溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNA及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA及其构建方法和应用。所述溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA可以与辅助质粒组成反向遗传操作系统。该感染性cDNA及其反向遗传操作系统可用于拯救具有溶瘤功能的新城疫病毒，本发明为研究新城疫病毒的溶瘤功能及其分子机制、开发抗肿瘤基因工程治疗等奠定了实验基础。
【专利说明】溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及单股负链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及具有溶瘤功能的新城疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用，本发明由该新城疫病毒感染性cDNA、微基因组及其辅助质粒所组成的新城疫病毒反向遗传操作系统。
【背景技术】
[0002]新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属副粘病毒科禽腿腺炎病毒属的成员，为单股负链RNA病毒，其基因组RNA全长约15kb。RNA基因组在3’末端为55个核苷酸的前导序列，5'末端为114个核苷酸的尾随序列，这两个序列对病毒的转录和复制都至关重要。病毒的六个基因RNA的顺序依次为3’ -NP-P-M-F-HN-L-5’。新城疫病毒的这六个基因编码主要的六种结构蛋白:核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、磷蛋白(Phosphateprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin Neuraminidase protein, HN)和 RNA 聚合酶(Large RNA-dependentRNA polymerase protein, L)。P基因的RNA编辑产生另外两个非结构蛋白V和W(Mebatsionet al., 2001; Steward et al.，1993)。病毒基因组RNA和NP、P、L共同形成核糖核蛋白复合体(RNP)，RNP能够作为RNA转录和复制的模板，是病毒具有功能活性的最小感染单位(Hamaguchi et a1., 1983)。
[0003]肿瘤治疗的最终目的是在对健康细胞不产生明显损伤的条件下清除癌症细胞。多种溶瘤型病毒已经被鉴定和并对其潜在的抗肿瘤功能、特异性、效果和安全性进行检测。在众多溶瘤病毒中，新城疫病毒已经被认为是有希望的溶瘤制剂被作为实验治疗应用于临床已40余年。一些临床试验表明NDV是安全有效的治疗制剂。新城疫病毒现已成为临床评估作为溶瘤、基因及免疫刺激治疗载体的五种病毒之一，极具开发价值。
[0004]反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因缺失、基因插入、基因替换和基因互补(构建嵌合病毒)等改造，以解决对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们在分子水平上研究病毒基因的功能及其具有的生物学特性的分子机制。
[0005]研究表明，新城疫病毒溶瘤株73-T可以杀死多种人癌症细胞。在裸鼠模型中，肿瘤内注射73-T能明显抑制多种异种移植的肿瘤，包括纤维肉瘤和神经胶质瘤。溶瘤型MTH-68株能明显部分或全部抑制癌细胞转移型肿瘤。一期临床试验表明，溶瘤新城疫PV701株具有广谱的抗肿瘤功能。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于提供一种具有溶瘤作用的新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNAo
[0007]所述溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA克隆与亲本新城疫D90株天然序列(SEQ ID NO:1所示)相比，缺失掉一个KpnI酶切位点，仅具有单一 KpnI酶切位点是全长感染性cDNA克隆的分子标签。
[0008]本发明的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA，其特征在于:所述的全长感染性cDNA序列为SEQ ID NO: 2所示。
[0009]本发明的目的之二在于提供一种构建所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的方法，包括:
[0010]I)以新城疫病毒D90株的RNA为模板，分11段扩增D90株基因组，进行全基因组序列测定，得到的新城疫D90株病毒的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示；
[0011]2)通过RT-PCR方法获得新城疫病毒D90株基因组各部分的4个片段，将所扩增的PCR片段采用同源重组的方法组装克隆到质粒载体中，构建带有溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA的质粒载体。
[0012]其中所述的新城疫病毒D90株(新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作用，符芳等，《中国预防兽医学报》，2007年02期)由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。
[0013]在本发明中，优选的，所述的全长感染性cDNA的序列如SEQ ID NO:2所示，与SEQID NO:1所示的亲本新城疫D90株天然序列相比,其缺失掉一个KpnI酶切位点。
[0014]在本发明中，优选的，所述的质粒载体为加入T7启动子、核酶和T7终止子的PBR322 载体。
[0015]本发明的目的之三在于提供一种溶瘤新城疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于:该溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统包括包含本发明所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的质粒载体和三个辅助质粒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pC1-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
[0016]在本发明中，优选的，所述溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID N0:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORFcDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORFcDNA 如 SEQ ID NO:5 所示。
[0017]本发明的目的之四在于提供所述全长感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的应用，其包括将所述的全长感染性cDNA和三个辅助质粒共转染哺乳动物细胞，拯救得到新城疫病毒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pC1-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
