罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白氨基酸序列、编码基因、重组表达载体、重组表达载体的工程菌和罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法；本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了罗非鱼sIgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM），分离纯化方便、操作简单、成本低廉、适合大规模扩大生产；产品经免疫新西兰兔获得了高效价、高特异性、高亲和性抗抗体，可用于ELISA和Western-Blot的实验要求。本发明兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备与特性分析，为罗非鱼病原菌和病毒的检测、疫苗的研制、免疫水平检测和免疫检测方法的建立都提供了重要的材料，具有重要的生产价值和广阔的应用前景。
【专利说明】罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种通过原核表达来生产罗非鱼SlgM截 短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其该抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 罗非鱼（Tilapia)是一种淡水鱼类，属于丽鱼科（Cichlidae)，是非洲和中东特有 的鱼种，具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，现已经成为21世纪全球水产养 殖业最重要的养殖品种之一。中国的罗非鱼养殖产量占世界的一半以上，每年罗非鱼出口 额超过7亿美元，出口量超过20多万吨(折合活鱼60多万吨)。罗非鱼具有极强的抗病能力， 曾被认为对细菌性、寄生虫性、真菌性和病毒性疾病都具有比其它鱼类更强的抵抗力。然而 近年来，研究发现罗非鱼对某些细菌和寄生虫病原都表现敏感，如链球菌、柱状黄杆菌、嗜 水气单胞菌、爱德华氏菌、小瓜虫、车轮虫、三代虫等。
[0003] 免疫球蛋白是免疫系统中重要的组成成分，是病原诊断和疫苗评价的重要指标。 罗非鱼 IgM 具有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM)和膜结合型（Membrance-bound, mlgM)两种形式，其重链（IgH)由相同基因编码但编码的恒定区不完全相同。分泌型IgM具 有4个恒定区，而膜结合型IgM则由3个恒定区和一个位于CH3下游的跨膜组成。slgM由 浆细胞产生分泌于血液和体液中，是机体进行体液免疫中的重要组成部分，在研究鱼类病 害防治及免疫预防方面具有重要意义。目前，国内外关于抗罗非鱼IgM抗体甚少，虽然国外 已有鼠抗罗非鱼IgM的单克隆抗体，但价格十分昂贵且保质期短。此外，自制单克隆抗体不 仅技术要求高、实验仪器高而且成本昂贵；而直接从罗非鱼血清中提取IgM，不仅难以保证 纯度，而且需要大量的血液，违背了动物福利。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种原核表达罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM)的 方法，采用该方法制备的dsIgM产量高、成本低、操作简单、免疫原性好。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0006] 1、一种罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 2、一种罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，该编码基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 3、一种含有编码基因的重组表达载体。
[0009] 4、一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。
[0010] 5、罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0011] (1)将该截短重链恒定区基因（dsIgM)与pET32a构建为表达载体 PET32a-dsIgM ;
[0012](2)将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，构建表达工程菌；
[0013] (3)发酵培养表达工程菌,进行IPTG诱导表达；
[0014] (4)发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白（dsIgM);
[0015] (5)该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体；
[0016] (6)该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot -抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非 鱼血清，测定其特异性；
[0017] (7)该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。
[0018] 进一步的，所述步骤（1)包括：以罗非鱼血液为材料提取总RNA，以mRNA为模版合 成第一条cDNA ;
[0019] 设计两条引物：
[0020] Pl :5，-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3'
