一种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，属于植物成分检测【技术领域】。该方法对检测用红细胞悬液进行了细胞定量，同时利用已知浓度的菜豆植物凝集素作为标准品绘制凝血活性浓度标准曲线，进而计算出菜豆植物凝集素凝血活性浓度，从而对菜豆植物凝集素凝血活性进行定量。
【专利说明】一种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物成分检测【技术领域】，具体涉及一种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法。
【背景技术】
[0002]菜豆中含有的植物凝集素是引起菜豆食物中毒的有毒物质之一，尤其是鲜菜豆豆荚，常常因烹饪不当造成中毒事件的发生。菜豆中毒是多因素的，其中最重要的因素是由于菜豆中的凝集素可与红细胞表面特异糖基识别并专一性结合在红细胞表面形成许多交叉的“桥”，使红细胞发生凝集，进而引起机体的整体反应。不同菜豆品种中植物凝集素的含量不尽相同，因此可用红细胞凝集法来检测菜豆中植物凝集素活性，对指导人们选择植物凝集素活性较低的菜豆品种种植和使用提供依据。
[0003]红细胞凝集法是目前应用最为广泛的植物凝集素检测方法。该方法利用天然的、酶处理的、戊二醛固定的兔、羊、人等动物红细胞，配制成一定浓度的红细胞悬液，将凝集素溶液经过倍比稀释后加入等体积红细胞悬液，在一定条件下静置一段时间后利用肉眼观察和比色法进行活性判定。
[0004]现有的测定凝集素活性的方法主要分为两大类:一类以观察血细胞凝集效果的定性分析，如V形酶标板法，平板法，试管法等等；另一类是以分光光度计及酶标仪测定的特定波长下的吸光度的半定量分析方法。这些方法存在以下缺点:(1)只能进行定性或半定量测定；(2)配制标准红细胞悬液方法不一，多用体积百分数来表示，重现性差；(3)确定读取终点时间的随意性较大，有的有肉眼观察结果，主观性大，结果误差也大，精确度低；(4)测定方法多种多样，测得的结果千差万别，无法进行比较。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种高通量定量检测菜豆植物凝集素凝血活性的方法。
[0006]本发明所采用的技术方案是:
[0007]—种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，所述方法包括以下步骤:
[0008]( I)对检测用红细胞悬液进行细胞定量；
[0009](2)用已知浓度的菜豆植物凝胶素作为标准品绘制凝血活性浓度标准曲线；
[0010](3)计算出菜豆植物凝集素凝血活性浓度。
[0011]进一步地，所述步骤(I)具体为:
[0012](A)采集新鲜兔血置于5%?10%枸橼酸钠抗凝剂中，与4倍体积阿氏(Alsever’ s)液混匀后置于4°C冰箱保存备用；
[0013](B)将步骤(A)得到的新鲜兔血与生理盐水按5:8的比例缓慢混匀，800?IOOOrpm离心10分钟，收集沉淀；
[0014](C)重复上述步骤洗涤红细胞，至上清液颜色近乎透明后，按红细胞体积配成20%的红细胞悬液。
[0015](D)取步骤(C)得到的红细胞悬液经生理盐水稀释后计数红细胞，并调整红细胞浓度为5 X IO7个/ml-5 X IO8个/ml，4°C冰箱保存备用。
[0016]优选地，所述步骤(A)中得到的新鲜兔血保存备用不得超过14天。
[0017]进一步地,所述步骤(2)具体为:
[0018](a)在酶标板上，将已知浓度的菜豆植物凝集素标准品二倍稀释六个稀释度；
[0019](b)向上述酶标板各孔加入已定量的红细胞悬液，混合均匀，并静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，绘制菜豆植物凝集素凝血活性浓度标准曲线。
[0020]更进一步地，所述步骤(a)中，菜豆植物凝集素标准品的浓度为lmg/ml，二倍稀释六个稀释度为 lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
[0021]进一步地,所述步骤(3)具体为:
[0022]( I )将新鲜菜豆植物洗净擦干后称重，置于研钵中，加入质量体积比为1:1的生理盐水，于冰上研碎；
[0023](II)将步骤(I )得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，离心lOmin，取上清液；
[0024](III)将步骤(II)得到的上清液静置5分钟后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液；
[0025](IV)在酶标板上，将步骤(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀释三个稀释度；
[0026](V)向上述酶标板各孔加入步骤(I)得到的红细胞悬液，混合均匀，并静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，将该值代入步骤(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性浓度标准曲线的公式中，计算得到菜豆植物凝集素凝血活性浓度。
[0027]优选地，所述菜豆植物为菜豆豆荚或豆粒。
[0028]优选地，所述酶标板为96孔。
[0029]本发明具有以下优点:
[0030]该检测方法步骤简单，利用该方法可以对菜豆植物进行高通量定量的凝集素凝血活性检测；制备出的红细胞悬液进行了细胞定量，可保证各批次间测定结果的相对一致；同时检测出的结果更加精确，误差度小，测定出的结果可以进行互相比较。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为实施例中菜豆植物凝集素标准品测定曲线图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0033]( I)制备标准红细胞悬液及测定标准曲线:
[0034]1.用心脏采血法采集新鲜兔血2ml，置于300ul的8%枸橼酸钠抗凝剂中，再与8mlAlsever’s液混匀后置于4°C冰箱保存备用(2周内红细胞正常，超过2周，红细胞出现溶血现象)。
