亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法

专利名称：亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种口蹄疫病毒感染性cDNA及其制备方法，特别是亚洲一型口蹄疫病毒ZB/CHA/58(att)感染性cDNA的构建方法。属于生物技术领域。

背景技术：
建立感染性cDNA技术已成为现代病毒学研究中最重要的工具之一，研究者可以有效利用病毒的全长cDNA为模板，体外转录出感染性RNA，以恢复RNA病毒。该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子，因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造，然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果，从而达到对病毒基因组表达调控机制，病毒致病的分子机理等进行研究的目的。另外，从cDNA得到的感染性转录本，也将为研究病毒适应细胞及其致弱的分子基础提供帮助，借此可以得到减毒毒株，制造有效的减毒疫苗而没有毒力返祖变强的危险，开发新型的减毒疫苗。
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起，侵袭猪、牛、羊等偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。国际兽疫局将口蹄疫列为A类动物疫病。联合国粮农组织跨国动物疫病紧急预防系统计划(EMPRES)规定为世界性的主要动物传染病。我国规定为一类重大动物疫病，对畜牧业生产和人类健康危害严重，属于必须根除和消灭的重大疫病。口蹄疫控制、消灭、根除技术成为兽医研究的关键技术。口蹄疫目前有7个血清型，即A、O、C、Asia-1、SAT1、SAT2、SAT3型，不同血清型间没有交叉免疫。
口蹄疫病毒属小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，其基因组为一约含8500个核苷酸的单股正链RNA分子，基因组RNA的5’端连接一个病毒编码小蛋白3B(VPg)，离5’末端400-500个核苷酸处是一个长约100-200个核苷酸的富含胞嘧啶核苷Poly(C)区，Poly(C)区后还有一个800个核苷酸左右的非编码区，往后是一个长达6500个核苷酸的编码区，3’端有一个短的非编码区并带有一个Poly(A)尾巴。FMDV病毒基因组包含一个编码多蛋白的长的开放阅读片段，编码几种前体蛋白和总共9种成熟的非结构蛋白的前体蛋白。FMDV基因组的复制，是先以+ssRNA为模板，复制出-ssRNA，再以新合成的-ssRNA为模板合成子代+ssRNA，最后由+ssRNA与病毒蛋白装配成子代病毒颗粒。在FMDV基因组复制周期中，不经历DNA阶段，因此在DNA水平上对其基因组进行遗传操作尚不可能，建立感染性cDNA分子，可解决这一问题。1990年Zibert报道01株的感染性cDNA构建成功，后Rieder E(1993)等完成了A12株的感染性克隆，01K株和A12都是牛源毒株；国内刘光清(2004)等构建了来源于猪的OH/99株的感染性克隆。目前报道的口蹄疫病毒感染性cDNA分子有如下几项应用，(1)应用基因突变研究基因功能。Leippert M等在基因组的全长cDNA分子中，设计了13个点突变，分别位于RGD序列内部及其附近区段。在体外转录生成cDNA后，转染BHK-21细胞。结果发现在RGD序列内部发生点突变的cRNA转染细胞后，不能产生感染性的病毒粒子，在RGD附近区段发生突变的cRNA则能产生感染性病毒。(2)构建嵌合病毒。Sacarvalho D等构建了一种嵌合病毒，即把两个不同血清型的01株编码核衣壳蛋白的cDNA序列插入A12株的感染性cDNA分子中，构建成一种新型的杂种病毒，它能表现出原来亲本的基因型，通过不断增加核衣壳蛋白基因的长度比例，研究并分析嵌合病毒在细胞中的生长情况及其毒力的变化。(3)新型口蹄疫疫苗。Chinsangaram J等利用基因工程技术，在FMDV A12株感染性分子克隆的基础上，构建了一种缺失了前导蛋白酶编码序列的病毒，将该病毒分别作为活疫苗和化学灭活苗接种动物，并观察其效应。结果表明，作为活苗接种动物以后，动物不表现临床症状，没有散毒的危险，能刺激机体产生中和性抗体，并为动物提供部分保护。化学灭活苗接种动物也能产生高水平的中和性抗体，能保护动物免受野毒的侵袭。(4)研究病毒与宿主之间的相互作用关系。Chinsangaram J等研究表明L蛋白酶是FMDV的一个毒力因子，它通过切割eIF4G，抑制IFNα/βmRNA的翻译过程，降低IFNα/β蛋白的产量，进而导致野毒在宿主细胞内迅速增殖。以上几项研究的基础都是在病毒全长感染性cDNA分子的构建基础上实现的。目前，国内外尚未成功构建亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA分子，严重制约了对亚洲一型口蹄疫病毒的致病机理，分子免疫机制以及新型疫苗的研究等许多领域的发展。


发明内容
本发明的目的在于提供一种亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法。
本发明提供的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA分子，其特征在于该感染性cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，基因组5’非编码区具有Po1y(C)序列，3’末端具有单一的限制性内切酶位点及尾部的Poly(A)序列。
所述基因组5’非编码区的Poly(C)序列具有2～50个C，较佳为10～40个C，最佳为12～36个C。
所述基因组3’尾部的Poly(A)序列具有18～70个A，较佳为18～50个A，最佳为30～36个A。
所述感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过1～30个核苷酸，较佳不超过1～20个核苷酸，最佳不超过1～10核苷酸。
特别优先选该口蹄疫病毒感染性cDNA包含如表1所示的SEQ ID NO1所示的序列或在严谨条件与该序列杂交的序列。
本发明提供的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (1)口蹄疫病毒基因组RNA的抽提，引物设计，用逆转录PCR方法获得口蹄疫病毒基因组RNA其它部分的片段，用融合PCR方法获得基因组5，非编码区的Poly(C)序列，用3’RACE方法扩增获得基因组3’末端具有单一的限制性内切酶位点及尾部的Poly(A)序列； (2)将所扩增的PCR片段组装克隆到载体中，获得全长克隆cDNA，全长克隆cDNA可操作地与启动子连接； (3)将含有口蹄疫病毒全长克隆cDNA的质粒pZBC12线性化，利用体外转录系统转录，可得到感染性RNA。
所述口蹄疫病毒基因组RNA的抽提，采用美国QIAGEN公司生产的RNeasyMini Kit试剂盒，从亚洲一型口蹄疫病毒弱毒疫苗ZB/CHA/58(att)株(GenBank中的登陆号为DQ533483)感染的组织培养物中抽提口蹄疫病毒基因组RNA。
所述引物为 F1(Not I，T7primer，SEQ ID NO2) 5’-TAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGCGTGGAAAGGGGGCGCT AGGGTC-3’ Rc-I(SEQ ID NO3)5’-AAACTTAGGGGGGGGGG-3’ Fc-I(SEQ ID NO4)5’-CCTTTCACCCCCCCCCCC-3’ R1073(SEQ ID NO5)5’-GAAAGGCGCCGGCCTCCGGT-3’ F927(SEQ ID NO6)5’-CACTGGTGACAGGCTAAGGATG-3’ R2417(SEQ ID NO7)5’-CCGTATGTTGGTGCGTGGGTT-3’ F1567(SEQ ID NO8)5’-GGTGGTACGCGATTGATGACGA-3’ R4131(SEQ ID NO9)5’-AGCTTGTACCAGGGCTTGGC-3’ F3880(Not I，SEQ ID NO10) 5’-TAGCGGCCGCGAGAAACAGGCTCTAAAT-3’ R5450(SEQ ID NO11)5’-AGCACCATTCCCTCAAAGA-3’ F5404(Nhe I，SEQ ID NO12) 5’-TTGCTAGCGAAAGGCCAACACGAAGCAGC-3’ R6953(SEQ ID NO13)5’-GGGCATTTGCCGTACCCAGTA-3’ F6671(EcoR I，SEQ ID NO14) 5’-GAATTCATGGGGTTGATTGTTGACACCAG-3’ Pr3RaceT(Kpn.I，EcoR.V，Ssp.I，SEQ ID NO15) 5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATTTT16-3’ Pr3Race(Kpn I，EcoR V，SspI，SEQ ID NO16) 5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATT-3’。
