一种分离鉴定糖蛋白n-糖链结构的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法，属于糖链检测【技术领域】。本发明通过刀豆凝集素(ConA)分离富集高甘露糖型及非高甘露糖型N-糖链，以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测，以信噪比6为阈值进行数据筛选，结合Glycoworkbench软件分析。结构表明对照组鉴定出23种N-糖链，高甘露糖型与非高甘露糖型两部分共鉴定出29种N-糖链，比ConA富集前多鉴定6种N-糖链，具有更高的灵敏度及更丰富的糖链信息，对于低峰度糖链的鉴定有明显优势。
【专利说明】一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法，尤其是一种以刀豆凝集素分离富集、鉴定高甘露糖与非高甘露糖型N-糖链的方法，属于糖链检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]糖基化作为最为常见的一种蛋白质后修饰，与蛋白质的结构和功能有着密切关系，影响蛋白质的折叠，进而影响到自身生物学功能。异常糖基化与多种疾病相关，特别是与各种癌症的发生和发展密切相关。N-糖链在癌症的发生发展过程中是一种重要的生物标志物，近年研究表明，在晚期乳腺癌患者血清中检测到N-糖链岩藻糖化程度的增高与唾液酸化程度的降低；在卵巢癌患者血清中检测到唾液酸化Lewis结构的增多。近年来随着质谱检测技术的发展，基质辅助激光解析电离(MALDI)及电喷雾电离(ESI)等软电离技术具有高灵敏度、高特异性及保护生物大分子的完整性等特点，在糖链的检测方面应用广泛。然而当对一些样品内全N-糖链进行质谱检测时，发现其中含有非常丰富的高甘露糖型N-糖链、较少的复杂型与杂合型N-糖链，在图谱上，高峰度的高甘露糖型N-糖链对低峰度其他N-糖链有着明显的抑制作用，使得低峰度N-糖链信息的丢失，不能够获得完整N-糖链信息。对糖组学研究来说是十分不利的。
[0003]本发明应用凝集素分离富集高甘露糖型N-糖链与非高甘露糖型N-糖链的方法，达到分离富集不同类型N-糖链的目的，获得更完整丰富的糖链信息。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是分离、富集不同类型N-糖链以获得更完整丰富的糖链信息。
[0005]为此，本发明提供了一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法，尤其是一种以刀豆凝集素分离富集高甘露糖与非高甘露糖型N-糖链并以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)鉴定糖链结构的方法；是向变性蛋白中加入ConA，使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合，然后通过糖肽酶F (PNGase F)释放全部N-糖链，离心收集未与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；再利用竞争性抑制剂将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性洗脱下来并收集；最后，对收集的糖链进行除盐纯化处理、MALD1-T0F/T0F质谱解析。
[0006]所述变性蛋白是将待检测样品蛋白质加入到超滤管中，用二硫苏糖醇及碘乙酰胺使之变性。
[0007]所述竞争性抑制剂优选α -甲基-甘露糖。
[0008]所述方法优选以下步骤:(1)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集:将糖蛋白加入超滤管中，采用尿素初步变性，然后通过二硫苏糖醇及碘乙酰胺进一步使蛋白变性，向变性蛋白中加入ConA，使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合，然后加入糖肽酶F释放全部的N-糖链，离心收集未与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；(2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集:向仍与ConA结合并留在超滤管滤膜上的高甘露糖型N-糖链中添加α -甲基-甘露糖，将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性替换下来，通过离心收集高甘露糖型N-糖链；
(3)糖链的除盐纯化:利用S印harose 4B对糖链进行纯化；(4)MALD1-T0F/T0F质谱解析。
[0009]所述糖蛋白优选鸡卵清白蛋白。
[0010]所述方法进一步优选以下步骤:
[0011](I)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集:
[0012]取l_2mg蛋白加入超滤管中，14000g离心浓缩至50yL左右，直接加300 μ L的8Μ尿素,充分混勻，14000g离心15min。再加入200 μ L8M尿素溶液至超滤管，14000g离心15min。弃去收集管中的流出液，加入150 μ L的1mM DTT充分混匀，56°C孵育45min，14000g离心lOmin,加入150 μ L20mM的IAM充分混勻，暗处孵育20min, 14000g离心lOmin。弃去收集管中的流出液。加入 150 μ L偶联缓冲液(0.lmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, lmmol/LCaCl2, lmmol/L MgCl2, lmmol/L MnCl2, pH7.4)至超滤管中，14000g 离心 lOmin,重复加入偶联缓冲液并离心3次，弃去收集管中的流出液。加入500 μ g ConA凝集素于37°C静置孵育3h, 14000g离心lOmin，加入用150 μ L的40mM NH4HCO3至超滤管中，14000g离心1min重复加入NH4HCO3并离心3次，弃去收集管中的流出液，换新的收集管。加入用300 μ L的40mMNH4HCO3 溶解的 PNGase F(300000U/mL)充分混匀，37°C静置孵育 12h，14000g 离心 lOmin，加200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin,重复加入超纯水并离心一次,收集流出液，冷冻干燥得到干燥的糖链以便除盐操作。
