专利名称：：一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法。
背景技术：
：脑心肌炎是猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病，由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus，EMCV)引起。EMCV的宿主范围很广，在多种啮齿类动物、野生动物和灵长类动物均有发现，人也可感染，但大多数不出现任何症状。猪是感染EMCV最广泛、最严重的动物，除能引起仔猪致死性心肌炎和脑炎外，还能引起母猪繁殖障碍。目前国内对猪脑心肌炎尚无有效的治疗药物和疫苗，主要靠综合性防制措施加以预防。由于EMCV在猪和人之间有密切联系，病毒在猪体内可引起持续感染，而猪的组织器官又是人体组织器官移植的重要来源，因此对该病毒的研究越来越受到关注。EMCV属微RNA病毒科心肌病毒属成员，其基因组为单股正链RNA,在复制过程中不形成DNA中间体，而大多数基因工程操作技术都是在DNA分子水平上进行操作，对EMCV的分子病毒学研究因此受到限制。随着RNA病毒全长感染性cDNA克隆技术的建立，研究者可以有效利用病毒的全长cDNA为模板，体外转录出感染性RNA,以拯救RNA病毒。感染性克隆就是指在细菌质粒中含有病毒全基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。感染性克隆提供的全长cDNA模板具有基因型稳定、易操作的特点，使在基因组水平上研究RNA病毒的单个基因和点突变成为可能，在研究病毒致病力、病毒各蛋白的功能和病毒复制，甚至在阐明病毒致病机理以及疫苗研制等方面都是十分有用的工具。
发明内容本发明的目的是提供一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法，为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制等提供有效的工具。本发明构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，包括以下步骤(1)改造低拷贝质粒载体，使其只含有构建感染性克隆所需的酶切位点；(2)提取脑心肌炎病毒的总RNA;(3)用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA，获得的三个片段的cDNA两端分别含有不同的酶切位点；(4)将三个片段的cDNA分别建立亚克隆；(5)用双酶切的方法将三个片段的cDNA依次定向克隆至改造的低拷贝质粒载体中，得到含有脑心肌炎病毒全长cDNA的脑心肌炎病毒感染性克隆。其中，用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA时，在脑心肌炎病毒的5'端非翻译区前加入T7RNA聚合酶启动子核心序列，亦能够通过定点突变形成新的酶切位点，作为感染性克隆的遗传标记，以利于其鉴定。本发明构建脑心肌炎病毒的方法分三个片段扩增病毒的cDNA，所扩增的片段相对较短，能够更好地保证所扩增片段序列的保真性，同时也降低了长片段扩增的操作难度；釆用双酶切定向克隆，使连接的效率和准确性大大提高；在5'非翻译区前加入的T7RNA聚合酶启动子核心序列能够保证感染性克隆在体外转录时产生高丰度高质量的mRNA，大大提高了转染的成功率。因此用本发明方法所构建的脑心肌炎病毒感染性克隆非常稳定，由该感染性克隆拯救出的脑心肌炎病毒具有侵染性，且拯救病毒的生长特性和在模式动物上的致病性与其亲本病毒具有较高的一致性。本发明方法操作难度较小，可控性较强，所获得的稳定的脑心肌炎病毒感染性克隆使在病毒基因组上进行分子生物学操作变得简单易行，从而使在感染性克隆基础上以突变、置换、插入、缺失等手段对脑心肌炎病毒进行基因功能研究成为可能，同时为新型病毒活载体疫苗的研制提供了必要的平台。图1感染性克隆pWSKBJC3/w全长质粒的构建方案和简略步骤图2BJC3三个片段A、B、C的RT-PCR扩增产物图3rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞上产生的细胞病变图4rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定图5rVBJC3W感染BHK-21细胞的间接免疫荧光检测结果图6rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞中的生长动力学曲线图7rVBJC3W和BJC3的小鼠存活曲线图中1、rVBJC3WRT-PCR产物；2、BJC3RT-PCR产物；3、rVBJC3WRT-PCR后五coRI酶切产物；4、BJC3RT-PCR后五coRI酶切产物；5、RNA对照；6、水对照具体实施例方式以下实施例以猪脑心肌炎病毒BJC3为例说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l低拷贝质粒载体的改造根据低拷贝质粒载体pWSK29的全序列和QuikChangeMultiSite-directedMutagenesisKit(Stratagene,丹麦)的使用说明书，设计1对回文引物Spe-Upper和Spe-Lower突变掉3536位的SpeI位点，设计1对回文引物BssH-Upper和BssH-Lower突变掉5124位的II位点。