高活性糖蛋白加工条件及其有效生产方法
【专利摘要】本发明涉及具有特定唾液酸化程度的高活性糖蛋白，一种含该糖蛋白的用于诊断或治疗的药用组合物，一种鉴定高活性糖蛋白及确定其生产条件的方法，一种生产高活性糖蛋白的方法和一种用于分泌性糖蛋白不同唾液酸化的方法。本发明还涉及将重组表达高活性糖蛋白用于生物学目的和预防和/或治疗或诊断疾病，尤其是骨髓移植、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、AML及骨髓增生异常综合征、癌症、HIV和/或造血系统疾病。
【专利说明】高活性糖蛋白加工条件及其有效生产方法
[0001]本申请是申请日为2005年2月14日，申请号为200580004806.7，发明名称为“高
活性糖蛋白加工条件及其有效生产方法”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本发明涉及具有最佳唾液酸化程度的高活性糖蛋白，一种含该糖蛋白的用于诊断或治疗的药用组合物，一种测定高活性糖蛋白及其生产条件的方法，一种生产高活性糖蛋白的方法和一种用于分泌性糖蛋白不同唾液酸化的方法。本发明还涉及重组表达的高活性糖蛋白为生物学目的以及在预防和/或治疗或诊断疾病中的应用，所述疾病尤其是骨髓移植、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、AML及骨髓增生异常综合征、癌症、HIV和/或造血系统疾病。
[0003]糖蛋白是一组彼此功能和产生都大不相同的蛋白。在具有治疗潜能的蛋白质中，大多数蛋白质为糖基化蛋白，例如许多激素(如生长激素(Growth hormone)、胰高血糖素(Glycagon)、FSH及LH)、生长因子(如GM-CSF、G-CSF, VEGF及促红细胞生成素(Erythopoietin))、细胞因子(如IL-2、IL-7、干扰素-α及干扰素-β、TNF_a )、抗凝血剂(如重组水蛭素(Lepirudin)、地西卢定(Desirudin))、血液凝固因子(如因子VI1、VIII及IX)、疫苗(如乙型肝炎抗原)及抗体。为生产此类蛋白质，已建立的细胞生产系统不能够生产具有原始的人糖基化作用的蛋白质。原核细胞(如细菌)及大多数真核细胞系统(如酵母、昆虫及植物细胞)合成无糖基化作用或携带与人糖链大不相同的聚糖的蛋白质。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种常用的生产系统，它能够以与人细胞相似的方式对蛋白糖基化，但与人细胞还有某些重要差异，例如，在半乳糖基化作用、岩藻糖基化、使用N-乙酰葡糖胺的特殊糖基化中，以及尤其在 唾液酸化的各方面。
[0004]在建立这些生产系统的时候，生产至少在某种程度上具有活性的治疗蛋白是足够的。目前，很大努力集中在以下述目的改进治疗蛋白的活性:α)减少治疗蛋白的使用剂量的数目和浓度，Qi)减少治疗费用，以及Qii)减轻副作用。
[0005]其中一个策略是提高表达系统的生产力，然而，在大多数情况下，可导致不产生糖基化作用，或仅产生在大多数情况下与蛋白质无关的非常异常的糖基化作用。还会产生其它问题，例如稳定性降低及分子的折叠常导致在生产中需要其它步骤，这会浪费时间及成本并导致损失、副作用及生物活性欠佳。
[0006]改进蛋白质生物活性的主要策略是延长其血清半衰期并因此延长其生物利用度。这可通过被称为聚乙二醇化作用(PEGylation)的方法完成，其中某些形式的聚乙二醇被化学添加至所生产的蛋白质中。聚乙二醇(PEG)增加分子量并因此增加血清半衰期。然而，此方法存在一些问题，例如，在几乎所有情况下，聚乙二醇化作用通过其细胞效应子功能减小蛋白质的活性，作为中和抗体在人体中重复使用常导致不良免疫反应，和/或生产过程需要其它化学修饰，从而导致需要附加成本、损失及时间的多步骤过程。