所述逆转录PCR方法是首先采用美国普洛米格(promega)公司生产的cDNA第一链合成试剂盒(First strand cDNA synthesis kit)，利用引物R1073(SEQ ID NO5)、R2417(SEQ ID NO7)、R4131(SEQ ID NO9)、R6953(SEQ ID NO13)和Pr3RaceT(SEQ ID NO15)作为逆转录引物，以提取的FMDV RNA为模板合成cDNA第一链；然后采用美国普洛米格(promega)公司生产的pfu DNA聚合酶和dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，分别以上下游引物F1(SEQ ID NO2)-Rc-I(SEQ ID NO3)、Fc-I(SEQ ID NO4)-R1073(SEQID NO5)、F927(SEQ ID NO6)-R2417(SEQ ID NO7)、F1567(SEQ ID NO8)-R4131(SEQ ID NO9)、F3880(SEQ ID NO10)-R5450(SEQ ID NO11)、F5404(SEQ ID NO12)-R6953(SEQ ID NO13)和F6671(SEQ ID NO14)-Pr3Race(SEQ ID NO16)扩增含有FMDV全长cDNA的7个片段，并分别名命为片段PCR1，PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II(如附图1a所示)。
所述融合PCR方法是以上述逆转录PCR方法获的片段PCR1和PCR2产物混合物为模板，以上下游引物F1(SEQ ID NO2)-R1073(SEQ ID NO5)扩增得到片段PCR3(如附图1a所示)，所得片段PCR3含有12～13个C。
所述3’RACE方法是即上述逆转录PCR方法中获得片段P3-II的方法，特别的是该片段是先以引物Pr3RaceT(SEQ ID NO15)合成第-链cDNA，再以上下游引物F6671(SEQ ID NO14)-Pr3Race(SEQ ID NO16)扩增获得P3-II片段，所得P3-II片段的3’末端具有单一的限制性内切酶位点(KpnI，EcoRV，SspI，Avr II)及至少18个A。
所述逆转录PCR、融合PCR和3’RACE方法优选采用高保真的PCR方法进行，该方法是本领域熟知的，包括利用高保真pfu DNA酶等(可参见例如Joseph Sambrook等著，金冬雁等译，分子克隆实验指南，第三版，2002)。
所述片段PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II两端都有适当的限制性内切酶位点，所有这些限制性内切酶位点是通过引物引入的或利用天然的限制性内切酶位点而获得的。
所述片段克隆方法，采用美国Invitogen公司生产的PCR克隆试剂盒(pCR-Blunt II-TOPOvector)将上述的片段PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II克隆于载体中，并经过上海生生物工程技术服务有限公司测定核苷酸序列。PCR片段的克隆及测序方法是本领域熟知的。
所述的全长cDNA的连接方法，采用宝生物(大连)工程有限公司生产的各种限制性内切酶，利用上述片段PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II两端适当的限制性内切酶位点，经多步酶切、连接反应，最后所有片段组装在美国Invitogen公司生产的pFastBac Dual质粒载体中。各个片段的酶切、连接方法为本领域熟知。
所述质粒pZBC12线性化方法，是利用限制性内切酶EcoR V消化质粒，在回收片段作为体外转录模板，方法为本领域熟知。
所述体外转录方法，采用美国普洛米格(promega)公司生产的T7体外转录试剂盒(T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA)，以上述线性化的质粒pZBC12线性化产物为模板，体外合成RNA，并采用美国Invitrogen公司生产的脂质体(Lipofectamine)将体外合成的转录本RNA转染BHK-21细胞。方法为本领域熟知。
构建亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的技术关键有以下几点 1)病毒基因组在分子克隆过程中要确保其真实性； 2)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长的Poly(C)序列； 3)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长的尾巴结构，即Poly(A)序列； 4)所构建的感染性cDNA要含有强的启动子，并能使转录反应终止，在本发明中，优选的口蹄疫病毒是亚洲一型病毒。例如ZB/CHA/58(att)株。
由于通过基因工程操作技术，例如基因缺失技术和外原基因插入技术，可以从本发明感染性cDNA制备基因标记减毒疫苗，因此，本发明另一方面涉及上述感染性cDNA通过突变而衍生的口蹄疫病毒感染性cDNA。
另外，本发明感染性cDNA转化的宿主细胞，包括原核细胞如大肠杆菌细胞和真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞，尤其是哺乳动物的细胞。优选所述转化是稳定转化。
本发明提供的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA具有如下特点 1)、所选用的毒株为我国的口蹄疫弱毒疫苗株(ZB/CHA/58(att)株)，且反映了我国亚洲一型口蹄疫病毒的特点，因此本发明对我国口蹄疫的研究更具有针对性。
2)FMDV基因组中自然存在的限制性内切酶位点，不需要改变基因组的真实序列，可操作性强。
3)本发明中的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA，尤其是包含SEQ ID NO1所述的序列的5’非编码区Poly(C)序列至少有2个C；3’末端至少含有18个A，这一长度的Poly(A)结构也能够保证病毒感染性的需要。
4)该发明提供的感染性cDNA，可以为研究口蹄疫病毒提供一个有力的基因技术操作平台，可以方便人们对口蹄疫病毒基因组的操作，特别是可用于开发新型口蹄疫疫苗。



图1是本发明构建亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的技术路线示意图； 图2是正常的BHK-21细胞和用对照或从质粒pZBC12体外转录产生的RNA转染BHK-21细胞的结果； 图3是拯救病毒rZBC12/T7的直接荧光抗体检测的结果； 表1是构建的感染性cDNA的全序列SEQ ID NO1。

具体实施例方式 实施例 本发明提供的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，基因组5’非编码区具有Poly(C)序列，Poly(C)序列具有2～50个C，较佳为10～40个C，最佳为12～36个C，3’末端具有单一的限制性内切酶位点及尾部的Poly(A)序列，Poly(A)序列具有18～70个A，较佳为18～50个A，最佳为30～36个A，感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过1～30个核苷酸，较佳不超过1～20个核苷酸，最佳不超过1～10核苷酸。
本发明所构建的感染性cDNA，是将亚洲一型口蹄疫病毒基因组的全长cDNA克隆到质粒载体中，包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的Poly(C)和Poly(A)序列。在全长cDNA的5’末端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有EcoR V和Avr II单一的限制性内切酶位点以保证转录正确终止。
