一种草莓病毒的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于草莓病毒防治领域，具体涉及一种草莓病毒的定量检测方法。 技术背景
[0002] 草莓Za/KMassa)是蔷薇科草莓属多年生草本植物。近年来草莓种 植面积发展很快，世界总产量在浆果类水果中己经跃居第2位。我国是世界草莓属植物种 类分布最多的国家，同时也是世界上草莓栽培面积最大、产量最多的国家。草莓长期无性繁 殖和连作而导致种性退化以及植株被感染了病毒病，常表现为植株矮化、抗逆性降低、畸形 果增加、果实品质下降，单位面积产量降低。草莓病毒病在世界各地分布广泛，其中草莓轻 型黄边病毒（(60?? 1KiriAssSMYEV)是分布较广、危害较重的最主 要的RNA病毒。现有技术中通常采用普通PCR或酶联免疫技术进行病毒病检测，其检测特 异性差，灵敏度较低而且可能会有假阳性或者假阴性结果。近年发展起来的实时荧光定量 PCR(RealtimequantitativePCR)技术具有更高的检测灵敏度和准确度，但现有技术中 还没有将荧光定量PCR用于草莓病毒的定量检测的方法。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明提供了一种草莓病毒的定量检测方法，可以对草莓病毒进 行精确定量检测，且灵敏度高。
[0004] 本发明通过以下技术方案来实现： 一种草莓病毒的定量检测方法，包括以下步骤： (1) 提取草莓总RNA; (2) 对步骤（1)中提取的RNA进行纯化处理； (3) 反转录合成第一链cDNA; (4) 以步骤（3)中获得的cDNA为模板，加入与待检测病毒的外壳蛋白基因对应的上下 游引物，采用实时荧光定量PCR(RealtimequantitativePCR)进行扩增和检测，获得样 品的目标基因的Ct值，再对照标准曲线求得样品感染病毒的浓度。该方法定量准确，且灵 敏度高。
[0005] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述待检测病毒为草莓轻型 黄边病毒（SMYEV)，所述实时荧光定量PCR扩增中使用的与该病毒的外壳蛋白基因对应的 上下游引物序列分别为： 上游引物SMYEVcp-F3:CGCTGCTGCCAGTAATAAGG; 下游引物SMYEVcp-R6:CGAGGGCGAGGAACCAAT。采用专门针对草莓轻型黄边病毒 (SMYEV)设计的上下游引物，对该病毒基因的检测准确性高，避免出现假阳性结果，特异性 强，灵敏度高，且可适用于具有不同地域来源的草莓轻型黄边病毒（SMYEV)的检测，普适性 好，便于推广应用。
[0006] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述标准曲线的回归方程为 Y=-0. 3229X+9. 3399,R2=0. 91，其中X代表Ct值，Y代表病毒的质量体积浓度，其单位为pg/uL。在所得的质量体积浓度的基础上，采用下述公式可以换算得到拷贝数/体积浓度Z。该 公式具体为：Ζ=ΥΛ5699*324)*6*10η。直接采用优化后的标准曲线和换算公式，不需要再自 行绘制标准曲线，操作更简便，大大降低了成本，节约了时间，便于推广应用。
[0007] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述标准曲线可以采用以下 方法制作：分别以至少四种具有不同稀释浓度的含有病毒外壳蛋白基因的重组质粒为模 板，采用与步骤（4)相同的上下游引物和相同的荧光定量PCR扩增、检测条件，分别获得不 同浓度对应的Ct值，然后绘制成Ct值-病毒浓度曲线。所述具有不同稀释浓度可选梯度 稀释浓度，所述标准曲线采用线性回归方程进行拟合，也可采用其他其他稀释浓度或其他 常用的拟合方式进行拟合。
[0008] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述方法中还包括内参基因 验证步骤，具体为：以步骤（3)中获得的cDNA为模板，以草莓作为内参基因，加入与 内参基因对应的上下游引物，采用普通PCR、或实时荧光定量PCR进行扩增和检测，所述与 内参基因对应的上下游引物分别为： 上游引物FAactin-Fl :GTATGGTCAAGGCTGGGTTTGCTGG ; 下游引物FAactin-Rl:CGTCACCGACATAAGCATCTTTCTG。通过内参基因检验可以确认待 测样品cDNA模板质量，属于检测中的一个质控，避免因RNA的提取、纯化、反转录等操作问 题而导致最终假阴性结果。