[0007]另外，为提高重组表达蛋白的血清半衰期，糖链的修饰是问题的焦点。因此，技术问题集中在使重组糖蛋白的唾液酸化程度最大化。唾液酸是真核细胞表面分布最广的末端单糖，通常认为糖蛋白被唾液酸化程度越大，它在循环中的血清半衰期就越长。这是基于某些受体的存在，例如肝脏中的无唾液酸蛋白质受体，该受体结合循环的非唾液酸化蛋白并指导它们进入细胞进行降解。
[0008]已经提出了一些策略使重组糖蛋白的唾液酸化程度增加至最大可能的唾液酸化程度，包括(i)制备过量表达特定的唾液酸转移酶或半乳糖转移酶的重组宿主细胞系，其中这两种酶可为唾液酸化提供多数末端，(ii)通过调节糖水解酶(glycohydrolyticenzyme)防止宿主细胞唾液酸降解，如向培养基添加铜离子，(iii)在其它糖缀合物及其它底物存在下培养产生重组糖蛋白的宿主细胞，以增加寡聚糖的产生，(iv)变化培养条件，(v)使蛋白质发生突变，以引入其它糖链，并因此引入更多唾液酸，以及(vi)在糖蛋白生产后使用纯化的唾液酸转移酶完成活体外唾液酸化。所有这些技术具有一系列缺点，仅被设计用于通过使唾液酸化程度最大而增加血清半衰期。
[0009]如前所述，现有技术具有一系列关键性缺点，仅提供用于改进生物活性、减轻副作用或毒性的一小部分糖基化潜能，因此不能够将糖蛋白用于某些用途。现有技术几乎不具有糖蛋白的生物活性是否与唾液酸化程度有关的任何知识，这是因为对于相应的重组糖蛋白来说没有合适的试验和生产系统。
[0010]本发明通过下述方法提供高活性糖蛋白来解决这个问题，该方法包括以下步骤:在添加有一定浓度的至少一种唾液酸前体添加物的培养基中，使用一种表达细胞系表达所述高活性糖蛋白，所述表达细胞系携带唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷，并使用编码糖蛋白的核酸转染该表达细胞系，唾液酸前体添加物的浓度通过以下步骤确定:
[0011](i)通过使用不同浓度的至少一种唾液酸前体进行不同唾液酸化，表达所述糖蛋白的多种不同唾液酸化形式；
[0012](ii)使用合适的生物测定方法测定不同唾液酸化形式的活性，与参考糖蛋白进行对比；
[0013](iii)筛选较高/最高活性的唾液酸化形式并测定与所述糖蛋白的较高/最高活性水平相关的唾液酸前体添加物的浓度。
[0014]因此，本发明还涉及一种方法。
[0015]根据本发明，术语“参考糖蛋白”是具有与本发明糖蛋白相同或相似蛋白序列的糖蛋白，优选地是具有相同蛋白序列的糖蛋白。也可能缺乏糖基化结构。参考糖蛋白具有确定的活性，可为天然来源或重组表达产生。优选的参考糖蛋白为已知的重组糖蛋白。在现有技术的特定蛋白序列发生突变，导致活性提高，例如受体介导的体外活性提高的情况下，本发明较高活性糖蛋白可在此方面具有较高活性和/或在不提高此方面活性条件下提高了此方面与其它方面生物活性例如免疫原性的相对活性。在这些实例中，免疫原性的较高活性可有利于用于哺乳 动物，优选地为人，因此在本发明意义上等于较高活性的糖蛋白。本领域普通技术人员能够选择临床前和/或临床试验方案的合适选择标准。
[0016]根据本发明，术语“表达细胞系”是指可用于蛋白质、糖蛋白、病毒或其它生物材料表达的一种细胞或细胞系，可以进一步使用或不使用本领域普通技术人员已知或本发明其它部分描述的技术重组表达目的基因，或用病毒或本领域普通技术人员已知的适宜材料感染。