本发明构建的感染性cDNA通过下列方法获得 引物设计 F1(Not I，T7primer，SEQ ID NO2) 5’-TAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGCGTGGAAAGGGGGCGCTAGGGTC-3’ Rc-I(SEQ ID NO3)5’-AAACTTAGGGGGGGGGG-3’ Fc-I(SEQ ID NO4)5’-CCTTTCACCCCCCCCCCC-3’ R1073(SEQ ID NO5)5’-GAAAGGCGCCGGCCTCCGGT-3’ F927(SEQ ID NO6)5’-CACTGGTGACAGGCTAAGGATG-3’ R2417(SEQ ID NO7)5’-CCGTATGTTGGTGCGTGGGTT-3’ F1567(SEQ ID NO8)5’-GGTGGTACGCGATTGATGACGA-3’ R4131(SEQ ID NO9)5’-AGCTTGTACCAGGGCTTGGC-3’ F3880(Not I，SEQ ID NO10) 5’-TAGCGGCCGCGAGAAACAGGCTCTAAAT-3’ R5450(SEQ ID NO11)5’-AGCACCATTCCCTCAAAGA-3’ F5404(Nhe I，SEQ ID NO12) 5’-TTGCTAGCGAAAGGCCAACACGAAGCAGC-3’ R6953(SEQ ID NO13)5’-GGGCATTTGCCGTACCCAGTA-3’ F6671(EcoR I，SEQ ID NO14) 5’-GAATTCATGGGGTTGATTGTTGACACCAG-3’ Pr3RaceT(Kpn.I，EcoR V，Ssp.I，SEQ ID NO15) 5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATTTT16-3’ Pr3Race(Kpn I，EcoR V，Ssp I，SEQ ID NO16) 5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATT-3’。
经过下列步骤 1、口蹄疫病毒基因组RNA的抽提用美国QIAGEN生产的病毒小量RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)，从亚洲一型口蹄疫病毒ZB/CHA/58(att)株细胞培养物中抽提亚洲一型口蹄疫病毒基因组RNA，具体操作按试剂盒操作说明进行，提取的总RNA溶于12.5μL无核酸酶的水中待用； 2、cDNA合成应用美国普洛米格(promega)公司生产的cDNA第一链合成试剂盒(First strand cDNA synthesis kit)，利用引物R1073(SEQ IDNO5)，R2417(SEQ ID NO7)，R4131(SEQ ID NO9)，R6953(SEQ ID NO13)和Pr3RaceT(SEQ ID NO15)作为逆转录引物，以上述步骤1提取的FMDV RNA为模板合成cDNA第一链，具体是将上述步骤1提取得到的FMDV细胞毒总RNA溶解在12.5μL无核酸酶的水溶液，分别加入下游引物R1073(SEQ IDNO5)、R2417(SEQ ID NO7)、R4131(SEQ ID NO9)、R6953(SEQ ID NO13)和Pr3RaceT(SEQ ID NO15)，dNTP Mix(10mM)1μL，65℃水浴5min后，迅速转入冰浴2min，在此基础上，加入下列配制成的反转录反应液，建立20μL反转录反应体系 5×First-Strand Buffer 4μL RNaseInhibitor(40U/μL)1μL DTT(0.1M) 1μL SuperscriptTM III(200U/μL)1μL 瞬时离心混匀，30℃水浴10min，55℃水浴2h，70℃ 10min终止反应，冷却后直接PCR或-20℃保存，再以上述所加的5个不同的逆转录引物，分别分成5个反应合成cDNA第一链作为PCR反应的模板； 3、PCR反应获得各个片段采用美国普洛米格(promega)公司生产的pfu DNA聚合酶和dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，分别以不同的上下游引物扩增含有FMDV全长cDNA的7个片段，并分别名命为片段PCR1，PCR2，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II(如附图1a所示)具体的方法如下 首先按下列成分配制PCR反应液，建立50μL反应体系 10×pfu DNA buffer 5μL 2.5mM dNTPs 4μL 10μM上下游引物各 1μL pfu DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL cDNA模板5μL ddH20 至50μL 1)PCR1片段的扩增以引物R1073(SEQ ID NO5)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F1(SEQID NO2)-Rc-I(SEQ ID NO3)按下列条件94℃1min，1个循环，进行预变性；94℃30s，56℃30s，72℃45s，共28个循环；72℃7min 1个循环进行延伸；经1.5％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 2)PCR2片段的扩增以引物R1073(SEQ ID NO5)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物Fc-I(SEQ ID NO4)-R1073(SEQ ID NO5)按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 3)P1-I片段的扩增以引物R2417(SEQ ID NO7)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F927(SEQ ID NO6)-R2417(SEQ ID NO7)按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，52℃30s，72℃3min，共30个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 4)P1-II片段的扩增以引物R4131(SEQ ID NO9)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F1567(SEQ ID NO8)-R4131(SEQ ID NO9)按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，50℃30s，72℃4min，共30个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 5)P2片段的扩增以引物R5450(SEQ ID NO11)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F3880(SEQ ID NO10)-R5450(SEQ ID NO11)按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，56℃30s，72℃3min，共30个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 6)P3-I片段的扩增以引物R6953(SEQ ID NO13)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F5404(SEQ ID NO12)-R6953(SEQ ID NO13)按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，58℃30s，72℃3min，共30个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 7)P3-II片段的扩增以引物Pr3RaceT(SEQ ID NO15)逆转录的cDNA产物为PCR模板，上下游引物F6671(SEQ ID NO14)-Pr3Race(SEQ ID NO16)按下列条件94℃ 1min，1个循环进行预变性；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃3min，共30个循环；72℃ 10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 4、PCR3片段扩增应用融合PCR技术，利用上下游引物F1(SEQ ID NO2)和R1073(SEQ ID