一种新城疫病毒的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种新城疫病毒的检测方法，其操作程序是：选取现有DNA序列数据库（GENEBANK）中新城疫病毒（NDV）的核蛋白（NP）基因序列进行同源性对比，根据其保守区域，设计出针对各基因片段的引物及探针；然后对引物和探针进行合成及修饰，将特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球（即液相芯片），液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。本发明有着灵敏性高，特异性强，重复性高，操作简便，耗时短，成本相对低、使用安全等优点。
【专利说明】一种新城疫病毒的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及禽类感染病毒检测【技术领域】，具体是指一种新城疫病毒的检测方法。【背景技术】
[0002]新城疫(Newcastledisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle diseasevirus, NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病。目前新城疫病毒的监测方法包括传统方法与分子生物学方法。传统方法如病毒分离培养和血清学诊断等，其不足之处在于操作繁琐、诊断时间长等，而分子生物学方法如RT-PCR等具有特异、敏感、简便快捷等特点，克服了传统方法的局限性，但不能进行高通量检测，这样不能满足海关的出入境检疫要求。
[0003]因此，需要发明一种新的新城疫病毒的检测方法以解决上述技术问题。液相芯片检测技术是一个全新的快速高通量检测技术，该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体，具有独特的优点:通过高通量手段可降低成本和劳动力；检测样本量需求少，可通过液相荧光编码微球芯片的方法，在自然的液相反应条件下缩短检测时间；相对于固相平板芯片，液相反应动力学反应更快速、重复性更好；1~100种灵活多重检测，满足多种检测需求:开发平台可适用于多种检测试剂和软件的开发。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种快速、准确、高通量检测病毒的方法，采用PCR检测方法与液相芯片检测技术结合，建立新城疫液相芯片快速检测方法。
[0005]本发明的技术方案是这样实现的:
[0006]首先，设计引物及探针:选取现有DNA序列数据库(GENEBANK)中新城疫病毒(NDV)的核蛋白(NP)基因序列进行同源性对比，根据其保守区域，设计出针对各基因片段的引物及探针；
[0007]第二，合成及修饰引物和探针:下游引物及探针反向互补序列RC-PiObe的5’端标记生物素，得到特异性检测引物，探针Probe的5’-C6标记氨基，得到特异性探针，所述引物和探针序列分别为:
[0008]引物:
[0009]ND (NP 基因):201bp (198-398)
[0010]Pl:5’ -CCTCGTCTCAG ACAGGGTCAA-3，，
[0011]P2:5 ’ -CGGCACCTATAAAGCGTTTT TG-3 ’，
[0012]探针及其反向互补序列:
[0013]Probe:5’ -TCCTCTTGGCGATT CCATCCGC-3’，[0014]RC-Probe:5’ -GCGG ATGGAA TCGCCA AGAAGA-3’ ；
[0015]第三，将特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球(即液相芯片)，具体步骤为:
[0016](I)、用 0.1M MES (ρΗ4.5)将探针稀释至 0.2mM ；
[0017](2)、取200 μ L荧光编码微球贮存液(5X106)，10000r/min离心5min,弃上清，加入50 μ L的0.1M MES (ρΗ4.5)，之后振荡混匀再加入0.2nmol的0.2mM寡核苷酸探针，混匀；
[0018](3)、加入10 μ L的10mg/mL EDC溶液，混匀后室温避光孵育30min，再次加入相同量的EDC继续孵育30min ；
[0019](4)、加入 1.0mL 的吐温-20 (0.02%w/v)混匀洗漆，10000r/min 离心 IOmin 沉淀突
光编码微球；
[0020](5)、弃上清后加入1.0mL的SDS (0.l%w/v)混匀洗漆后再次10000r/min离心IOmin沉淀荧光编码微球；加入适量的0.1M MES(pH4.5)，采用血球计数法进行计数，于2°C~8 °C避光保存。
[0021]设计PCR反应，其中:第一，PCR扩增产物是抽提带有以上新城疫病毒核蛋白(NP)基因的质粒，进行PCR扩增，其反应体系(50 μ L)如下:去核糖核酸酶水(RNase-freewater) 34 μ L, IOXTaKaRa PCR 缓冲液 5 μ L，dNTP mix ((lOmM/each) 4 μ L, TaKaRa 酶(5U/μ I) 2 μ L, Pl (20 μ Μ) I μ L,质粒 DNA 模板 2 μ L，Ρ2 (20 μ Μ) 2 μ L ;反应条件设定为:95°C热启动3分钟；94°C变性30秒，52°C褪火I分30秒，72°C延伸I分钟。液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物`，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。
[0022]最后，将已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的相应荧光编码微球与扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒单一基因液相芯片检测标准体系，具体步骤如下:分别取已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的荧光编码微球和扩增产物各100 μ L，充分混合后制备荧光编码微球混合液，并用1.5 X TMAC杂交液使每种荧光编码微球稀释为200个/种/ μ L，然后分别与一种或两种混合的PCR或RT-PCR扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒基因液相芯片检测体系。