[0021] P2 :5' -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3'
[0022] 其中下划线为BamH I和xhol I酶切位点，以该cDNA为模版，通过PCR扩增得 到编码SlgM的截短重链恒定区蛋白（dsIgM)的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒 pET32a连接，构建表达载体pET32a-dsIgM。
[0023] 进一步的，所述步骤（3)包括：采用LB培养基，37°C发酵培养表达工程菌至0D_达 到0. 6,加入终浓度为lmmol/L的IPTG，37°C诱导表达4h。
[0024] 进一步的，所述步骤（6)包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血液进行 SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。
[0025] 进一步的，所述步骤（7)包括：用纯化罗非鱼血清作为抗原，按50li g/ml、25li g/ ml、12. g/ml、6. 25ii g/ml、3. 12ii g/ml、l. 56ii g/ml 和 0? 78ii g/ml 包被 ELISA板，将步骤 (5)中的兔抗 dsIgM 抗体按 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、 1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的比例倍比稀释作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二 抗，进行亲和常数测定。
[0026] 本发明的有益技术效果是：本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表 达了罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM)，分离纯化方便、操作简单、成本低廉、适合 大规模扩大生产。产品经免疫新西兰兔获得了高效价、高特异性、高亲和性抗抗体，可用于 ELISA和Western-Blot的实验要求。本发明兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备与特性分 析，为罗非鱼病原菌和病毒的检测、疫苗的研制、免疫水平检测和免疫检测方法的建立都提 供了重要的材料，具有重要的生产价值和广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0028] 图1是罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM)表达载体重组质粒 pET32a-dsIgM的构建示意图；
[0029] 图2是表达蛋白的SDS-PAGE图，其中蛋白MarkerIII的分子量大小为94KDa，（由 上至下依次为94、60、45、27、18、）；1 :纯化的dsIgM ;2 :pET32a诱导前对照；3 :pET32a诱导 后对照；4 :PET32a-dsIgM诱导前对照；5 :PET32a-dsIgM诱导后对照；
[0030] 图3是免疫印迹分析兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体特异性，I =Marker ;2:鲤鱼血 清；3 :鲫鱼血清；4 :斑点叉尾鮰血清；5 :罗非鱼血清；
[0031]图4是兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体亲和常数的测定，C=180(V(100X Iog2X)，Y轴 为OD值。
【具体实施方式】
[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施实例1
[0034] 本实施提供原核表达罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白（dsIgM)的方法，步骤如下 所示：
[0035] (1)采集罗非鱼血液，采用总RNA提取试剂盒提取罗非鱼RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA;
[0036](2)选择slgM重链区域CH1-4核酸序列，利用Primer5. 0设计一对特异性引物， Pl :5' -GGATCCGCCACTTCAACTGC-3'，P2 :5' -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3'，上游引物包 含BamH I酶切位点，下游引物包含xholI酶切位点，该引物可扩增出slgM基因截短重链 基因（dsIgM)，片段大小为1338bp(序列如SEQ ID NO. 2所示）；
[0037] (3)回收dsIgM基因的PCR产物，构建pMD19-T_dsIgM载体，克隆dsIgM基因后构 建 PET32a-dsIgM，转化入大肠杆菌BL21 (DE3)(载体构建见图1);
[0038] (4)含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养BL21-pET32a-dsIgM培养约3-4h至 菌液〇D_值达到0. 6,加入IPTG=L OmM，进行诱导表达，4h后离心收集菌体，取表达产物加 入5 ii L5XLoadingBuffer煮沸后取10 ii L进行SDS-PAGE电泳检测（蛋白表达见图2);