NO5)将PCR1和PCR2两段PCR产物融合扩增，得到含有T7启动子和Poly(C)结构的产物，其具体操作过程是 首先按下列组成配制PCR反应液，建立50μL反应体系 10×pfu DNA buffer 5μL 2.5mM dNTPs4μL 10μM上下游引物各 1μL pfu DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL PCR1 0.1μL PCR2 0.1μL ddH2O 至50μL 再按下列条件94℃1min，1个循环进行预变性；94℃30s，68℃2min，共28个循环；72℃10min 1个循环进行延伸；经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物； 5、利用上海生工生物工程有限公司生产的DNA快速回收试剂盒对各段PCR产物进行纯化回收，操作按说明进行，具体如下 电泳分离待回收的PCR产物，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5mL离心管中，准确称量凝胶重量，加入3倍体积的融胶液(以100μg胶加300μL溶胶液为一次标准回收反应)，50℃-60℃保温8min，其间轻摇小管几次，使胶完全溶化；全部转入离心柱，静置2min，12,000g离心30s，吸弃上清；加入500μL漂洗工作液，12,000g离心30s，吸弃上清，重复漂洗1次；吸弃完漂洗液后再离心60s，加入适量的无菌蒸馏水或TE缓冲液，12,000g离心1min，液体备用； 6、PCR片段的克隆和测序 将上述各片段克隆于载体pCR-Blunt II-TOPOvector(Invitrogen)中，挑取阳性克隆测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司测定，序列正确者备用，具体按下述方法进行 首先按下列组成配制PCR产物连接反应液，建立20μL反应体系。
5×Fast DNA ligase buffer 4μL T4 DNA Ligase 1μL pCR-Blunt I I-TOPOvector xμL 纯化的PCR产物 yμL ddH2O 至20μL 其中载体pCR-Blunt II-TOPOvector和PCR产物的量按照1∶3的摩尔比加入，混合，16℃连接10h，全量转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，在含有50ng/mL的LB培养基上涂布，37℃倒置培养14h-24h，调取单菌落进行鉴定(按照上述PCR扩增的方法鉴定)，阳性克隆小量培养，提取质粒，送上海生工生物工程有限公司测定核酸序列； 7、全长cDNA的拼接 根据各扩增片段中所含有的限制性内切酶位点，首先将含有片段P1-II的克隆质粒作为载体、片段P1-I作为外源片段，利用Sfi I和Kpn I同时酶切两者，将P1-II和P1-I连接得到片段P1(见图1所示)；再将片段PCR3连接于片段P1中，后克隆到pFastBac Dual质粒载体中(使用的酶切位点为Bgl II和Kpn I位点，其中Bgl II为载体中引入)，得到的重组质粒命名为pFB-ZB-5’LP1；将片段P3-II连接于pFastBac Dual中(使用的酶切位点为Not I和Avr II位点，其中Not I为载体中引入)，得质粒pFB-ZB-P3-II；将片段P2连接于pFB-ZB-P3-II中，得到质粒pFB-ZB-P2-P3-II；再将片段P3-I连接于pFB-ZB-P2-P3-II中，得到质粒pFB-ZB-P2/P3；最后将片段5’LP1插入pFB-ZB-P2/P3中(使用的酶切位点为Not I和Nhe I位点)，构成了含有全长cDNA的重组质粒pZBC12，具体操作见构建亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的技术路线示意图(图1a)，质粒的酶切、连接等基本分子生物学方法为本领域所熟知(详细的方法可参考可参见例如Joseph Sambrook等著，金冬雁等译，分子克隆实验指南，第三版，2002)，含有全长cDNA的重组质粒pZBC12送上海生工生物工程有限公司测定核酸序列，经测定，得到如表1所示的序列在序列的5’末端含有T7 RNA聚合酶启动子核心序列和添加的GCG(见图1b)；12个连续的poly(C)序列，是保证体外转录出的RNA具有感染性所必需；在序列的3’末端具有连续的20个poly(A)序列和含有Ssp I、EcoR V、Avr II限制性内切酶位点的序列(如表1)； 8、cDNA的体外转录 利用EcoR V或Avr II将含有全长cDNA的质粒pZBC12线性化，利用T7RNA聚合酶体外转录系统进行合成转录本RNA，具体操作如下 1)线性化反应用限制性内切酶EcoR V对全长cDNA重组质粒pZBC12进行单酶切，反应体系如下 pZBC12 30μL 10×Buffer H 5μL EcoR V(10U/μl)2μL ddH2O 至50μL 将上述反应液置于37℃水浴4h，然后用5μl 6×loading Buffer终止反应，取3μl进行电泳鉴定，剩余反应液用于片段的回收； 2)线性化片段的回收用上海生工生物工程有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收上述全长cDNA重组质粒的线性化片段，具体操作同上述的步骤5； 3)体外转录取8μl已线性化的全长cDNA，参照美国普洛米格(promega)公司的T7 RNA聚合酶体外转录系统(T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNAProduction System)试剂盒说明书进行体外转录，具体操作如下将下列反应混合物混匀后在PCR仪中37℃反应4h 已经线性化的pZBC128μL RiboMAXTM Express T7 2×Buffer10μL Enzyme Mix，T7 Express2μL dH2O 至20μL 4)体外转录本的回收纯化 I、上述体外转录完成后，在反应混合物中加入2μl RQ1 RNase-FreeDNase，37℃反应15～30min； II、在反应混合物中加入 130μl RNase-Free H2O，然后加入1体积柠檬酸饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混合均匀，12000g，4℃离心2min； III、将上清转移到新离心管中，加入1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)。振荡混合均匀，12000g，4℃离心2min； IV、将上清转移到新离心管中，加入 0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和1体积的异丙醇。混合均匀后放置于冰上5min，12000g，4℃离心10min； V、小心移除上清，用1mL 70％酒精(RNase-Free)清洗后，用真空干燥后，再用RNase-Free H2O溶解RNA，用分光光度计定量后放于-80℃保存备用； 9、RNA转染敏感细胞 将转录本RNA用脂质体Lipofectamine(美国Invitrogen生产)转染BHK-21细胞，检查其感染性；具体操作步骤如下(以6孔细胞培养板为例) 1)、接种前一天，在6孔板或35mm培养皿中，在2ml天加有血清的DMEM中接种2×105-3×105细胞，当转染的细胞生长密度达70％～80％时，进行转染； 2)、每孔使用2ml DMEM培养基清洗细胞(室温)； 3)、制备RNA-阳离子脂质体试剂复合物； 4)、在每个无菌管中加入1.0ml DEME培养基(室温)； 5)、在含有DMEM培养基的试管中分别加入0、2、4、6、8或12ulLipofectamine试剂，成分混匀； 6)、在每管中加入2.5-5.0ug RNA，稍微震荡； 7)、立刻将C中的复合物加入清洗过的细胞中； 8)、于5％CO2，37℃培养4h，然后使用完全培养基替换转染培养基。注意对不同的细胞类型，要调整细胞与结合物的接触时间以及加入RNA的量； 9)、转染16-72h后，在光学显微镜下观察细胞形态的变化。
