无细胞病变发生(图2A)，在明场下观察转染pJEVFL-EGFP RNA的BHK21细胞，可见明显的细胞病变(图2B)，表明已经产生了重组病毒；在相同的视野下，使用蓝色激发荧光，可见明显的绿色(图2C)，表明重组病毒可以表达携带的外源基因绿色荧光蛋白。以上数据表明携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒全长感染性克隆具有制备乙型脑炎病毒及表达外源基因的能力，按常规方法搜集制得的。
[0060]以下应用实施例均使用的是本实施例制备的由pJEVFL-EGFP成功制备出的表达绿色荧光蛋白的JEV (JEV-EGFP)，使用的病毒滴度为3 X 106PFU/ml。
[0061 ] 实施例3 JEV-EGFP在解析脑神经环路中的应用，其步骤是:
[0062]取0.3 μ I实施例2制备的重组JEV (JEV-EGFP)定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用0.9% (V/V)生理盐水灌流，然后用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4% (V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然后置于30% (V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻Ih后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。在重组病毒注射到嗅球的一个点之后，可见明显的荧光呈环状的标记，表明重组病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力(图3A)，进一步分析与嗅球相连接的脑区，可见在鼠脑的梨状皮层(图3B)和鼠脑的前嗅核(图3C)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力。
[0063]实施例4 JEV-EGFP在分析抗原表位和筛选抗JEV药物(抗体药)中的应用，其步骤是:
[0064]在6孔细胞培养板中接种8X 105BHK21细胞/孔，在37°C，5% (v/v) CO2培养条件下，汇合度达到90%时。将50 μ I实施例2制备的重组JEV (JEV-EGFP) PO代病毒液与50 μ IJEV的E蛋白多克隆抗体(浓度分别为1: 10和1:100稀释)混合，37°C吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37°C ,5% (v/v) CO2的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。
[0065]乙型脑炎病毒感染细胞是通过病毒表面的配体(抗原)与细胞表面的受体结合而引导病毒进入细胞，一蛋白配体与细胞表面受体类似物结合之后则无法引导病毒进入细胞，针对病毒抗原的抗体具有类似细胞表面受体的性质，病毒抗原能够通过特定的表位与抗体结合。基于此原理，该实施例将表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒分别与不同含量的抗体体外孵育，然后再感染细胞，检测其荧光的表达。在不含抗体而含有重组乙型脑炎病毒的对照孔，荧光分布于整个视野(图4A)。而当与抗体体外孵育后再感染BHK21细胞，则严重的影响了病毒进入细胞的能力(图4B和4C)，只含有抗体而未感染病毒的细胞组未见细胞病变和绿色荧光蛋白(图4D)。该实施例表明该重组病毒的配体与其对应的抗体通过特定抗原表位的结合而抑制病毒进入细胞，一方面提示该病毒能够用于分析抗原表位；另一方面提示该重组病毒能够用于筛选抗乙型脑炎病毒药物(如抗体药)。
[0066]最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ IDN0.22所示。
2.权利要求1所述的全长感染性克隆，其构建方法如下: (1)拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列； ①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA:合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57 ;F1、F2、F3和F4片段的序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQID NO: 3、SEQ ID NO:4 所示； ②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接:用SalI和KpnI酶切P丽118，采用胶回收的方法回收PMW118的大片段,采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将Fl和F2片段插入到PMWl 18，将重组产物转化感受态HBlOl，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2 ;然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVFl_F2，采用胶回收的方法回收PJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到pJEVFl_F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆pJEVFL ； (2)构建携带EGFP基因的JEV全长感染性克隆； ①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NSl基因之间:合成序列SEQ IDN0:14，并将该片断连接进入pUC57;以pEGFP-Cl质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ IDNO: 19所示； 使用SacI酶切pJEVFL,然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101, PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。
3.权利要求1所述的全长感染性克隆制备出的重组病毒。
4.权利要求1所述的全长感染性克隆在制备携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒中的应用。
5.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究脑神经环路平台中的应用。
6.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备抗乙型脑炎病毒药物中的应用。
7.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究乙型脑炎病毒抗原表位中的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104357459SQ201410618042
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】贾凡, 朱续涛, 徐富强 申请人:中国科学院武汉物理与数学研究所