[0017]根据本发明，术语“携带唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷的表达细胞系”是指CMP-唾液酸合成有关的酶缺陷的表达细胞系。缺陷是指相应的酶活性减小或完全丧失，并可归因于不同的基本缺陷例如与其功能相关的酶基因水平、基因表达、酶活性或酶的生物利用度方面。酶例如为m)P-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、激酶(如N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶)、N-乙酰神经氨酸-9-P(Neu5Ac-9-P)合成酶、Neu5Ac-9-P-磷酸酯酶以及CMP-Neu5Ac合成酶。在唾液酸的糖核苷酸生物合成途径中，更优选的缺陷是差向异构酶的突变，甚至更为优选的是导致无mRNA表达的UDP-N-乙酰葡萄糖胺_2_差向异构酶的缺陷。
[0018]缺陷导致在标准条件下和/或无血清条件下细胞的唾液酸化减少或几乎完全或完全丧失。此减少的唾液酸化可通过添加唾液酸前体添加物部分或完全重建。该缺陷不限于CMP-唾液酸合成有关的一种或多种酶缺陷，也可存在于其它酶，只要通过添加唾液酸前体添加物能部分或完全重建该效果。本发明的一个实例(但不仅这一个)是作为CMP-唾液酸运载体的相应糖转运酶。本领域普通技术人员能够确定本发明哪种单个缺陷或多个缺陷的组合是合适的，其中某些缺陷在下文更详细描述。
[0019]根据本发明，术语“转染”是指本领域普通技术人员已知通过病毒感染或转染方法用于将遗传物质转移至细胞中以表达重组蛋白的方法，所述方法包括但不限于磷酸钙共沉淀、电穿孔术、与DEAE-葡聚糖或阳离子脂质试剂形成复合物，以及显微注射从而将核酸导入表达细胞系细胞中。
[0020]根据本发明，术语“编码糖蛋白的核酸”是指编码目的哺乳动物糖蛋白或其活性片段和/或突变体的核酸序列，借此可使用任何糖蛋白，优选地为任何人源糖蛋白。哺乳动物糖蛋白的实例包括以下分子，例如细胞因子及其受体(如肿瘤坏死因子TNF-α及TNF-β )、肾素、人生长激素及牛生长激素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、脂蛋白、a -1-抗胰蛋白酶、胰岛素A链及B链、促性腺激素(如促卵胞生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、促甲状腺激素及人绒毛膜促性腺激素(hCG))、降血钙素、胰高血糖素、凝血因子(如因子VIIIC、因子IX、因子VI1、组织因子及血管假性血友病因子)、抗凝血因子(如蛋白C)、心房利钠因子、肺表面活性物质、纤溶酶原活化因子(如尿激酶、人尿和组织型纤溶酶原激活剂)、铃蟾素、凝血酶、造血生长因子、脑啡肽酶、人巨噬细胞炎症蛋白、血清白蛋白如人血清白蛋白、苗勒氏抑制物质、松弛素A链及B链、松弛素原、小鼠促性腺素相关肽、血管内皮生长因子、激素或生长因子受体、整联蛋白、蛋白A及蛋白D、类风湿因子、神经营养因子(如骨源性神经营养因子、神经营养因子_3、神经营养因子_4、神经营养因子-5、神经营养因子-6及神经生长因子-β )、血小板源生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子(如TGF- α及TGF- β )、胰岛素样生长因子-1及胰岛素样生长因子_11、胰岛素样生长因子结合蛋白、⑶蛋白(如⑶_3、⑶-4、⑶-8及⑶-19)、促红细胞生成素(EPO)，骨诱导因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白、干扰素(如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-Y )、集落刺激因子(CSFjB M-CSF、GM-CSF及G-CSF)、白细胞介素(IL，如IL-1至IL-12)、超氧化物歧化酶、T-细胞受体、表面膜蛋白、衰变加速因子、抗体及免疫粘合素、血型糖蛋白A(Glycophorin A)、MUC1。