转染结果在20h出现细胞病变，32h病变达到80％，将转染获得的病毒命名为rZBC12； 10、恢复病毒的鉴定 将恢复病毒rZBC12传代4-5代，用直接荧光抗体染色和英国比尔布赖特实验室生产的口蹄疫双抗夹心ELISA试剂盒检测(ELISA Kit for FMDVantigen detedtion，Pirbrigth，UK)鉴定rZBC12感染性； 1)直接荧光抗体染色的具体操作为于96孔细胞培养板中加入吹散的BHK-21细胞悬液，于37℃ CO2培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞。待细胞长成良好的细胞单层后，每孔接100μL第5代恢复细胞毒，同时设阴性对照，于37℃吸附1h后，加入100μL含2％新生小牛血清的1×DMEM营养液继续培养。在接种10h后，倒去上层液体，用-20℃预冷的丙酮室温固定15min，自然干燥。滴加1∶20稀释的含0.01％伊文斯兰的荧光标记(FITC)抗亚洲一型口蹄疫病毒兔IgG，37℃湿盒作用45min；PBS漂洗3次，每次5min；自然晾干后加PBS缓冲甘油(0.01M pH7.4 PBS∶甘油＝1∶9)封片，于荧光显微镜下观察结果并照相； 2)双抗夹心ELISA方法具体操作参照说明书进行 I、样品的制备及包被将上述发现病变的细胞及其培养液冻融3次后按5‰的比例加入甲醛，4℃过夜使病毒灭活。同时用0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)按1∶9比例稀释马抗FMDV血清，按每孔100μl加入ELISA板中，4℃过夜。洗涤甩掉包被液，以洗液洗板3次，沥干； II、加样取100μl上述灭活的病毒培养液加入到ELISA板中。同时设置标准阳性对照(口蹄疫病毒)、标准阴性对照(正常细胞培养液)和空白对照(PBS液)。37℃放置60min，同上洗涤3次； III、加口蹄疫标准血清用稀释液稀释口蹄疫标准血清(豚鼠抗FMDV血清)25倍，每孔100μl加入相应的孔中，37℃放置60min，同上洗涤3次； IV、加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG用稀释液稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG5000倍，每孔100μl加入ELISA板中，37℃放置60min，洗涤3次； V、显色按每10mL底物溶液含5mL H2O，3mL柠檬酸钠，2mL柠檬酸，0.05％H2O2，10mg OPD的比例每孔中加入100μl底物溶液，于室温蔽光反应15～30min后，用50μl 1.25mol/L硫酸终止反应； VI、结果判定用酶标仪在490nm读数，记录并计算P/N比值，即被检样品OD值(P)，阴性对照OD值(N)，当P/N＞2，判定为阳性，当P/N≤2，判定为阴性； 3)RT-PCR鉴定病变细胞培养液经3次冻融后，用RNeasy Mini Kit(美国QIAGEN公司)提取病毒RNA，参照步骤2、3 RT-PCR扩增P-II片段的方法进行RT-PCR鉴定，用琼脂糖凝胶电泳检测其大小； 4)电镜观察病毒粒子收集出现细胞病变的培养液上清，反复冻融3～5次，用差速离心法纯化病毒后，然后与10×稀释的亚洲一型口蹄疫病毒抗血清等量混合，37℃感作2h，3000rpm离心20min，用PBS重悬沉淀后，做常规负染色，然后于电子显微镜下观察病毒粒子，结果可以看到直径20nm-25nm的圆形病毒颗粒。
鉴定结果表明我们回收到了由感染性cDNA衍生而来的亚洲一型口蹄疫病毒。这也就证明我们成功构建了亚洲一型口蹄疫病毒的感染性cDNA。
通过对全长cDNA序列的测定，结果表明我们得到了本发明感染性cDNA的全基因序列(SEQ ID NO1)，该序列在表1中给出。
表1本发明中构建的感染性cDNA的全序列SEQ ID NO1
Sequence
1 gcggccgcta atacgactca ctataggcgt ggaaaggggg cgctagggtc tcacccctag
61 catgccaacg acagctcctg cgttgcactc cacacttacc tttgcgtacg cgcaggaacc
121 gatggacttt cgttcaccta cctacagctg gactcacggc accgcgtggc cattttagct
181 ggattgtgcg gacgaacacc acttgcgcat ttcgcgtgac cggttattac tcttaccact
241 ttccgcctac ttggtcgtca gcgctgtcct gggcacgcct gttgggggct gttcgacgct
301 ctacggtctc ccccgcgtgg cagactacgg tgttggggcc gcttcgtgcg agtcgctcgc
361 ctggtgtgct ttggttgtca cacgaagccc gcctttcacc cccccccccc acaagcacta
421 ccgtccttcc cgacgttaaa gggaggtaac cacaagcttg ataccgtctt gcccgacgtt
481 aaaggctgta accataagct tgtaccgcct ttcccggcgt taacgggatg taaccacaag
541 ataaaccttc acccggaagt aaaacggtaa cttcacatag ttttgcccgc ttttacgaga
601 aacgggacgt ctgcgcacga aacgcgccgt cgcttgagga agacttgtac aaacacgatc
661 tatgcaggtt tccacaactg acacaaatcg tgcaacttga aactccgcct ggtctttcca
721 ggtctagagg ggtgacattt tgtactgtgc tcgactccac gctcggtcca ctagcgggtg
781 ttagtaacag cactgttgct tcgtagcgga gcatggtggc cgcgggaact cctccttggt
841 aacaaggacc cacggggcca aaagccacgt cctaacggac ccaccatgtg tgcaacccca
901 gcacggcaac tttactgcga aaaccacttt aaagtgacac tgatactggt actcgaccac
961 tggtgacagg ctaaggatgc ccttcaggta ccccgaggta acatgtgaca ctcgggatct
1021 gagaagggga ctgggacttc tttaaaagtg cccggtttaa aaagcttcta tgcctgaata
1081 ggcgaccgga ggccggcgcc tttccattac ttattactgg aattatggac acaactgatt
1141 gttttatcgc tctgttacac gctctcagag agatcaaggc actgtttctt ccacgaacgc
1201 aaaggaaaat ggagctcaca ctttacaacg gtgagaagaa gattttctac tctaggccta
1261 acaaccacga caactgttgg ttgaacacca tccttcagct gtttaggtac gtcgatgaac
1321 ctttcttcga ctgggtctac gaatcgcctg agaaccttac tcttgaggcg atcagacacc
1381 tggaagggat tactggcctt gagctgcacg agggtggacc acccgccctc gtcgtttgga
1441 acatcaaaca cttgctccac actggaatcg gtactgcctc gcgacccagc gaggtgtgca
1501 tggtagatgg tacggacatg tgcttggctg acttccacgc tggcatcttc ctgaaaggac
1561 aagggcacgc tgtgtttgcc tgcgttacct ccgacgggtg gtacgcgatt gatgacgagg
1621 aattttaccc ttggacgccg gatccgtccg acgttctggt atttgttccg tacgatcaag
1681 aaccactcaa cggagaatgg aaagcaaagg ttcagaagcg gctcaaggga gccgggcaat
1741 ccagcccggc tactgggtca cagaaccaat caggcaacac tggaagcatc attaacaact
1801 actacatgca acagtaccag aactccatgg acacacaact tggtgacaat gctattagcg
1861 gaggctccaa cgagggttcc acggatacca cctccacaca cacaaacacc actcagaaca
1921 acgactggtt ttcacgcctg gccagctcgg cctttactgg tctgtttggc gctctcctgg