[0023]其中，所设计的引物是以现有DNA序列数据库GENEBANK上新城疫病毒(NDV)的核蛋白(NP)基因的保守片段为祀目标,通过primer Express软件和primer prere5.0软件设计、并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，才得到新城疫病毒NP基因的特异性引物，所有的引物和探针送Sigma合成。
[0024]本发明产生的有益效果是:
[0025]1、核酸液相芯片快速检测技术与常规的病原分离鉴定、血清学方法、以及PCR、ELISA等传统分子生物学鉴别方法相比，有着灵敏性高，特异性强，重复性高，操作简便，耗时短，成本相对低等优点。本发明为开发出鉴别新城疫病毒(NDV)更为快速有效的方法提供了一条广阔的应用前景。
[0026]2、本核酸液相芯片鉴别检测试剂可对新城疫病毒(NDV)进行快速检测，样品适用范围广，试剂中均为无感染性的、没有生物安全隐患的成份，具有使用安全的优点。
[0027]3、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、鉴别检测结果。该核酸液相芯片鉴别检测试剂鉴是一种检测临床样品中新城疫病毒(NDV)的敏感和可靠的方法。【专利附图】
【附图说明】
[0028]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0029]附图1为NDV的RT-PCR扩增后电泳检测结果。
[0030]图中:M:DNA Mark DL2000 ；1:NDV E 基因的 RT-PCR 扩增片段。
【具体实施方式】
[0031]以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032]下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]第一、设计引物及探针:
[0034]本发明选择新城疫病毒(NDV)的NP基因的保守片段为靶目标，根据其保守区域，应用primer Express软件和primer prere5.0软件,设计出针对该基因片段的引物及探针。将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验和交叉反应试验后，确定针对新城疫病毒(NDV) NP基因的扩增效率和特异性均最好的一对引物，扩增目标片段长度为201bp。
[0035]引物:
[0036]ND (NP 基因):2`01bp (198-398)
[0037]Pl:5，-CCTCGTCTCAG ACAGGGTCAA-3，；
[0038]P2:5’ -CGGCACCTATAAAGCGTTTT TG-3’。
[0039]探针及其反向互补序列:
[0040]Probe:5， -TCCTCTTGGCGATT CCATCCGC-3，；
[0041]RC-Probe:5， -GCGG ATGGAA TCGCCA AGAAGA-3，。
[0042]引物和探针送Sigma合成，下游引物P25’端标记生物素，探针Probe5’ C6标记氨基，探针反向互补序列RC-PiObe5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。引物按各自摩尔数计算，用水溶解成200 μ M贮存母液备用。
[0043]第二、新城疫病毒(NDV) E基因的重组质粒的构建和标准品的制备:
[0044]第三，将特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球(即液相芯片)，具体步骤为:
[0045](I )、用 0.1M MES (ρΗ4.5)将探针稀释至 0.2mM ；
[0046](2)、取200 μ L荧光编码微球贮存液(5X106)，10000r/min离心5min，弃上清，加入50 μ L的0.1M MES (ρΗ4.5)，之后振荡混匀再加入0.2nmol的0.2mM寡核苷酸探针，混匀；
[0047](3)、加入10 μ L的10mg/mL EDC溶液，混匀后室温避光孵育30min，再次加入相同量的EDC继续孵育30min ；
[0048](4)、加入 1.0mL 的吐温-20 (0.02%w/v)混匀洗漆，10000r/min 离心 IOmin 沉淀突
光编码微球；[0049](5)、弃上清后加入1.0mL的SDS (0.l%w/v)混匀洗涤后再次10000r/min离心IOmin沉淀荧光编码微球；加入适量的0.1M MES(pH4.5)，采用血球计数法进行计数，于2°C~8 °C避光保存。
[0050]设计PCR反应，其中:第一，PCR扩增产物是抽提带有以上新城疫病毒核蛋白(NP)基因的质粒，进行PCR扩增，其反应体系(50 μ L)如下:去核糖核酸酶水(RNase-freewater) 34 μ L, IOXTaKaRa PCR 缓冲液 5 μ L，dNTP mix ((lOmM/each) 4 μ L, TaKaRa 酶(5U/μ I) 2 μ L, Pl (20 μ Μ) I μ L,质粒 DNA 模板 2 μ L，Ρ2 (20 μ Μ) 2 μ L ;反应条件设定为:95°C热启动3分钟；94°C变性30秒，52°C褪火I分30秒，72°C延伸I分钟。液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物，并通过液相芯片检测仪读出检测结果第三、PCR扩增体系的建立及优化:[0051]RT-PCR在反应体系中其它条件相同的条件下，确定的最佳引物终浓度分别为
0.01 μ M~0.05 μ Μ，2.5mM MgCl2的浓度为反应体系中的镁离子浓度，以此条件建立新城疫病毒的PCR检测方法。RT-PCR反应结束后，取5 μ L RT-PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测，得出与理论相符的目的条带(图1)。
[0052]第四、核酸液相芯片(PLex)检测体系的建立:
[0053]将已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的相应荧光编码微球与扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒单一基因液相芯片检测标准体系，具体步骤如下:分别取已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的荧光编码微球和扩增产物各100 μ L，充分混合后制备荧光编码微球混合液，并用1.5 X TMAC杂交液使每种荧光编码微球稀释为200个/种/ μ L，然后分别与一种或两种混合的PCR或RT-PCR扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒基因液相芯片检测体系。
[0054]NDV探针与相应荧光编码的荧光编码微球偶联后，与相应的PCR反应扩增产物直接杂交后显示，各个参与计数的荧光编码微球均> 20个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信；各个荧光编码微球的空白对照MFI均〈500，表明结果有效，试验可以进行结果判定；PCR扩增产物的MFI明显大于阴性和空白对照的值。探针与相应的PCR扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值都大于10，表明均为阳性(表1)。
[0055]表1NDV PLex 检测 MFI 值
[0056]
【权利要求】
1.一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤:(一)、设计引物及探针:选取现有DNA序列数据库(GENEBANK)中新城疫病毒(NDV)的核蛋白(NP)基因序列进行同源性对比，根据其保守区域，设计出针对各基因片段的引物及探针；(二)、合成及修饰引物和探针:下游引物及探针反向互补序列RC-PiObe的5’端标记生物素，得到特异性检测引物，探针Probe的5’ -C6标记氨基，得到特异性探针，所述引物和探针序列分别为:引物:ND (NP 基因):201bp (198-398)Pl:5’ -CCTCGTCTCAG ACAGGGTCAA-3’，P2:5’ -CGGCACCTATAAAGCGTTTT TG-3’，探针及其反向互补序列:Probe:5’ -TCCTCTTGGCGATT CCATCCGC-3’，RC-Probe:5’ -GCGG ATGGAA TCGCCA AGAAGA-3’ ；(三)、特异性探针通过与荧 光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球(即液相芯片)；液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物，并通过液相芯片检测仪读出检测结果O
2.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于:设计PCR反应，其中:第一，PCR扩增产物是抽提带有以上新城疫病毒核蛋白(NP)基因的质粒，进行PCR扩增，其反应体系(50μ L)如下:去核糖核酸酶水(RNase-free water ) 34 μ L, 10 X TaKaRa PCR缓冲液 5 μ L，dNTP mix ((10mM/each) 4 μ L，TaKaRa 酶(5U/ μ I) 2 μ L，Pl (20 μ Μ) I μ L,质粒 DNA模板2 μ L，P2 (20 μ Μ) 2 μ L ;反应条件设定为:95°C热启动3分钟；94°C变性30秒，52°C褪火I分30秒，72 °C延伸I分钟。
3.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于:所述特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球(即液相芯片)的具体步骤为:(1)、用0.1M MES(pH4.5)将探针稀释至 0.2mM ；(2)、取200μ L荧光编码微球贮存液(5X106)，10000r/min离心5min,弃上清，加入50 μ L的0.1M MES (ρΗ4.5)，之后振荡混匀再加入0.2nmol的0.2mM寡核苷酸探针，混匀；(3)、加入IOyL的10mg/mL EDC溶液，混匀后室温避光孵育30min，再次加入相同量的EDC继续孵育30min ；(4)、加入1.0mL的吐温-20(0.02%w/v)混匀洗漆，10000r/min离心IOmin沉淀突光编码微球；(5)、弃上清后加入1.0mL的SDS (0.l%w/v)混匀洗漆后再次10000r/min离心IOmin沉淀荧光编码微球，加入适量的0.1M MES (pH4.5)，采用血球计数法进行计数，于2°C~8°C避光保存。
4.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于:将已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的相应荧光编码微球与扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒单一基因液相芯片检测标准体系。
5.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于:所述新城疫病毒基因液相芯片检测体系的建立，具体步骤如下:分别取已经偶联新城疫病毒核蛋白(NP)基因探针的荧光编码微球各100 μ L，充分混合后制备荧光编码微球混合液，并用1.5 X TMAC杂交液使每种荧光编码微球稀释为200个/种/ μ L，然后分别与一种或两种混合的PCR或RT-PCR扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒基因液相芯片检测体系。
6.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于:所述引物是以现有DNA序列数据库(GENEBANK)上新城疫病毒的核蛋白(NP)基因的保守片段为靶目标，通过primer Express软件和primer prere5.0软件设计,得到新城疫病毒核蛋白(NP)基因的特异性引 物。
【文档编号】C12R1/93GK103602756SQ201310369581
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】詹爱军, 周建忠 申请人:江苏博爱生物科技有限公司