根据PRRSVNsp2基因的一段无义序列设计引物，在上游引物pNSP2-F的5，端依次加上BMHlI和C7aI两个酶切位点，在下游引物pNSP2-R的5，端依次加上&sHII和5^/zI两个酶切位点，用PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，大连)扩增此片段后以^^/n单酶切，同时将突变后pWSK29载体以&sHlI单酶切，并将酶切产物去磷酸化，然后用T4连接酶(Promega,美国)将上述扩增片段和突变后的pWSK29载体的酶切产物在22"C循环水浴中连接3h，转化大肠杆菌DH5a细胞，用WizardPlusSVMidiprepsDNAPurificationSystem(Promega，美国)提取质粒，以&5HII单酶切鉴定。改造后的载体去掉了原有的多克隆位点，只含有构建感染性克隆所需要的C/aI、￡coRI和5^/zI位点，将该改造后的载体命名为pWSK29m/A。突变及载体改造所用引物的具体序列如表l所示。表l载体突变及改造所用引物引物名称引物用途pNSP2-FPRRSV无义序列pNSP2-R扩增Spe-Upper3536A—TSpe-LowerBssH-Upper5124G—CBssH-Lower引物序列(5'-3')TTGGCGCGCCAACC47GGCTCTGGTGCGACTACTATCAACTCAAAGGAAAAGGIC7^GrAATTATCATTGACGTCAATGATAATTACTAGACCTTTTCCTTTGAGTTGGTGGTGTTCGGGCGGT￡CGCGCAAGATCCATTATGCATAATGGATCTTGCGCGGACCGCCCGAACACCAC注XXXX为限制性内切酶识别序列;XXXX为突变位点实施例2脑心肌炎病毒总RNA的提取取猪脑心肌炎病毒BJC3的F8代细胞培养病毒，利用QIAampViralRNAMiniKit(Qiagen,德国)，按照试剂盒说明书中的具体步骤提取BJC3病毒的总RNA。获得的RNA以20(iLRNase-freewater(AmbionInc.,美国)溶解，于-70。C冻存。实施例3RT-PCR方法分段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA根据猪脑心肌炎病毒BJC3的全基因组序列(GenBank号DQ464062),设计覆盖病毒全基因组的3对引物，引物序列及其在BJC3基因组中的位置如表2所示在全长扩增的上游引物T7-SegA-F中加入T7RNA聚合酶启动子核心序列，以保证在体外转录时产生高丰度高质量的RNA;T7-SegA-F和ClaI-SegB醒F中加入了C/aI酶切位点;SegC-R中加入I和SamHI两个酶切位点；在引物SegB-R和SegC-F中引入点突变，扩增后将基因组第6262位的T突变为A,突变后密码子CGA与突变前密码子CGT均编码精氨酸，为同义突变，获得的序列GAATTC为限制性内切酶五coRl的识别序列，能够用于感染性克隆的构建，也能够作为感染性克隆的遗传标记，用引物五RI-F和(引物序列见表2)可以扩增该遗传标记所在片段。由上海英俊生物技术有限公司合成引物，用无核酸酶的水配成使用浓度。表2BJC3基因组全长cDNA的扩增和鉴定用引物引物名称引物位置引物序列(5'-3')T7-SegA-F卜19SegA-R2938-2963ClaI-SegB-F2278-2300SegB-R6259-6282SegC-F6256-6275SegC-RPoly(A)五coRl-F5924-59457041-7062CC^rCG」7lGGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAAAGCCGGGGGTGGGAAGGGGGAGAAGAGGCAGAAGGAATAACCdrCGJ7GGCAAGTTCCTCATTGCCTACACCCGTTTTACGTGGTACGTGJJrrCGGGCCCCGA4rrCACGTACCAC(6262T—A)ACATlGC^rGC|ATGTCGC|GG^rCC|GCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTACTTCCTACTGGTGCCGTGGGTTGAAATGGCTAATGACT注IXXXX|为限制性内切酶识别序列;XXXX为T7RNA聚合酶启动子核心序列以病毒总RNA为模板，应用反转录酶SuperscriptTMm(Invitrogen,美国)反转录得到高丰度的cDNA。