1981 ctgacaagaa aacggaggag gcaaccctgc ttgaggaccg catcctcacc accaggaacg
2041 gccacacgac gtcgacgaca cagtcgagcg ttggcgtgac atacggttac gctgtggccg
2101 aggatgcggt atcagggcct aacacctcag gcttggagac ccgcgtgaca caggctgaac
2161 ggtttttcaa gaaacatctg tttgattgga caccgaatct ggcgtttgga cactgctact
2221 acctggaact cccctctgaa cataagggtg tgtatggcag cctcatggaa tcatttgcgt
2281 acatgaggaa tgggtgggac attgaagtga ctgctgttgg gaaccaattc aacggcggtt
2341 gtctccttgt cgcgctcgtg ccggagctga agagccttgg cacgcggcag aaataccagt
2401 tgaccctttt cccacaccag tttataaacc cacgcaccaa catgacggcc cacattaacg
2461 tgccgttcgt gggtgtcaac aggtatgacc agtacgcgct ccacaaaccg tggacgcttg
2521 ttgtgatggt attggctcca cttaccgtca aaactggtgg ttctgagcag attaaggttt
2581 acatgaatgc atcgccaacc tacgtgcacg tggcagggga aatgccctcg aaagagggga
2641 tagtccccgt tgcgtgtgcg gacggttacg gcaacatggt gaccacagac ccgaagacgg
2701 ctgaccccgt ctacgggaag gtgttcaacc cccccagaac aaacctccct gggcgcttca
2761 caaacttcct cgacgttgcg gaggcatgcc caactttcct ccgcttcgga gatgtgccgt
2821 tcgtgaagac ggtgaactcc gctgaccgct tgcttgccaa gtttgacgtg tcgctcgctg
2881 cggggcacat gtccaacact tacttggctg gtctggcaca gtactacaca cagtacagcg
2941 gcaccatgaa tgttcatttc atgttcaccg ggcccacgga tgccaaagcc cgttacatgg
3001 tggcctacgt accccctggc atgacaccac ccacagaccc tgagcgggct gcacactgca
3061 ttcattctga gtgggatact ggtcttaact ctaaattcac cttttccata ccctacctct
3121 ctgctgctga ctatgcttac actgcttctg acgtggctga aaccacgagt gtgcagggat
3181 gggtgtgtat ctaccagatc acgcacggca aggctgaagg cgacgcactg gtcgtttccg
3241 tcagtgccgg caaggacttt gagtttcgct taccagtgga tgctcgccgg cagactacca
3301 ccaccggcga atcagcagac ccagttacca ccacagttga gaactacgga ggagagactc
3361 agacagcccg ccggctccac actgacgttg cctttgttct cgacaggttt gtgaaactca
3421 cacagctcaa gaacacccaa actcttgatc ttatgcaaat cccttcacat acgcttgttg
3481 gggcgctact tcggtctgcg acgtactact tctcagacct ggaggttgcg attgtccaca
3541 caggctcggt cacatgggtg cctaacggcg cacccaagga cgccttggac aaccacacca
3601 acccaaccgc ctaccaaaag caacccatta cccgcctggc actcccttac accgctcccc
3661 accgtgtgct tgcaacagtg tacaacggga agacaaccta cggggaagag tccacaagac
3721 gcggtgactt tgcagccctc gcgcaaaggt tgagccgccg gttgcccacc tccttcaatt
3781 acggtgctgt gaaggctgac accatcaccg agctgttgat ccgcatgaag cgcgcggaaa
3841 catactgccc caggcctttg ctggctcttg ataccaccca agaccgccgt aaacaggaga
3901 tcattgcacc cgagaaacag gctctaaatt ttgacctgct cgagctagcg ggagacgtcg
3961 agtccaaccc tgggcccttc ttcttctctg acgtcaggtc aaacttctcc aagctggtcg
4021 aaaccatcag ccagatgcag gaggacatgt caacaaaaca cggacccgac tttaaccggt
4081 tggtgtccgc gtttgaggaa ttggccactg gagtgaaggc tatcagaacc ggtctcgacg
4141 aggccaagcc ctggtacaaa cttatcaagc tcctgagccg cttgtcatgc atgaccgctg
4201 tagcagcacg gtcaaaggac ccagtccttg tggccattat gctggccgac accggtcttg
4261 agattctgga cagcactttt gtcgtgaaga agatctccga ctcgctctcc agtctctttc
4321 acgtgccggc ccccgtcttc agtttcggag ccccgatcct gttggctggg ttggtcaaaa
4381 tcgcctcgag tttcttccgg tccacgcccg aagaccttga gagagcagaa aaacagctca
4441 aagcacgtga cattaatgac atattcgcca ttcttaagaa cggtgagtgg ctggtcaagt
4501 tgattcttgc tatccgcgac tggattaagg catggatcgc ctcagaagaa aagtttgtca
4561 ccatgacaga cttggtgcct ggcatccttg aaaagcagcg ggatctcaac gaccccagca
4621 agtacgagga ggccaaggag tggctcgaca acgcgcgcca agcgtgcttg aagagtggga
4681 acgtccacat tgccaacctg tgcaaagtgg ttgccccggc acccagcaag tcgagacctg
4741 aacctgtggt cgtttgcctc cgtggtaaat ccggccaggg aaagagtttc cttgcgaacg
4801 tgctcgcaca agcaatttct tcacacttca ctggcaggat tgactcggtt tggtactgcc
4861 cgcctgaccc tgaccacttc gacggttaca atcagcagac cgttgttgtg atggacgatt
4921 tgggccagaa ccctgatggc aaggacttta agtacttcgc ccaaatggtt tcgaccacgg
4981 ggttcatccc gcccatggcc tcgcttgagg acaaaggcaa acccttcaac agcaaagtca
5041 tcattgccac caccaacctg tactcgggtt ttaccccgag aaccatggtg tgccctgatg
5101 cgctgaaccg aaggttccac tttgaccttg atgtgagtgc taaggacggg tacaaaatta
5161 acaacaaatt ggacataacc aaagctcttg aagacaccca caccaacccg gtggcaatgt