[0021]优选的糖蛋白选自血型糖蛋白A、EPO、G-CSF, GM-CSF, FSH、hCG、LH、干扰素、白细胞介素、抗体和/或其片段。
[0022]根据本发明，术语“糖蛋白”还被定义为病毒、病毒颗粒或病毒蛋白。
[0023]在本发明优选的实施方案中，核酸编码糖蛋白的分泌形式或其片段。在优选的实施方案中，分泌形式无跨膜结构域。在另一个优选的实施方案中，编码分泌形式的核酸含有至少一个分泌信号。在一个最优选的实施方案中，分泌信号来自GM-CSF。其它实施方案和细节在下文更为详细地描述。
[0024]根据本发明，术语“唾液酸前体添加物”是指能够部分或完全重建唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的缺陷，导致糖蛋白部分或完全唾液酸化的天然或合成化合物。在本发明优选的实施方案中，添加不同浓度唾液酸前体添加物产生一系列具有不同唾液酸化程度的糖蛋白的不同唾液酸化形式。因此，糖蛋白的唾液酸化形式可由单一糖形或一组糖形构成。这可通过使用单一唾液酸前体添加物或通过使用两种或更多前体添加物组合物来完成。在本发明一个优选的实施方案中，使用唾液酸中间体和/或携带唾液酸的糖蛋白作为唾液酸前体添加物。在另一个优选的实施方案中，唾液酸前体添加物为ManNAc、乙酰化ManNAc、过乙酰化ManNAc或胎球蛋白。在另一个优选的实施方案中，使用了 ManNAc、乙酰化ManNAc或过乙酰化ManNAc和胎球蛋白的组合。
[0025]优选的是产生具有天然唾液酸修饰的糖蛋白的唾液酸前体添加物。天然唾液酸修饰是在生物体中作为起始原料、中间糖形或终糖形的修饰。进一步优选的是天然糖蛋白，尽可能与天然存在于使用糖形的生物体中的糖形相近的糖基化形式。例如，具有与存在于人体或来源于人的生物物质相似的带有唾液酸的糖链的人糖蛋白糖形。所述优选形式不携带由不存在于生物体的非天然侧链修饰的唾液酸。例如，引入糖蛋白或糖脂的唾液酸不包括被置换、缺失、添加、延长或缩短的侧链，所述侧链可由化学合成和/或与不存在于生物体的唾液酸的新链接(interlinkage)引入。
[0026]在本发明的优选形式中，任何细胞产物的糖基化不是通过可导致非天然唾液酸修饰的化学工程前体或 代谢物来改变或修饰，而是通过最佳程度的天然糖基化，优选唾液酸化，来改变或修饰。化学修饰的唾液酸代谢物仅以不影响天然糖基化的方式被使用。例如，作为细胞培养基添加物的N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)可被乙酰化ManNAc或过乙酰化ManNAc代替，后二者较天然ManNAc更容易被细胞吸收。在细胞中，附加的乙酰基残基被裂解去除，ManNAc被加工用于CMP-唾液酸的生物合成。因此，经乙酰化ManNAc处理的细胞产生的糖蛋白不表现有任何合成修饰的糖，例如合成的乙酰化唾液酸。
[0027]根据本发明，术语“不同唾液酸化形式”是指与其它糖形至少相差一个唾液酸的糖蛋白的糖形。唾液酸的不同可表现在唾液酸的数量上和/或在分子其它部分至少一种唾液酸的位置上。具体的唾液酸化形式可由糖蛋白的单一糖形或几种糖形混合组成，借此不同唾液酸化形式在至少一种糖形和/或糖形的相对组成上会不同。
[0028]至少一种唾液酸化形式的唾液酸化程度可由本领域普通技术人员已知的生物化学和/或化学方法测定。例如，一种快速方法是使用唾液酸特异抗体或凝集素，例如SNA和MAA,或使用可识别无唾液酸聚糖的抗体，例如抗体A78-G/A7和Nemod-TFl或凝集素PNA使细胞或糖蛋白染色。可通过流式细胞术分析着色细胞，当糖蛋白被纯化时使用常规的ELISA分析着色的糖蛋白，或通过夹心ELISA使用糖蛋白特异抗体捕捉待分析的糖蛋白，以分析着色的糖蛋白。