[0018]在本发明中，优选的，溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORFcDNA如SEQ ID NO: 3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID N0:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如 SEQ ID NO:5 所示。
[0019]在本发明中，优选的，所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
[0020]本发明的目的之四在于提供所述的反向遗传操作系统在拯救新城疫病毒中的应用。[0021]实验表明，利用本发明所构建的溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA可以成功拯救出溶瘤型新城疫病毒。
[0022]本发明的感染性cDNA的成功构建将为研究溶瘤型新城疫病毒提供一个有力的基因操作技术平台，方便对新城疫病毒度基因组的操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为D90全长cDNA质粒KpnI单酶切结果；
[0024]M =Marker DL15, 000 ；1:D90全长质粒;2:D90全长质粒KpnI单酶切产物;
[0025]图2为微基因组及辅助质粒功能验证结果；
[0026]A:D90minigenome 和辅助质粒 pC1-NP、pCI_P、pC1-L ；B:D90minigenome
[0027]图3:拯救病毒F1、F5 和FlO代分子标签测序结果；
[0028]图4拯救病毒和亲本病毒在鸡胚成纤维细胞CEF上的生长动力学曲线；
[0029]图5MTT法检测拯救病毒的溶瘤特性；
[0030]图6为pBR322-THT载体图谱。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032]实施例1:D90株全基因组序列测定
[0033]1、生物材料准备:
[0034]新城疫病毒D90株(新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作用，符芳等，《中国预防兽医学报》，2007年02期)由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。
[0035]用包含NDV F裂解位点的引物4501-6484U/4501-6484L扩增，经序列比对，结果表明，D90株F裂解位点具有强毒R-R-Q-K-R-F-1序列特征，因此，根据NDV强毒序列设计如表I所示引物，扩增D90株全基因组序列。
[0036]2、病毒的纯化
[0037]采用SPF鸡胚有限稀释纯化的方法纯化NDV D90病毒。首先测定D90的HA，将病毒连续梯度稀释后取最高稀释倍数的稀释液接种SPF鸡胚(IOOul/枚)，弃掉24小时内死亡的鸡胚，每隔3天收获鸡胚尿囊液测定HA，再用同样方法连续稀释病毒纯化3代，收获的第3代病毒尿囊液作为种毒用于全基因组序列的测定。
[0038]3、病毒RNA的提取、反转录和RT-PCR
[0039]取D90病毒尿囊液，按照QiagenRNA提取试剂盒说明书提取基因组RNA，之后用Promega M-MLV反转录酶反转录后获得cDNA,用Primer Star高保真DNA聚合酶PCR扩增PCR产物，每个片段做三个反应，之后PCR产物用纯化试剂盒或胶收试剂盒按照说明书纯化。纯化后的PCR反应产物送北京华大基因公司测序。所用PCR扩增引物见表1:
[0040]表1:D90全基因组测序引物
【权利要求】
1.溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性CDNA，其特征在于:所述的全长感染性CDNA序列为SEQ ID N0:2所示。
2.—种构建权利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的方法，包括: O以新城疫病毒D90株的RNA为模板，分11段扩增D90株基因组，进行全基因组序列测定，得到的新城疫D90株病毒的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示； 2)通过RT-PCR方法获得新城疫病毒D90株基因组各部分的4个片段，将所扩增的PCR片段采用同源重组的方法组装克隆到质粒载体中，构建带有溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA的质粒载体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的全长感染性cDNA的序列如SEQIDNO: 2所示，与SEQ ID NO:1所示的亲本新城疫D90株天然序列相比，其缺失掉一个KpnI酶切位点。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的质粒载体为加入T7启动子、核酶和T7终止子的 pBR322载体。
5.一种溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于:该溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统包括包含权利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的质粒载体和三个辅助质粒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pC1-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
6.如权利要求5所述的反向遗传操作系统，其特征在于:溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO: 3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO: 5所示。
7.权利要求1所述的全长感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的应用，其特征在于包括将所述的全长感染性cDNA和三个辅助质粒共转染哺乳动物细胞，拯救得到新城疫病毒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pC1-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于:溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID N0:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO: 4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO: 5所示。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
10.权利要求5或6所述的反向遗传操作系统在拯救新城疫病毒中的应用。
【文档编号】C12N15/86GK103451198SQ201310364591
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】李曦, 柴政, 符芳 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所