[0009] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述步骤（1)具体为：取草 莓成熟叶片，液氮中研磨粉碎后，加入研磨缓冲液和β-巯基乙醇，充分研磨；将研磨混合 物转移到ΕΡ管中并加入10%十二烷基肌氨酸钠；70 °C水浴10min，其间上下颠倒数 次；立即冰浴5min;室温下离心；转移上清液到干净的EP管中并加入无水乙醇、Nal和 重溶二氧化硅溶液；室温静置30min，期间上下颠倒数次，室温下离心；弃上清溶液，加洗 涤缓冲液洗涤沉淀；重复洗涤一次；沉淀于室温下干燥4min，重溶于灭菌DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，加入脱氧核糖核酸酶I(RNase-freeDNaseI)和DNA 酶缓冲液，25 °C水浴10min，即得总RNA粗提液。
[0010] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述步骤（1)具体为：取草莓 成熟叶片0.1~0.2g，液氮中研磨粉碎后，加入2mL研磨缓冲液（4Μ异硫氰酸胍，0.2Μ醋 酸钠，25mMEDTA，1Μ醋酸钾，2. 5%PVP-4000)和200μLβ-巯基乙醇，充分研磨。转移 0. 5mL研磨混合物到1.5mLΕΡ管中并加入100μL10%十二烷基肌氨酸钠。70 °C水浴 10min,期间上下颠倒数次（1次/2min)。立即冰浴5min。室温13000rpm离心3min。 转移300μL上清液到干净的1. 5mLΕΡ管中并加入150μL无水乙醇，300μL6MNal 和30μL重溶二氧化娃溶液（pH2.0)。室温静置30min,期间上下颠倒数次（1次/5min)。 室温离心6000rpm，lmin。弃上清溶液，加洗涤缓冲液（10mMTris-HCl, 50mMNaCl，5 MEDTA，50%无水乙醇)500μL洗涤沉淀。重复洗涤一次。沉淀于室温下干燥4min，重溶 于95μL灭菌DEPC水中，加入DNA酶I(RNase-freeDNaseI)和DNA酶缓冲液，25。C 水浴10min，即得总RNA粗提液。
[0011] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述步骤（1)具体为：将草莓 植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入细胞裂解液，使其充分裂解；将上述细胞裂解液和 组织研磨物的混合物转移至干净的离心管中；在离心管中加入去蛋白液和氯仿混匀；室温 下离心，将上清液转移到另一个干净的离心管中；加入等体积的漂洗液，充分混匀；然后将 混合物加入到一个离心吸附柱中，室温下离心，弃穿透液；加洗柱液，室温离心，弃穿透液； 重复洗柱操作一遍。然后对干柱再室温离心以便去除残留的液体；将RNase-free DNase I 加入到DNA酶缓冲液中混匀，加入到离心吸附柱中；室温放置15分钟；直接在离心吸附柱 中加去酶液，混匀，12000g(离心加速度，其中g代表重力加速度)室温离心1分钟，弃穿透 液。再加去酶液，12000g室温离心1分钟，弃穿透液；室温空离心2分钟；将离心吸附柱转 移到无RNA酶的离心管中，加入RNA洗脱液，室温放置2分钟，12000g室温离心1分钟；再 加入RNA洗脱液，室温放置2分钟，12000g室温离心1分钟，离心管中溶液即为总RNA粗提 液。
[0012] 作为可选方式，在上述草莓病毒的定量检测方法中，所述步骤（1)具体为：将大约 l〇〇mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mL细胞裂解液，涡旋振荡40s使其充分 裂解。转移lmL细胞裂解液和组织研磨物的混合物移至干净的1.5mL塑料离心管中。在离 心管中加入300 μ L的去蛋白液和200μ L氯仿在震荡器上震荡30s混匀，此时溶液呈均匀 的乳浊状。室温12000g(离心加速度，其中g代表重力加速度）离心10分钟，两相间将有 约5-10mm厚的细胞破碎物。将650 μ L上清液转移到另一个干净的1. 5mL塑料离心管中。 加入等体积的漂洗液，充分颠倒混匀。然后将混合物加入到一个离心吸附柱中（如果不能 一次将全部溶液加入到吸附柱中，请分两次加入到吸附柱中，每次小于700 μ L)，12000g室 温离心1分钟，弃穿透液。加500 μ L洗柱液，12000g室温离心1分钟，弃穿透液。再加入 500yL洗柱液，重复一遍。然后再室温12000g离心1分钟以便去除残留的液体。将5yL 的RNase-free DNase I加入到45μL DNA酶缓冲液中混匀，加入到离心吸附柱中。室温放 置15分钟。直接在离心吸附柱中加0. 5mL的去酶液，盖上盖后点到混匀数次，12000