5221 ttcaatacga ctgtgccctt ctcaacggca tggccgttga aatgaagaga ttgcaacaag
5281 atatgttcaa gcctcaaccg cccctccaga acgtatatca actggttcag gaggtgattg
5341 aacgggtcga gctccacgaa aaggtgtcga gccacccgat ttttaagcag atctcaattc
5401 cttcccaaaa atctgtgctg tacttcctca ttgagaaagg ccaacacgaa gcagcaattg
5461 aattctttga gggaatggtg cacgactcca ttaaggagga gctccgtcct ctcatccaac
5521 agacctcatt tgtgaaacgc ggctttaagc gcctgaagga aaactttgag attgttgccc
5581 tgtgtttgac tcttttggca aacatagtga tcatgatccg tgggacatgc aagagacaaa
5641 acatggtgga tgatgcagtg aatgagtaca ttgagaaacc aaacatcacc acagatgaca
5701 aaactcttaa tgaagcggaa aagaaccctc tggagactag tggtgccagc actgttggtt
5761 tcagagagat aactctcccg gggcacgacg cgagtgatga cgtgaactcc gagcccgcca
5821 aacccgtgga gaaacaacca caagctgaag gaccctacgc cgggccactt gagcgtcaga
5881 aacctctgaa agtgaaagcc aagctgccac agcaggaggg accttacgct ggcccgatgg
5941 agagacagaa accgttgaga gtgaaagcaa gaaccccggt cgtcaaggaa ggaccttatg
6001 acggaccggt gaagaagcct gtcgctttga aagtgaaagc taagaacttg attgtcactg
6061 agagtggtgc cccaccgacc gacttgcaaa agatggttat gggcaacacc aaacccgttg
6121 agcttatcct cgacgggaag acggtagcca tttgctgcgc taccggagtg tttggcactg
6181 cctacctcgt gcctcgtcac ctcttcgcag agaagtacga caagatcatg ctggacggta
6241 gagctatgac agacagtgac tacagagtgt ttgagtttga gattaaagta aaaggacagg
6301 acatgctctc agatgccgcg ctcatggtgc ttcaccgtgg gaatcgcgtg agagacatca
6361 cgaaacactt tcgtgataca gcaagaatga agaaaggcac ccccgttgtc ggagtgatca
6421 acaacgccga cgtcgggaga ctgattttct ctggtgaggc cctcacctac aaggacattg
6481 tagtgtgcat ggatggagac accatgcctg gtctctttgc ctacagagcc gccaccaagg
6541 ctggttactg tggaggagct gttctcgcca aggacggagc tgacacattc atcgttggca
6601 ctcactccgc aggtggcaat ggagttggat actgctcatg tgtttccagg tccatgcttt
6661 tgaaaatgaa ggcgcatatc gaccccgaac cacaccacga ggggttgatt gttgacacca
6721 gagatgtgga agagcgtgtg catgtcatgc gcaaaactaa gcttgcaccc accgtggcac
6781 acggtgtgtt taaccctgaa tttggccctg ctgccttgtc caacaaggac ccgcggctga
6841 acgaaggtgt cgtccttgat gaagtcatct tctccaaaca caaaggggac acaaagatga
6901 ccgaggagga caaagcgctg ttccgccgct gcgctgctga ctacgcgtca cacttgcaca
6961 gcgtactggg tacggcaaat gccccactga gcatctacga ggcaatcaaa ggcgtcgacg
7021 gtcttgacgc catggaacca gatactgcac ctggtctccc ctgggccctc caggggaagc
7081 gccgcggcgc actgattgac ttcgagaacg gcacggtcgg acccgaggtc gcggctgccc
7141 tagagctcat ggagaaaaga gaatacaaat ttgcttgtca gaccttcctg aaggacgaga
7201 ttcgcccgat ggagaaagta cgtgccggta agactcgcat tgtcgacgtt ttacctgttg
7261 aacacattct ttacactagg atgatgattg gcagattttg tgctcaaatg cactcaaaca
7321 acggaccgca aattggctcg gcggtcggtt gcaaccctga tgttgattgg caaagatttg
7381 gcacacattt tgctcagtac agaaacgtgt gggatgtgga ctattcggcc tttgatgcta
7441 accactgtag tgatgcgatg aacatcatgt ttgaggaggt gttccgcacg gagtttggct
7501 tccacccgaa tgccgagtgg attctgaaga ctcttgtgaa tacggagcac gcctacgaga
7561 acaaacgcat tactgttgag ggtggaatgc catctggttg ttccgcaaca agcattatca
7621 acacaatttt gaacaacatc tacgtgctct acgccctgcg tagacactat gagggagttg
7681 agctggacac ttacaccatg atctcctacg gagacgacat cgtggtggca agtgattacg
7741 atttggactt tgaggccctc aagccacact tcaaatccct tggtcaaacc atcaccccag
7801 ctgacaaaag cgacaaaggt tttgttcttg gtcactccat taccgatgtc actttcctca
7861 aaagacactt ccacatggac tatggaactg ggttttacaa acctgtgatg gcttcgaaga
7921 ccctcgaggc tatcctctcc tttgcacgcc gtgggaccat acaggagaag ttgatctccg
7981 tggcaggact cgccgtccac tctggacctg acgagtaccg gcgtctcttc gagcccttcc
8041 agggcctctt tgagattcca agctacagat cactttacct gcgttgggtg aacgccgtgt
8101 gcggtgacgc ataatccctc agacatcaca attggcagaa agattctgag gcgagcgacg
8161 ccgtaggagt gaaaagcccg aaaaggcttc tcccacttcc tattccaaaa aaaaaaaaaa
8221 aaaaaatatt gatatcctag g
权利要求
1.一种亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA，其特征在于该感染性cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，基因组5’非编码区具有Poly(C)序列，3’末端具有单一的限制性内切酶位点及尾部的Poly(A)序列。