参照产品说明书构建20jaL反应体系，在其中分别加入用以扩增三个片段的下游引物SegA-R、SegB画R和SegC-R(50)iM)各ljiL，此处所加SegC-R为01igo(dT;h8。将反应体系置于65。C水洛5min后迅速转入冰洛2min。瞬时离心混匀后置于30。C水浴10min，在相应反转录温度下(SegA-R、SegB-R为特异性引物，反转录温度为55。C;而SegC-R为01igo(dT;h8，反转录温度为50。C)反转录2h后置于7(TC水浴中10min终止反应，获得A、B、C三个片段的cDNA。以上述cDNA为模板，分别以SegA-F、SegA-R,SegB-F、SegB-R,SegC-F、SegC-R为引物，使用高保真酶/^W/raIIFusionHSDNAPolymerase(Stratagene,丹麦)对上述A、B、C三个片段的cDNA进行PCR扩增。按照产品说明书构建50pL反应体系，三个片段的扩增条件分别为片段A:95°C20s,61°C20s,72°Clmin30s;片段B:95°C20s,58。C20s,72°C2min;片段C:95。C20s，50。C20s，72°C45s。PCR扩增产物经0.8。/。琼脂糖凝胶电泳检查后进行回收纯化，获得上述三个片段的DNASegA、SegB、SegC。用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分析，扩增条带大小与理论值(三个片段的理论值分别为2957bp、4005bp和1497bp)—致，且具有较高的特异性和产率，结果如图2所示。在上述三个DNA片段的两端分别含有不同的酶切位点，用于感染性克隆全长的构建SegA的两端分别含有C/al和S;eI两个酶切位点，SegB的两端含有C7al、&eI和五coRI酶切位点，SegC的两端含有EcoRI、S"wHI和S//zI酶切位点。上述酶切位点在BJC3病毒基因组中的位置及其在构建感染性克隆的应用如图l所示。实施例4构建感染性克隆如图1所示，将811^8^^1@11SK+质粒载体与实施例3所得的SegA用C/"I和&el进行双酶切后，连接并转化至DH5a,酶切鉴定阳性克隆，获得含有A片段的亚克隆质粒pBLSegA;将？8111"(^{@11SK+质粒载体与实施例3所得的SegB用C/"I和&oRI进行双酶切后，连接并转化至DH5a,酶切鉴定阳性克隆，获得含有B片段的亚克隆质粒pBLSegB;将pWSK29m/A质粒载体与实施例3所得的SegC用五coRI和^/zI双酶切后，连接并转化至DH5a，酶切鉴定阳性克隆，获得含有C片段的亚克隆质粒pWSKBJC3SegC。以C/aI和EcoRI双酶切质粒pBLSegB,将酶切回收后的B片段与C7al和&oRl双酶切后的pWSKBJC3SegC载体相连接，构建中间质粒pWSKBJC3SegBC;最后以C/aI和SpeI双酶切质粒pBLSegA,将酶切回收后的A片段与C7aI和S;eI双酶切后的pWSKBJC3SegBC载体相连接，完成感染性克隆BJC3cDNA全长质粒pWSKBJC3/w的构建。所有中间质粒和全长质粒的提取均使用WizardPlusMidiprepsDNAPurificationSystem(Promega，美国)，获得的重组质粒经PCR和酶切鉴定后用紫外分光光度计测定浓度，于-2(TC保存。感染性克隆全长质粒pWSKBJC3/w的测序由上海英俊生物技术有限公司完成，结果显示获得的BJC3感染性克隆中病毒的cDNA全长为7736nt(不含poly(A)),5'非翻译区(5'NCR)的poly(C)可读长度为15nt，基因组3，末端非翻译区(3'NCR)的poly(A)为79个腺嘌呤。将全长质粒的测序结果与BJC3全基因组序列进行序列比对(表3)发现，感染性克隆中病毒cDNA全长除五coRl遗传标记外共有3个随机分部的点突变，其中1个位于5'非翻译区，另夕卜2个位于编码区。表3感染性克隆中病毒全长cDNA与BJC3基因组序列比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注核苷酸位置*指在EMCVBJC3序列中的位置(GenBank收录号DQ464062),实施例5用感染性克隆pWSKBJC3/w拯救病毒取实施例3所得的感染性克隆pWSKBJC3/w全长质粒10(ig，用S函HI线化，并釆用MEGAscriptT7Kit(AmbionInc.,美国)进行体外转录。根据产品说明书构建20iaL反应体系，37。C水洛中转录3h后加入l(iLTURBODNaseI(AmbionInc.,美国)，37。C孵育15min消化模板质粒DNA。获得的RNA经紫外分光光度计测定浓度，总量大约为40昭。待96孔细胞板(GIBCO，Invitrogen,美国)中的BHK-21细胞形成80%左右的细胞单层后小心吸出细胞上清，每孔加入2mL平衡至室温的Opti-MEM②1ReducedSerumMedium(Invitrogene，美国)洗涤l至2次。