一种利用拟糖蛋白快速构建糖芯片的技术的制作方法

本发明涉及一种利用拟糖蛋白快速构建糖芯片的技术，属于生物检测技术领域。

背景技术：

糖类化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源。它不仅是营养物质，而且还具有特殊的生理活性。例如：肝脏中的肝素有抗凝血作用；血型糖蛋白与免疫活性有关；核酸的组成成分中含有糖类化合物——核糖和脱氧核糖；细胞识别也和细胞膜表面的糖蛋白有关。因此，研究糖类化合物对医学和生命科学领域来说，具有极其重要的意义。

糖芯片起源于DNA或蛋白质芯片的研究，技术成熟，是目前分析糖和各种生物物质(如凝集素、细菌、病毒、抗体等)之间相互作用的有效工具。糖芯片通常是把糖类探针先固定在基质材料(金属、玻璃、硝化纤维或聚苯乙烯等)表面，然后将标记有荧光团的生物物质注入表面，若发生相应的结合行为，则结合后的受配体也带有荧光团，在紫外光照下会发出荧光。所以，传统糖芯片在检测时都需要对样品进行标记，而标记过程有可能会改变结合的选择性；另外，荧光团的去除也是一个需要考虑的问题。

基于表面等离子体共振(SPR)现象的生物传感器，由于其具有无需标记、对样品无损伤、动态实时检测等众多优点，成为过去三十年研究的热点，被广泛的应用于各种生物分子的原位实时检测和生物物质间相互作用的研究。将其应用在糖类化合物的研究中，具有传统糖芯片无法取代的优势。SPR糖芯片也需要将糖类探针固定在传感器表面，让待测样品流过传感器表面，若样品中有物质能够与表面的探针发生作用，就会引起检测器信号的相应变化。

所以不论是传统糖芯片或SPR糖芯片，糖探针在材料表面高效、快速且稳定的固定是重点。分子量较大的多糖探针虽然可以通过疏水相互作用或范德华力很容易的吸附在传感器表面，但对于单糖或者二糖这类小分子糖类，无法直接固定在传感器表面，需要在糖的端基修饰上-SH、-NH₂等功能基团，以共价或非共价的形式固定在传感器表面；也可以合成各种糖复合物(如树枝状高分子、DNA、脂类等)。而为了更好的模拟生物体内的糖结构，有时我们还希望对表面上糖探针的数量和分布得到控制。通过原子转移自由基聚合(ATRP)，在传感器表面形成聚合物刷可以实现这一目的。但由于制备过程较为繁琐，且合成聚合物刷的过程需要合适的单体材料和特定的催化剂，成本较高，应用有一定局限性，很难适应大批量生产。

在此，我们提出一种快速固定单糖探针的新方法。利用牛血清蛋白(BSA)在各种材料(金、玻璃、聚苯乙烯等)表面良好的吸附能力，直接将连接有糖探针的BSA吸附于材料表面，形成糖芯片。由于蛋白质通常具有三维结构，而单糖探针又是和BSA蛋白外侧暴露的氨基连接，所以这种方法也可以在一定程度控制糖探针在BSA上的数量和分布。由于该固定方法过程简单，原料易得且成本低廉，可适用性强，适合大批量生产，应用前景非常广阔。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的简单、快速、适用性广的单糖芯片制备技术。

本发明的技术原理

在一定pH条件下，将一端接有方酸二乙酯的单糖衍生物和牛血清蛋白按不同比例反应，可以得到外侧接有不同糖链数的拟糖蛋白。这种拟糖蛋白可以直接吸附于各种材料表面，不需要任何的材料表面预处理。

为实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

(1)拟糖蛋白的制备

将氨基化的糖衍生物溶于pH＝7的磷酸盐缓冲液中，然后向溶液中加入一定量的方酸二乙酯，在室温下缓慢搅拌14h。反应结束后，真空蒸发掉溶剂，使用快速柱层析的方法纯化得到一端接有方酸二乙酯的糖衍生物。之后取一定量的牛血清蛋白(BSA)溶于pH＝9的硼酸盐缓冲液，向溶液中加入上一步得到的糖衍生物，在室温下缓慢搅拌18h。反应结束后，用交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)纯化产物，冷冻干燥后得到拟糖蛋白(即BSA-糖结合体)。通过控制牛血清蛋白和糖衍生物的加入质量比，可以得到外侧接有不同糖链数的拟糖蛋白。

(2)在材料表面的吸附

将制备好的拟糖蛋白溶于pH＝7的磷酸盐缓冲液中，然后把材料表面直接浸泡在该溶液中，即可得到吸附有拟糖蛋白的材料表面。在循环流动的环境下，一般1h的时间拟糖蛋白的吸附即可达到饱和。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过控制糖和蛋白的加入比例，可以得到外侧接有不同数量单糖探针的拟糖蛋白。

(2)本发明制备的糖探针在牛血清蛋白上呈三维分布，且可以直接吸附在各种材料表面。

(3)本发明的制备过程非常简单，所需原料易得，制备成本低，适合大批量生产。

附图说明

图1为本发明利用方酸二乙酯连接单糖衍生物和蛋白质制备拟糖蛋白的原理示意图；

图2为本发明利用拟糖蛋白快速构建糖芯片以及糖芯片重建的流程示意图；

图3为本发明利用拟糖蛋白快速构建糖芯片以及糖芯片重建的SPR动力学曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

取220mg的氨基化的甘露糖衍生物溶于10ml pH＝7的磷酸盐缓冲液中，然后向溶液中加入一定数量的方酸二乙酯，在室温下缓慢搅拌14h。反应结束后，真空蒸发掉溶剂，使用快速柱层析的方法纯化得到一端接有方酸二乙酯的甘露糖衍生物。再取54.89mg的牛血清蛋白溶于10ml pH＝9的硼酸盐缓冲液中，然后向溶液中加入10mg的一端接有方酸二乙酯的甘露糖衍生物，在室温下缓慢搅拌18h。反应结束后，用交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)纯化产物，冷冻干燥后得到所制备的甘露糖-牛血清蛋白。根据基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到的蛋白分子量的测试结果推断，上述制得的甘露糖-牛血清蛋白结构中的甘露糖探针数为11。

取上述制得的甘露糖-牛血清蛋白1.4mg溶于1.4ml pH＝7的磷酸盐缓冲液中，通过蠕动泵的输送，以700μL/min的流速在金膜表面循环流动1h，拟糖蛋白可以直接吸附到金表面，形成可用于SPR检测的糖芯片。

然后使用刀豆凝集素(ConA)对SPR糖芯片的性能做出评价。图2、图3分别为糖芯片的构建及重建的流程示意图和SPR动力学曲线。图3的SPR动力学曲线结果可以表明，该方法制备的SPR糖芯片可以用于糖-凝集素相互作用的研究，能够直观的反映出整个结合和解离过程。而且只需使用低浓度的氢氧化钠溶液就可以有效地重建芯片表面，芯片可以重复使用。