2.根据权利要求1所述的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA，其特征在于所述基因组5’非编码区的Poly(C)序列具有2～50个C，较佳为10～40个C，最佳为12～36个C；所述基因组3’尾部的Poly(A)序列具有18～70个A，较佳为18～50个A，最佳为30～36个A；所述感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过1～30个核苷酸，较佳不超过1～20个核苷酸，最佳不超过1～10核苷酸。
3.一种亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于包括如下步骤
(1)口蹄疫病毒基因组RNA的抽提，引物设计，用逆转录PCR方法获得口蹄疫病毒基因组RNA其它部分的片段，用融合PCR方法获得基因组5’非编码区的Poly(C)序列，用3’RACE方法扩增获得基因组3’末端具有单一的限制性内切酶位点及尾部的Poly(A)序列；
(2)将所扩增的PCR片段组装克隆到载体中，获得全长克隆cDNA，全长克隆cDNA可操作地与启动子连接；
(3)将含有口蹄疫病毒全长克隆cDNA的质粒pZBC12线性化，利用体外转录系统转录，可得到感染性RNA。
4.根据权利要求2所述的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于所述引物为
F1(Not I，T7primer，SEQ ID NO2)
5’-TAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGCGTGGAAAGGGGGCGCTAGGGTC-3’
Rc-I(SEQ ID NO3)5’-AAACTTAGGGGGGGGGG-3’
Fc-I(SEQ ID NO4)5’-CCTTTCACCCCCCCCCCC-3’
R1073(SEQ ID NO5)5’-GAAAGGCGCCGGCCTCCGGT-3’
F927(SEQ ID NO6)5’-CACTGGTGACAGGCTAAGGATG-3’
R2417(SEQ ID NO7)5’-CCGTATGTTGGTGCGTGGGTT-3’
F1567(SEQ ID NO8)5’-GGTGGTACGCGATTGATGACGA-3’
R4131(SEQ ID NO9)5’-AGCTTGTACCAGGGCTTGGC-3’
F3880(NotI，SEQ ID NO10)5’-TAGCGGCCGCGAGAAACAGGCTCTAAAT-3’
R5450(SEQ ID NO11)5’-AGCACCATTCCCTCAAAGA-3’
F5404(Nhe I，SEQ ID NO12)
5’-TTGCTAGCGAAAGGCCAACACGAAGCAGC-3’
R6953(SEQ ID NO13)5’-GGGCATTTGCCGTACCCAGTA-3’
F6671(EcoRI，SEQ ID NO14)
5’-GAATTCATGGGGTTGATTGTTGACACCAG-3’
Pr3RaceT(Kpn.I，EcoR.V，Ssp.I，SEQ ID NO15)
5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATTTT16-3’
Pr3Race(Kpn I，EcoR V，SspI，SEQ ID NO16)
5’-CTGCAGGTACCTAGGATATCAATATT-3’。
5.根据权利要求2所述的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于所述逆转录PCR方法是首先采用美国普洛米格(promega)公司生产的cDNA第一链合成试剂盒(First strand cDNA synthesis kit)，利用引物R1073(SEQ ID NO5)；R2417(SEQ ID NO7)；R4131(SEQ ID NO9)；R6953(SEQ ID NO13)and Pr3RaceT(SEQ ID NO15)作为逆转录引物，以提取的FMDV RNA为模板合成cDNA第一链，然后采用美国普洛米格(promega)公司生产的pfu DNA聚合酶和dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，分别以上下游引物F1(SEQ ID NO2)-Rc-I(SEQ ID NO3)；Fc-I(SEQ ID NO4)-R1073(SEQID NO5)；F927(SEQ ID NO6)-R2417(SEQ ID NO7)；F1567(SEQ ID NO8)-R4131(SEQ ID NO9)；F3880(SEQ ID NO10)-R5450(SEQ ID NO11)；F5404(SEQ ID NO12)-R6953(SEQ ID NO13)；F6671(SEQ ID NO14)-Pr3Race(SEQ ID NO16)扩增含有FMDV全长cDNA的7个片段，并分别名命为片段PCR1，PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II。
6.根据权利要求2所述的亚洲-型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于所述融合PCR方法是以上述逆转录PCR方法获的的片段PCR1和PCR2产物混合物为模板，以上下游引物F1(SEQ ID NO2)-R1073(SEQ IDNO5)扩增得到片段PCR3，所得片段PCR3含有连续12～13个C。
7.根据权利要求2所述的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于所述3’RACE方法是即上述逆转录PCR方法中获得片段P3-II的方法，特别的是该片段是先以引物Pr3RaceT(SEQ ID NO15)合成第一链cDNA，再以上下游引物F6671(SEQ ID NO14)-Pr3Race(SEQ ID NO16)扩增获得P3-II片段，所得P3-II片段的3’末端具有单一的限制性内切酶位点(KpnI，EcoR V，SspI，Avr II)及至少20个连续的A。
8.根据权利要求2所述的亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA的构建方法，其特征在于所述片段克隆方法，采用美国Invitogen公司生产的PCR克隆试剂盒(pCR-Blunt II-TOPO vector)将上述的片段PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II克隆于载体中，并经过上海生工生物工程技术服务有限公司测定核苷酸序列；所述的全长cDNA的连接方法，采用宝生物(大连)工程有限公司生产的各种限制性内切酶，利用上述片段PCR3，P1-I，P1-II，P2，P3-I和P3-II两端适当的限制性内切酶位点，经多步酶切、连接反应，最后所有片段组装在美国Invitogen公司生产的pFastBacDual质粒载体中。各个片段的酶切、连接方法为本领域熟知；所述质粒pZBC12线性化方法，是利用限制性内切酶EcoR V消化质粒，在回收片段作为体外转录模板，方法为本领域熟知；所述体外转录方法，采用美国普洛米格(promega)公司生产的T7体外转录试剂盒(T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA)，以上述线性化的质粒pZBC12线性化产物为模板，体外合成RNA，并采用美国Invitrogen公司生产的脂质体(Lipofectamine)将体外合成的转录本RNA转染BHK-21细胞。
全文摘要
本发明涉及一种亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法，从该感染性cDNA转录的RNA包含该感染性cDNA的宿主细胞等。主要是以亚洲一型口蹄疫病毒RNA为模板，以特异引物通过逆转录扩增基因组片段，并将扩增后的片段组装克隆到载体中，得到的cDNA的5′末端上游具有T7RNA聚合聚合酶启动子，3′末端具有单一的限制性酶切位点及尾部的Poly(A)序列，且该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过30个核苷酸。口蹄疫病毒感染性cDNA可用于研究病毒的致病机理和基因组的复制、表达调控机制等，也可通过基因操作技术用于制备标记减毒株疫苗和开发新型口蹄疫疫苗等。
文档编号C12N15/40GK101225395SQ200710066290
公开日2008年7月23日 申请日期2007年10月18日 优先权日2007年10月18日
发明者信爱国, 张念祖, 李华春, 杨永钦, 乐 李 申请人:云南省畜牧兽医科学研究所