[0035]2.取用Alsever’s液保存的新鲜兔血2.5ml，与生理盐水按5:8的比例缓慢混匀，800-1000rpm离心10分钟，收集红细胞沉淀。[0036]3.重复上述步骤洗涤红细胞五次后，上清液颜色完全透明，再根据红细胞沉淀的体积配成20%的红细胞悬液。
[0037]4.取IOOul上述红细胞悬液用生理盐水稀释10倍后，取稀释后的红细胞悬液IOOul，再稀释10倍，然后取15ul经两次稀释后的红细胞悬液计数红细胞数量，调整红细胞浓度为 5 X IO7 个 /ml-5 X IO8 个 /ml。
[0038]5.在96孔酶标板上加入IOOul的lmg/ml菜豆植物凝集素标准品，并做二倍稀释6个稀释度，滴加不同浓度(5 X IO7个/ml、I X IO8个/ml、2 X IO8个/ml、4X IO8个/mDlOul红细胞悬液，观察凝血情况，并测定450nm处的吸光值。
[0039]参照图1，结果显示红细胞浓度为2 X IO8个/ml时，凝血反应速度适中，根据450nm处的吸光值做出的标准曲线的线性相关系数大于0.99。
[0040](2)菜豆植物凝集素浸提液的制备
[0041]1.新鲜菜豆豆荚或豆粒洗净擦干后称重，置于研钵中，加入质量体积比为1:1的生理盐水，于冰上研碎。
[0042]2.在 4°C下,8000r/min 离心 IOmin,取上清液。
[0043]3.静置5分钟后，再次取上清液，即为菜豆植物凝集素浸提液。
[0044](3)菜豆植物凝集素活性浓度测定
[0045]1.在96孔酶标板上，加入58种不同品种的菜豆豆荚浸提液各
[0046]IOOul。
[0047]2.向各孔中加入2 X IO8个/ml的红细胞悬液IOul，混合均匀，静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，将该值代入标准曲线的公式进行菜豆植物凝集素凝血活性浓度的计算，公式如图1所示。
[0048]对于凝集素含量较高，超出标准曲线测定范围的15种菜豆豆荚浸提液，用生理盐水进行二倍稀释3个浓度梯度，每孔lOOul，再向各孔中加入2X IO8个/ml的红细胞悬液10ul，混合均匀，静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，取吸光值位于标准曲线内的数值代入标准曲线的公式进行菜豆植物凝集素凝血活性浓度的计算。
[0049]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)对检测用红细胞悬液进行细胞定量； (2)用已知浓度的菜豆植物凝胶素作为标准品绘制凝血活性浓度标准曲线； (3)计算出菜豆植物凝集素凝血活性浓度。
2.根据权利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为: (A)采集新鲜兔血置于5%~10%枸橼酸钠抗凝剂中，与4倍体积阿氏液混匀后置于4°C冰箱保存备用； (B)将步骤(A)得到的新鲜兔血与生理盐水按5:8的比例缓慢混匀，800~1000rpm离心10分钟，收集沉淀； (C)重复上述步骤洗涤红细胞，至上清液颜色近乎透明后，按红细胞体积配成20%的红细胞悬液。 (D)取步骤(C)得到的红细胞悬液经生理盐水稀释后计数红细胞，并调整红细胞浓度为5 X IO7个/ml-5 X IO8个/ml，4°C冰箱保存备用。
3.根据权利要求2所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述步骤(A)中得到的新鲜兔血保存备用不得超过14天。`
4.根据权利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为: Ca)在酶标板上，将已知浓度的菜豆植物凝集素标准品二倍稀释六个稀释度； (b)向上述酶标板各孔加入已定量的红细胞悬液，混合均匀，并静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，绘制菜豆植物凝集素凝血活性浓度标准曲线。
5.根据权利要求4所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述步骤(a)中，菜豆植物凝集素标准品的浓度为lmg/ml，二倍稀释六个稀释度为lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
6.根据权利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为: (I)将新鲜菜豆植物洗净擦干后称重，置于研钵中，加入质量体积比为1:1的生理盐水，于冰上研碎； (II)将步骤(I)得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，离心lOmin，取上清液； (III)将步骤(II)得到的上清液静置5分钟后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液； (IV)在酶标板上，将步骤(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀释三个稀释度； (V)向上述酶标板各孔加入步骤(1)得到的红细胞悬液，混合均匀，并静置10分钟，在酶标仪450nm处读取吸光值，将该值代入步骤(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性浓度标准曲线的公式中，计算得到菜豆植物凝集素凝血活性浓度。
7.根据权利要求6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述菜豆植物为菜豆豆荚或豆粒。
8.根据权利要求4或6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量检测方法，其特征在于，所述酶标板为 96孔。
【文档编号】G01N21/33GK103558176SQ201310532286
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】李佳楠, 陈禅友, 潘磊 申请人:江汉大学