[0039] (5)菌体超声破碎后，4°C，12000r/min离心lOmin，分别将表达蛋白可溶部分和包 涵体溶解液溶解部分用镍离子柱亲和层析纯化，透析复性后，用核酸蛋白仪测定蛋白的浓 度为2. 19mg/ml，并将重组蛋白置-70°C保存备用。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施提供兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体的制备方法，步骤如下所示：
[0042] (1)第一次免疫时，按Img/只SPF新西兰兔的免疫剂量，取步骤（4)纯化的罗非 鱼dsIgM与弗式完全佐剂混合，充分乳化后在新西兰兔足趾、脊部皮下进行多点注射免疫， 10-14天后进行第二次、第三次免疫，第二、三次免疫是将纯化的dsIgM按2mg/只与等体积 不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，在新西兰兔背部皮下多点注射，每次注射间隔7天。第四 次是将纯化的dsIgM按2mg/只直接耳缘静脉注射；
[0043] (2)第四次免疫后3-4天，对免疫的新西兰兔进行心脏采血，收集、纯化得到兔抗 罗非鱼dsIgM的多克隆抗体，浓度为I. 800mg/ml。
[0044] 实施例3
[0045] 本实施提供Western-Blot检测兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体特异性的方法，步骤 如下所示：
[0046] (1)采集鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰和罗非鱼血液，血液于37 °C静置4h后凝固， 5000r/min离心15min收集血清；
[0047] (2)上述血清运用12%浓度的凝胶进行SDS-PAGE，电泳分离后，转移至PVDF膜 上，用3%BSA/TBST封闭，以本发明步骤（5)中兔抗dsIgM抗体为一抗I :1000稀释后，4°C 孵育过夜；洗膜后，以羊抗兔IgG-HRP为二抗，37°C孵育Ih ;用DAB进行显色lOmin，CldH2O 终止显示反应。观察Western-blot结果，判断兔抗dsIgM多克隆抗体具有良好的特异性 (Western-Blot 见图 3)。
[0048] 实施例4
[0049] 本实施提供兔抗罗非鱼dsIgM多克隆抗体亲和常数的测定方法，步骤如下所示：
[0050] (1)收集罗非鱼血清，用亲硫树脂纯化罗非鱼IgM，用核酸蛋白仪测定IgM浓度；
[0051] (2)将纯化的罗非鱼血清用碳酸盐缓冲液稀释至50 ii g/ml、25ug/ml、12. 5 ii g/ml、 6. 25 ii g/ml、3. 12 ii g/ml、I. 56 ii g/ml 和 0? 78 ii g/ml，100 ii L/孔加入到 96 孔聚苯乙烯酶联 反应板中，4°C包被过夜；
[0052] (3)用 PBST 洗涤包被板后，分别按 I :100、1 :200、1 :400…I :6400…I :28400 的比 例倍比稀释本发明步骤（5)中兔抗dsIgM多克隆抗体，按100 y L/孔加入上述96孔板；
[0053] (4)用PBST洗涤包被板后，加入I:2000稀释的羊抗兔IgG-HRP，IOOiiL/孔，37°C 作用30min ;
[0054] (5)用PBST洗涤包被板后，加入TMB底物显色液，IOOii L/孔，室温避光反应 15min。加入2MH2S04终止反应，100 ii L/孔，置酶标仪上测定每孔的OD45tlnm值。
[0055] (6)运用EXCEL软件，以Iog2 (0.18/C)为X轴，OD45tlnm值为Y轴，拟合结合反应曲 线模型(拟合曲线见图4)。
[0056](7)按照亲和常数Kaff=(n-l)/2(n[Ab']t_[Ab]t)计算抗体相对亲和常数。式中， n=[Ag]t/[Ag' ]t，其中[Ag]dP [Ag' 1为酶标板上每孔的固定化抗原浓度，[AbiUP [Ab' ] t为相应固化抗原浓度时最大吸光值一半（0D50和0D50'）时所对应的可测量抗体浓度。得 出亲和常数 kaff=l. 179X 108L/mol。
[0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0058] SEQUENCELISTING <110>四川农业大学 <120〉罗非鱼SlgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体及其制备方法<130〉权利要求丨5、说明书 <160 4 <170> PatentIn version 3.5 <210>1 <211〉 442 <212> PRT <213> SEQ ID NO. 1 <400> 1 Ala Thr Ser Thr Ala Pro Thr Val Phe Pro Leu Val Pro Cys Ser Thr 15 10 15 Glu Ser Gly Asp Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr Gly Phe Asn 20 25 30 Pro Pro Ala Val Thr Phe Ser Trp Thr Lys Gly Gly Ala Ala Leu Thr 35 40 45 Asp Phe lie Gln Tyr Pro Ser Val Gln Lys Gly Asn Val Tyr Thr Gly 50 55 tiO Val Ser Gln Yal Gln Val Arg Lys Gln Asp Trp Asp Thr Arg Gln Asn 65 70 75 30 Val Gln Cys Val Val Asn His Ala Ala Gly Asn Ala Gln Thr Pro He 8b 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe I.ys Gln Asn Pro Thr Leu Lys Ala Phe