[0013](2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集:
[0014]向原超滤管中加入300 μ L0.5Μα -甲基-甘露糖洗脱液，于37°C静置孵育3h，14000g离心lOmin，加200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin，重复加入超纯水并离心一次，收集流出液，冷冻干燥得到干燥的糖链以便除盐操作。
[0015](3)糖链的除盐纯化:
[0016]加100 μ L的Sepharose 4Β分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5:I:1的正丁醇:甲醇:水溶液lmL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。分别向步骤(I)、(2)获得的冻干的糖链样品中加入500yL的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中混勻,25°C振荡反应lh。14000g离心15min,弃上清,重复加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液并离心3次。再加入1:1的甲醇:水溶液ImL摇勻，25°C振荡20min, 14000g离心15min收集上清样品并于冷冻干燥仪中冻干。
[0017](4)不同类型N-糖链MALD1-T0F/T0F质谱解析:
[0018]应用Bruker Daltonics 公司的 ultrafIeXtreme MALD1-T0F/T0F-MS 解析蛋白样品中N-糖链。取5 μ L的50%的甲醇溶液完全溶解步骤(3)得到的冻干N-糖链，取2 μ L糖链溶液点样于MTP Anchorchip384点的祀板上,真空抽干。再加I μ L的20mg/mL的基质DHB(2, 5-二羟基苯甲酸)至样品板上，真空抽干。以反射阳性离子模式鉴定多糖，分子量检测范围为700-5000，用校正混合物作为外标校正质谱仪。
[0019]数据分析:将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6。将所得糖链的m/z和信号强度结果导出成.txt格式,结合Glycoworkbench软件分析。分析参数为:选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为IDa，碎片离子容忍度为0.0Ta，获得一级糖链结构。
[0020]本发明技术原理:蛋白样品与ConA在1KD滤膜上结合，其中高甘露糖型糖蛋白结合ConA，非高甘露糖型糖蛋白未与ConA结合，经过PNGase F释放全N-糖链；由于非高甘露糖型N-糖链未与ConA结合，通过离心，于收集管中收集，相反，高甘露糖型N-糖链与ConA结合分子量大于10KD，离心后还留在滤膜上，通过加入α-甲基-甘露糖(与ConA有极强的结合作用，可以竞争性洗脱高甘露糖型N-糖链)将高甘露糖型N-糖链从ConA上释放，通过离心将高甘露糖型N-糖链收集，进而分离富集不同类型N-糖链用于结构解析。
[0021]本发明相比现有技术的改进之处:本发明以刀豆蛋白A分离、富集高甘露糖与非高甘露糖型N-糖链，以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)进行鉴定的方法。对鸡卵清白蛋白的结构鉴定结果表明:对照组鉴定出23种N-糖链，而经ConA分离富集后则多鉴定出6种N-糖链结构，高甘露糖型与非高甘露糖型两部分共鉴定出29种N-糖链。可见本发明方法具有更高的灵敏度及更丰富的糖链信息，能降低高峰度的高甘露糖型N-糖链对低峰度其他N-糖链的抑制作用，用以获得更完整丰富N-糖链信息，对于低峰度糖链的鉴定有突出优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1:对照组、高甘露糖型及非高甘露糖型部分N-糖链结构及分子量
【具体实施方式】
[0023]鸡卵清白蛋白(Ovalbumin)购自Sigma-Aldrich 公司。
[0024]试剂:尿素、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵、甲醇、正丁醇、Sepharose 4B均购于Sigma-Aldrich,刀豆蛋白 A 凝集素(ConA)购于 Vector labs。
[0025]仪器:ultrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)，德国Bruker公司；离心浓缩仪，美国Iabconco公司。
[0026]实施例1鸡卵清白蛋白的N-糖链结构解析
[0027]1、利用ConA分离、富集高甘露糖型N-糖链与非高甘露糖型N-糖链
[0028](I)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集:
[0029]取标准蛋白(鸡卵清白蛋白)100yg加入超滤管中，直接加300yL的8M尿素，充分混匀，14000g离心15min。再加入200 μ L8M尿素溶液至超滤管，14000g离心15min。弃去收集管中的流出液，加入150 μ L的1mM DTT充分混匀，56°C孵育45min，14000g离心lOmin，加入150 μ L20mM的IAM充分混匀，暗处孵育20min，14000g离心lOmin。弃去收集管中流出液。加入 150 μ L偶联缓冲液(0.lmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2, lmmol/L MnCl2, pH7.4)至超滤管中，14000g离心lOmin,重复加入偶联缓冲液并离心3次，弃去收集管中流出液。加入500 μ g ConA凝集素于37°C静置孵育3h，14000g离心1min加入用150 μ L的40mM NH4HCO3并离心3次。弃去收集管中流出液。换新的收集管。加入用300 μ L溶解的PNGase F(300000U/mL)充分混匀，37°C静置孵育12h，14000g离心1minJP 200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin，重复加入超纯水并离心一次，收集流出液，冷冻干燥。
[0030](2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集:
[0031]向原超滤管中加入300 μ L0.5M α -甲基-甘露糖洗脱液，于37°C静置孵育3h，14000g离心10min，加200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复加入超纯水并离心一次，收集流出液，冷冻干燥。对照组为10yg鸡卵清白蛋白未经过ConA进行富集，蛋白质变性后直接经过PNGase F酶解。
[0032](3)糖链的纯化:
[0033]加100 μ L的Sepharose 4Β分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5:I:1的正丁醇:甲醇:水溶液ImL,混合混匀，12000g离心5min,弃上清,重复清洗2次。向冻干的糖链样品中加入500μ L的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上样至S印harose 4B的离心管中混匀，25°C振荡反应Ih0 14000g离心15min，弃上清，重复加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液、离心3次。再加入1:1的甲醇:水溶液ImL摇匀，25°C振荡20min，14000g离心15min收集上清样品并于冷冻干燥仪中冻干。
[0034]2、不同类型N-糖链MALD1-T0F/T0F质谱解析:
[0035]应用Bruker Daltonics 公司的 ultrafIeXtreme MALD1-TOF/TOF-MS 解析样品蛋白中N-糖链。取5 μ L的50%的甲醇溶液完全溶解冻干N-糖链，取2 μ L糖链溶液点样于MTP Anchorchip384点的祀板上,真空抽干。再加I μ L的20mg/mL的基质DHB至样品板上，真空抽干。以反射阳性离子模式鉴定多糖，分子量检测范围为700-5000，用校正混合物作为外标校正质谱仪。
[0036]将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6。将所得糖链的m/z和信号强度结果导出成.txt格式，结合Glycoworkbench软件分析。分析参数为:选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为IDa，获得一级糖链结构。将一种N-糖链的信号强度与该样品中全N-糖链信号强度之和的比记为相对强度(Relative Intensity)。
[0037]经过ConA富集后，从图1可见，高甘露糖型部分中的高甘露糖型N-糖链的信号强度比对照组与非高甘露糖型部分该糖链信号强度高(例如:m/zl257.477,1419.526，1581.834) ,m/z 1744.625及1905.825 (高甘露糖型N-糖)两种N-糖链的信号强度也要明显高于非高甘露糖型部分，可见ConA凝集素对高甘露糖型N-糖链的富集是十分明显及有效的。高甘露糖型与非高甘露糖型两部分中一些糖链没有在对照组中有检测到，可见相同含量的鸡卵清白蛋白中全N-糖链经过ConA分离富集后糖链信息更丰富更灵敏。
[0038]且由表1可知，对照组共鉴定23种N-糖链，经ConA富集的高甘露糖型N-糖链部分共鉴定20种N-糖链，非高甘露糖型N-糖链部分共鉴定26种N-糖链，两部分共鉴定出29种N-糖链，比ConA富集前多鉴定6种N-糖链，具有更高的灵敏度及更丰富的糖链信息对于低峰度糖链的鉴定有明显优势。
[0039]表1:对照组以及经过ConA分离富集的高甘露糖型、复杂型杂合型N-糖的相对分子质量及结构
[0040]
【权利要求】
1.一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法，其特征在于，向变性蛋白中加入刀豆凝集素，使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合，然后加入糖肽酶F释放全N-糖链，离心收集与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；再利用竞争性抑制将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性洗脱下来并收集；最后，对收集的糖链进行除盐纯化处理、MALD1-T0F/T0F质谱解析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将样品蛋白质加入到超滤管中，用二硫苏糖醇及碘乙酰胺使之变性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述竞争性抑制剂是α-甲基-甘露糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集:将蛋白加入超滤管中，采用尿素初步变性，然后通过二硫苏糖醇及碘乙酰胺进一步使蛋白变性，向变性蛋白中加入ConA，使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合，然后加入糖肽酶F释放全部的N-糖链，离心收集未与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；(2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集:向仍与ConA结合并留在超滤管滤膜上的高甘露糖型N-糖链中添加α -甲基-甘露糖，将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性替换下来，通过离心收集高甘露糖型N-糖链；(3)糖链的除盐纯化:利用Sepharose 4Β对糖链进行纯化；(4)MALD1-T0F/T0F 质谱解析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，非高甘露糖型N-糖链的分离、富集采用如下具体步骤: 取l_2mg蛋白加入超滤管中，14000g离心浓缩至50yL，直接加300yL的8M尿素，充分混匀，14000g离心15min ;再加入200 μ L8M尿素溶液至超滤管，14000g离心15min，弃去收集管中的流出液； 力口入ΙδΟ μ L的1mM DTT充分混匀，δ6 °C孵育45min，14000g离心lOmin，力口入150 μ L20mM的IAM充分混匀，暗处孵育20min，14000g离心lOmin，弃去收集管中的流出液；加入150 μ L偶联缓冲液至超滤管中，14000g离心lOmin，重复加入偶联缓冲液并离心3次，弃去收集管中的流出液；所述偶联缓冲液组成为:0.lmol/L Tris-HClU50mmol/L NaCl、lmmol/L CaCl2> lmmol/L MgCl2> lmmol/L MnCl2, pH7.4 ； 加入500 μ g ConA于37 °C静置孵育3h，14000g离心lOmin，加入用150 μ L的40mMNH4HC03至超滤管中，14000g离心1min重复加入NH4HCO3并离心3次，弃去收集管中的流出液，换新的收集管；加入用300 μ L的40mM NH4HCO3溶解的PNGase F充分混匀，37°C静置孵育12h，14000g离心lOmin，加200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin，重复加入超纯水并离心一次，收集流出液，冷冻干燥得到非高甘露糖型N-糖链。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高甘露糖型N-糖链的分离、富集采用如下具体步骤: 向原超滤管中加入300 μ L0.5Μα -甲基-甘露糖洗脱液，于37°C静置孵育3h，14000g离心1011^11，加20(^1^超纯水至超滤管中，1400(^离心lOmin，重复加入超纯水并离心一次，收集流出液，冷冻干燥得到高甘露糖型N-糖链。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，糖链的除盐纯化采用如下具体步骤: 加100 μ L的S印harose 4B分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次；再向各离心管中加入5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液lmL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次；分别向冻干的糖链样品中加入500 μ L的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上样至S印harose 4B的离心管中混匀，25°C振荡反应Ih ;14000g离心15min，弃上清，重复加入lmL5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液并离心3次；再加入1:1的甲醇:水溶液ImL摇匀，25°C振荡20min，14000g离心15min收集上清样品并于冷冻干燥仪中冻干。
8.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，MALD1-T0F/T0F质谱解析步骤为:将冻干纯化的N-糖链溶解于50%的甲醇溶液，点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加基质2，5-二羟基苯甲酸至样品板上，真空抽干；以反射阳性离子模式鉴定多糖，分子量检测范围为700-5000，用校正混合物作为外标校正质谱仪。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括数据分析:将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6 ;将所得糖链的m/z和信号强度结合Glycoworkbench软件分析；分析参数为:选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+,电荷最多为+1，前体离子容忍度为IDa，碎片离子容忍度为0.5Da0
【文档编号】G01N30/08GK104133027SQ201410291021
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】关锋, 杨刚龙, 谭增琦, 李想, 郭佳, 庞星辰 申请人:江南大学