本领域普通技术人员已知的所有这些方法能够监测细胞或糖蛋白的不同唾液酸化作用，借此所结合的唾液酸特异抗体或凝集素的数量与结合至细胞或糖蛋白的唾液酸的数量呈正相关，而识别无唾液酸聚糖的结合抗体或凝集素的数量与结合至细胞或糖蛋白的唾液酸数量呈负相关。对唾液酸含量进行定量的另一种方法是通过使用神经氨酸酶酶裂解去除或通过酸性水解化学裂解去除所有结合至糖蛋白的唾液酸。然后通过使用1，2-二氨基-4，5-亚甲基二氧基苯(methylendioxybenzen) (DMB)的唾液酸突光染色和使用荧光检测器的HPLC分析测定样品中唾液酸浓度。另外，通过使在硫巴比妥酸盐和β-甲酰丙酮酸盐存在下将唾液酸转化为可在549nm使用比色法检测的粉红色染料对所释放的唾液酸量进行定量。为得到关于结合N-或O-聚糖的唾液酸的数量方面的数据，完整N-或O-聚糖被酶作用释放或化学释放。本领域普通技术人员可使用一些方法分析与分支程度(antennarity)有关的释放的聚糖(如通过HPAEC-PAD)、结合的唾液酸数量(如通过HPAEC-PAD结合阴离子交换层析)、单糖组分(如在聚糖的酸水解之后通过HPAEC-PAD)和/或确切结构(如通过质谱测定法)。
[0029]在本发明意义上，“活性”是指在生物学意义中分子行使的一种或一组功能。通常，通过本发明方法产生的糖蛋白是较现有技术产生的糖蛋白具有更大活性和/或是更有效的生物产物。因此，本发明涉及人高活性糖蛋白及其在诊断、治疗或包含所述糖蛋白的其它生物学系统和检测方面的使用。在本发明意义上，术语“高活性糖蛋白”、其内容等同物和语法上的等同物应理解为与所选择的应用相关的改进的或优化的活性，借此活性可接近于极限值，例如被最小化或最大化，或被设定成中间值，以表示与现有技术产生的相应糖蛋白和/或本发明不同唾液酸化方法产生的其它唾液酸化形式相比具有较高或较低活性。在本发明意义上，改进或较高的活性还指在其生物学和/或药学意义上具有有利的活性。例如，可通过减小不良生物效应如通过减轻不良免疫效应刺激或减小免疫原性将糖蛋白的生物活性增加至一定程度。本发明的方法可有效用于生产具有最优血清半衰期、药物代谢动力学、稳定性、抗原性和/或免疫原性的糖蛋白。 [0030]根据本发明，术语“不同唾液酸化形式活性的测定”是指使用能够测定糖蛋白活性的合适生物测定方法测定活性。本领域普通技术人员能够鉴别合适的生物测定方法或建立合适的生物测定方法。根据本发明，所述生物测定方法包括如活体外生物测定方法，包括细胞测定或分子测定或混合测定方法，例如增殖测定、细胞凋亡测定、细胞粘附测定、信号测定、迁移测定、细胞毒性测定、吞噬作用测定、裂解测定及结合测定。所述生物测定方法还包括使用动物模型或人的活体内测定方法，例如生物分布、药物代谢动力学、药效试验、血清半衰期试验、生物利用度试验、效力试验、定位试验、包括临床研究的疾病治疗及预防试验。所述生物测定方法还包括化学、物理学、物理化学、生物物理学及生物化学试验，例如体温稳定性、切应力、压力、pH、缀合及其它。所述生物学测定方法还包括免疫原性和/或抗原性检测以改进糖蛋白与其临床应用有关的性质。本领域普通技术人员能够测定糖蛋白及其唾液酸化形式的活性或所述活性的组合。
[0031]在优选的实施方案中，糖蛋白的较高活性具有如下特征:即通过至少一种生物测定方法测定的在至少一种活体外模型具有较高活性和/或在至少一种活体内模型具有较高活性和/或较高稳定性和/或较长血清半衰期和/或较长生物利用度和/或改进的免疫原性和/或改进的抗原性。总体活性改进，本发明也称作较高活性，当用于人或相应生物体时可导致例如许多改进，如较低剂量、较长给药时间间隔、较小副作用和无产品毒性或较低毒性，可由此产生具有很大改进的药物。