[0059] ioo 105 no Ser Ser Ser Ser Asp Glu Asp Arg Thr Tyr Thr Ala Ser Cys Phe Ala 115 120 125 Lys Glu Phe Ala Pro Lys Asn His Asn Leu Lys Trp Leu Lys Asn Gly 130 135 140 Ala Asp lie Thr Asp Lys He Asp Leu Thr Glu Thr Val Tyr Glu Ser 145 150 15b 160 Lys Asn Ala Ala Gly Lys Thr Val Tyr Asn Ala Val Ser Phe Leu Thr Ibo 170 175 Val Asn Ser Thr Gly Leu Lys Glu Lys Thr He Phe Met Cys Leu Phe 180 185 iyu Thr Gly Gly Glu Asp Ala Ser Leu Asn Lys Thr Val Ala Tyr Lys Asp 195 200 205 Asn Thr Pro Asp Pro Lys Pro Cys Ser Ser Ser Asp Val Lys Ala Leu 210 215 220 He Phe Gly Pro Thr Thr Lys Asp Met Leu Phe Asn Lys Lys Gly Thr 225 230 235 240 lie Thr Cys Lys Val Met Ala Glu Asn Lys Lys Leu Asn lie Thr Trp 245 250 255 Glu Asp Glu Glu Gly Asn Asp Met Ala Ser Lys Pro He Thr Pro Ala 260 265 270 Asn Gly Met Gln Asn Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Asp lie Thr Tyr Asp 275 280 285 Giu Trp Thr Arg Gly Vai Lys Arg Phe Cys Val Va丄His His Gln Asp 290 295 300
[0060] Leu ile Glu Pro Leu Arg Giu Pro Tyr Glu Axg Asp Phe Gly Gly Asn 305 310 315 320 Pro Gln Arg Pro Ser Val Phe Met Leu Pro Pro Leu Glu Gln Thr Asn 325 330 335 Lys Ala Glti Val Thr Leu Thr Cys Phe Vai Lys Asp Phe Phe Pro Lys 340 345 3b0 Glu Val Phe Val Ser Trp Leu Val Asp Asp Glu Glu Ala Asp vSer Ser 355 360 365 Tyr Ala Phe Asn Thr Thr Glu Pro He Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Ser 370 375 380 Ala Tyr Gly Gln Leu Phe Val Ser Leu His Gln Trp Gln Arg Asp Asp 385 390 395 400 Ala Val Tyr Ser Cys Val Val Tyr His Glu Ser Val Val Asn Thr Thr 405 410 415 Arg Ala He Val Arg Ser He Gly Tyr Arg Thr Phe Asp Lys Asn Arg 420 425 430 He Asp Leu Asn Met Asn He Asn Gln Asp 435 440 <210>2 <211〉 1326 <212> DM <213〉SEQ ID NO. 2 <400〉 2 gccacttcaa ctgoaccoac tgtgtttcot otggtaocat gtagoactga gagcggagat 60
[0061] atggtcaoto ttggctgcct tgccactggc ttta,a.cnctx ctgcagtgac tttctcgtgg 120 accaaaggcg gcgctgcctt gacagatttc atccagtacc cttoagtaca gaaaggcaat 18U gtttatactg gagtcagtca agtccaagtg aggaaacagg actgggatac acgacagaat 240 gtccaatgtg ttgtgaatca cgctgctggg aatgcacaga ctcctatccc accaccacca 300 ccgccattta agcagaatcc aactcttaaa gcgttttcct cctcttctga tgaggaccgt 360 acctatactg cctcctgctt tgccaaagag tttgcaccaa agaaccataa cttaaaatgg 420 ctgaaaaatg gagcagacat caccgacaaa atagatctga ccgaaacagt ttatgaatca 480 aaaaatgcgg ctggaaaaac agtgtacaat gcagtaagtt ttctcacagt aaattccact 540 ggcctgaaag agaagactat atttatgtgt ctctttaccg gaggagaaga tgcatctttg 600 aacaaaactg tggcttacaa agacaatacg ccagatccta aaccatgtag ttcgtcagat 660 gtgaaggcac taatttttgg ccccacaacc aaggacatgc ttttcaataa aaaaggaact 720 ataacatgta aagtcatggc ggaaaataaa aaactcaata