将lmLOpti-MEMIReducedSerumMedium与10|iLDMRIE-C脂质体(Invitrogene,美国)涡旋混匀，再加入5吗上述体外转录获得的RNA，轻柔混匀后立即转入细胞单层，同时设Opti-MEN^IReducedSerumMedium和DMRIE-C脂质体对照。C02培养箱37。C培养4h后，小心吸出转染液，加入2mL2。/。DMEM维持液继续培养，每隔一段时间观察细胞病变。结果发现，转染后20h可以观察到明显的细胞病变，与猪脑心肌炎病毒BJC3感染所导致的病变形态相同(见图3)，将转染后产生的拯救病毒命名为rVBJC3W。取lmL拯救病毒的细胞上清接种细胞瓶中的BHK-21细胞，连续传代扩大培养。实施例6拯救病毒rVBJC3W的酶切鉴定及全基因组测序将拯救病毒rVBJC3W与亲本病毒BJC3的细胞培养上清反复冻融3次后提取RNA，以五coRI-F/五coRI-R为引物(表2)利用RT-PCR方法扩增病毒基因组59247062区域，扩增同时设RNA对照(不加酶)和水对照(不加模板RNA),以排除提取的RNA和扩增系统中混有全长质粒的可能性。取拯救病毒与亲本病毒的RT-PCR产物各20pL进行五coRl单酶切，37。C水浴lh。用0.8。/。琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物及酶切产物进行分析。拯救病毒的RT-PCR产物酶切后产生2个片段分别为338bp和801bp，而BJC3的扩增产物五coRI不能切开，仅得到唯一条带，对照均没有特异性条带出现(见图4),表明拯救病毒含有感染性克隆携带的第6262位点突变形成的EcoRI酶切位点。利用RT-PCR方法分段扩增拯救病毒的全长cDNA，由上海英俊生物技术有限公司完成测序工作。将测序结果拼接获得拯救病毒10rVBJC3W的全基因组序列，结果证实拯救病毒的全基因组序列与构建的感染性克隆中病毒的全长cDNA—致。实施例7拯救病毒rVBJC3W的间接免疫荧光检测待96孔细胞培养板(GIBCO，Invitrogen,美国)中的BHK陽21细胞长成良好的细胞单层后，每孔接种第4代拯救病毒100pL,同时设阴性对照，于37。C吸附lh后，加入100iaL含2。/。新生小牛血清的lxDMEM营养液继续培养。接种10h后轻轻甩去上层液体，用-20。C预冷的丙酮室温固定15min，PBS洗涤3次。每孔加入100iiL1:100稀释的脑心肌炎病毒VPl单克隆抗体Cll，37。C湿盒作用lh;PBS漂洗3次，每次5min;每孔加入50(iL1:100稀释的含0.01%伊文斯兰的荧光标记(FITC)羊抗鼠IgG，37。C恒温箱中避光作用45min;PBS漂洗3次，每次5min;自然晾干后加入PBS缓冲甘油(0.01MpH7.4PBS:甘油=1:9)封片，于荧光显微镜下观察结果并照相。间接免疫荧光照片显示，第4代拯救病毒rVBJC3W接种BHK-21单层细胞10h后，细胞浆内即出现可见的特异性荧光，对照细胞则未见荧光(见图5)。实施例8拯救病毒TCID5。的测定及一步生长曲线的绘制待96孔细胞培养板(GIBCO,Invitrogen,美国)中的BHK誦21细胞长成良好的细胞单层后，将拯救病毒rVBJC3W以维持液进行10倍梯度稀释，取10-410-8稀释度的病毒液进行接种；每个稀释度平行接种4孔BHK-21细胞，每孔100)iL。37。C吸附lh后小心吸弃上清，加入10(^L维持液继续培养。20h后观察细胞病变并记录各个梯度出现细胞病变的孔数，根据Reed-Mtiench法计算TCID5。，结果为10々mL，与亲本病毒BJC3的TCID5o没有明显差异。第4代拯救病毒rVBJC3W和第8代亲本病毒BJC3均以IOOTCID50的病毒量接种BHK-21单层细胞，接种后每间隔4h吸取细胞上清，直至接种后36h。按照上述方法测定每个时间点所取细胞上清的病毒滴度，绘制病毒在BHK-21细胞上的一步增殖曲线。两种病毒的生长动力学曲线(见图6)显示拯救病毒与亲本病毒在BHK-21细胞上的增殖动态相似，无统计学差异。实施例9拯救病毒的小鼠攻毒试验取30只6周龄的雄性BALB/c小鼠，随机分为3组，每组10只。其中2组作为攻毒组，分别注射BJC3野生病毒和拯救病毒rVBJC3W,每只小鼠腹腔注射0.2mL病毒液，攻毒剂量为2xl(^TCID5o/mL。另外一组作为对照，腹腔注射0.2mL细胞维持液。攻毒后观察14天，并绘制存活曲线。结果发现两种病毒的攻毒小鼠均在攻毒后35天出现明显的临床症状，主要表现为被毛粗乱、精神沉郁、反应迟钝、蜷缩、流泪、呼吸急促，并表现出明显的神经症状，如震颤、后肢麻痹、转圈、侧颈和四肢呈划水状等。死亡小鼠剖检后发现内脏色泽暗淡，淤血，个别小鼠出现大脑软化。对照小鼠表现正常。拯救病毒rVBJC3W与BJC3野生病毒的小鼠存活曲线(见图7)显示两种病毒均对小鼠具有较强毒力，致病性相似，无统计学差异。