taacttggga agatgaggaa 780 ggaaatgaca tggcgagtaa gccaataaca ccagccaatg gcatgcagaa cgcatacaaa 840 tctgaacttg acatcaccta tgatgaatgg accagggggg taaaacgctt ctgtgttgtt 900 caccaccaag acttgattga gcctttgagg gaaccttatg aaagggattt cggaggaaac 960 cctcagcgcc cgtcagtgtt tatgctccct cctttagaac aaactaacaa agcagaggtg 1020 accctgactt gctttgtgaa agacttcttc cctaaggagg tttttgtgtc ttggcttgtg 1080 gatgacgagg aagcagactc aagttatgct tttaatacca cagaacccat tgaaaacaat 1140 ggattctatt ctgcttatgg ccagttattt gtcagccttc accagtggca aagggatgat 1200 gctgtctata gctgtgtagt gtaccatgaa tctgtggtta acacaactag agctattgtc 1260 aggtccattg ggtacagaac atttgacaaa aaccgcattg acctcaacat gaacatcaac 1320 caagac 1326 <210> 3 <211〉 20[0062] <212> DNA <213〉引物 Pl <400〉 3 ggatccgcca cttcaactgc 20 <210> 4<211〉 22 <212〉 DNA <213〉引物 P2 <400> 4 ctcgaggtct tggttgatgt tc 22
【权利要求】
1. 一种罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体，其特征在于，该蛋白氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -种罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白的编码基因，其特征在于，该编码基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3. -种含有编码基因的重组表达载体。
4. 一种含有权利要求3中所述的重组表达载体的工程菌。
5. 罗非鱼slgM截短重链恒定区蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 将该截短重链恒定区基因与pET32a构建为表达载体PET32a-dsIgM ; (2) 将pET32a-dsIgM表达载体转化入大肠杆菌BL21，构建表达工程菌； (3) 发酵培养表达工程菌，进行IPTG诱导表达； (4) 发酵产物经亲和层析得到纯化的截短重链恒定区蛋白； (5) 该dsIgM免疫新西兰兔，收集血清，用饱和硫酸铵法纯化兔抗dsIgM抗体； (6) 该兔抗dsIgM抗体作为Western-Blot -抗结合鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼血 清，测定其特异性； (7) 该兔抗dsIgM抗体用于非竞争ELISA，检测其亲和常数。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)包括：以罗非鱼血液为材 料提取总RNA，以mRNA为模版合成第一条cDNA ; 设计两条引物： PI ：5/ -GGATCCGCCACTTCAACTGC-3' P2 ：5/ -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3' 其中下划线为BamH I和xhol I酶切位点，以该cDNA为模版，通过PCR扩增得到编码 slgM的截短重链恒定区蛋白的DNA片段，测序确认后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建 表达载体 pET32a_dsIgM。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)包括：采用LB培养基， 37°C发酵培养表达工程菌至0D_达到0. 6,加入终浓度为lmmol/L的IPTG，37°C诱导表达 4h。
8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6)包括：采集鲤鱼、鲫鱼、斑 点叉尾鮰、罗非鱼血液进行SDS-PAGE，运用Western-Blot检测兔抗dsIgM抗体的特异性。
9. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7)包括：用纯化罗非鱼血 清作为抗原，按 50 μ g/ml、25 μ g/ml、12. 5 μ g/ml、6. 25 μ g/ml、3. 12 μ g/ml、1. 56 μ g/ml 和 0. 78μ g/ml 包被 ELISA 板，将步骤（5)中的兔抗 dsIgM 抗体按 1:100、1:200、1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 的比例倍比稀释 作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二抗,进行亲和常数测定。
【文档编号】C12N15/70GK104262485SQ201410149405
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】汪开毓, 贺扬, 陈德芳, 杨倩, 耿毅, 王二龙 申请人:四川农业大学