<110〉中国农业大学<120>—种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法<130〉KHP08113029.4<160〉14<170>Patent工nversion3.5〈210>1<211〉40<212〉DNA<213>人工序列<400>1ttggcgcgccasccatcgstggctctggtgcgectactat40<210〉2<211〉44<212〉DNA<213>人工序列<彻〉2ttggcgcgccsascatgcstgcstgtctcctcc3tctggtcttt44<210>3<211>36<212>DNZV〈213>人工序列<400>3caactcaaaggaaasggtctagtssttatcattgac36<210>4<211>36<212>DNA<213〉人工序列<400>4gtc3atg3t33tt3ct3g3ccttttcctttgsgttg36<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>5.gtggtgttcgggcggtccgcgcaagatccsttatg35<210>6<211>35<212>DNA<213〉人工序列<400>6cataatggatcttgcgcggaccgcccgascaccac35<210〉7<211〉49<212>DNA<213〉人工序列<400〉7ccatcg己tggtaatacgactcsctatagggttgaaagccgggggtggga49<210〉8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8<210>9<211>33<212〉DNA<213>人工序列<400>9Ccatcg3tggcssgttcctcsttgcctscsccc33<210>10<211>24<212>DMA<213>人工序列<400〉10gttttacgtggtacgtgaattcgg24<210>11<211>20<212〉DNA<213>人工序列<400〉11gccccgaattcscgtaccac20〈210〉12<211〉44<212>DNA<213>人工序列<400>12acatgcatgcatgtcgcggatccgcgtttttttttttttttttt44<210>13<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400>13gatgtacttcctactggtgccg22<210〉14<211>22<212〉DNA<213>人工序列<400〉14tgggttgaaatggctaatgact2权利要求1、一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，其包括步骤(1)改造低拷贝质粒载体，使其只含有构建感染性克隆所需的酶切位点；(2)提取脑心肌炎病毒的总RNA；(3)用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA，获得的三个片段的cDNA两端分别含有不同的酶切位点；(4)将三个片段的cDNA分别建立亚克隆；(5)用双酶切的方法将三个片段的cDNA依次定向克隆至改造的低拷贝质粒载体中，得到含有脑心肌炎病毒全长cDNA的脑心肌炎病毒感染性克隆。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA时，在脑心肌炎病毒的5'端非翻译区前加入T7RNA聚合酶启动子核心序列。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA时，通过定点突变形成新的酶切位点，作为感染性克隆的遗传标记。4、如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的脑心肌炎病毒为猪脑心肌炎病毒BJC3。5、如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的低拷贝质粒载体为pWSK29质粒载体。6、根据权利要求1-5任一项所述的方法构建的脑心肌炎病毒感染性克隆。7、如权利要求6所述的脑心肌炎病毒感染性克隆，其特征在于，所述的脑心肌炎病毒为猪脑心肌炎病毒BJC3。全文摘要本发明涉及一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，该方法包括以下步骤提取脑心肌炎病毒总RNA；RT-PCR方法分段扩增其全长cDNA，并分别建立亚克隆；用双酶切的方法将各段cDNA依次定向克隆至低拷贝质粒载体中，即得脑心肌炎病毒感染性克隆。本发明方法的操作难度较小，可控性强，能够获得稳定的脑心肌炎病毒感染性克隆，因而，为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制提供了有效的工具。文档编号C12N15/40GK101386860SQ20081022531公开日2009年3月18日申请日期2008年10月29日优先权日2008年10月29日发明者张国庆,书朱,杨汉春,盖新娜,鑫郭申请人:中国农业大学