[0032]根据本发明，术语“筛选具有较高活性的唾液酸化形式”是指在至少一种生物测定中相比较，筛选具有较高活性的糖蛋白的唾液酸化形式。该比较可通过将至少一种本发明方法表达的唾液酸化形式与现有技术产生的糖蛋白的糖基化形式对比或通过对比本发明方法表达的至少两种唾液酸化形式进行。优选地从多于两种不同唾液酸化形式中选择高活性糖蛋白以获得、鉴定及产生相当优化的糖形。本领域普通技术人员能够在具体的生物测定中测定哪种唾液酸化形式具有较高活性。在优选的实施方案中，考虑使用多种生物测定方法组合测定活性以选择具有较高活性的唾液酸化形式。因此，并非每一种生物测定都必须显示较高的活性，但根据特定糖蛋白的用途和特征，某些有利的生物效应可弥补较不利的效应，仍可导致在本发明意义上糖形的总体较高活性。例如，某些糖形可通过结合至细胞上的受体产生高得多的活性，从而触发次级效应，例如诱导增殖，但显示血清半衰期轻度减少。从总的生物活性来看，触发受体的活性提高足以弥补生物利用度的减少而有余。在另一个实施例中，较短的半衰期及较高的触发受体的活性均有利。在另一个实施例中，活体内活性没有被改进但活体外稳定性改进了糖蛋白的生产和贮存。在另一个实施方案中，需要长的半衰期但较低的活性。因此，实际有利的唾液酸化形式必须根据特定糖蛋白就其后面的使用来测定。在此完整系统中本发明使得该目的首次得以实现。所有这些方面依赖于在很大程度上不同且无法预测的待测定单一糖蛋白，因此显示本发明下文所述方法的必要性。通过使用本发明，本领域普通技术人员能够选择合适的生物测定方法和/或多种生物测定方法的组合，并为上述糖蛋白的预期使用选择具有较高活性糖蛋白的唾液酸化形式，并因此与通过标准方法生产的唾液酸化形式对比改进糖蛋白。由此本领域普通技术人员通过使用本发明还能够确定与所述糖蛋白较高活性水平相关的唾液酸前体添加物或唾液酸前体添加物的组合物的浓度。
[0033]根据本发明术语“由不同唾液酸化表达并在生物测定中比较的多种不同唾液酸化形式”还可指当使用一种生物测定检测时与至少一种由现有技术获得的不同的唾液酸化或糖基化形式比较时显示较高活性的本发明方法表达的一种唾液酸化形式。
[0034]上述的所有定义和说明对于上下文所述的糖蛋白和方法也有效。
[0035]令人吃惊地发现，根据本发明重组表达的糖蛋白当以与唾液酸前体添加物特定浓度相应的特定程度被唾液酸化时显示最高生物活性。与最高生物活性相关的此唾液酸化程度对于每一种被分析的糖蛋白是不同的，是无法预测的，并且不一定是可实现的最高唾液酸化程度。为鉴定本发明的糖蛋白的唾液酸化程度，使用和/或产生唾液酸化能力缺陷的细胞，细胞缺陷能够重建唾液酸化及产生不同唾液酸化程度。取得唾液酸化重建的一种方法是通过向所述细胞培养基添加唾液酸生物合成途径的唾液酸前体添加物。使用所述缺陷细胞及至少一种唾液酸前体添加物，所述细胞产生的本发明任何糖蛋白的唾液酸化程度可通过改变添加至培养基的所述唾液酸前体添加物的量而被不同程度控制。可获得至少两种不同唾液酸化形式。如果仅使用两种不同浓度的前述添加物，浓度梯度必须足够大以保证产生不同唾液酸化形式。优选地，选择低浓度和高浓度，其中通过选择工艺特征如粘度、溶解度、原子量值等确定最大浓度。至少两种形式和优选地多种形式的不同唾液酸化糖蛋白(不同唾液酸化形式)可 被分离并分析其性质，例如糖基化(优选唾液酸化)、活性、血清半衰期、药物代谢动力学、药效动力学、活体内生物活性、抗原性及免疫原性。这样，通过上述单一标准和多种标准组合鉴定对于所述糖蛋白的活性或其他性质而言最佳的唾液酸化程度，最佳唾液酸化糖蛋白的生产条件可用至使用所述缺陷细胞作为生产细胞的生产过程。
[0036]本发明还教授了生产高活性糖蛋白的特殊方法以及高活性糖蛋白本身。在此特殊情况下，当唾液酸前体添加物的最佳浓度可通过其它技术确定或本领域普通技术人员逻辑思考推论得出时，例如下文实施例中所述，特定唾液酸化形式可被生产而不需要将其与在相应表达细胞系使用不同浓度唾液酸前体添加物表达产生的另一种形式对比。在本发明高活性糖蛋白及方法的意义上，这些特殊情况也明确落入本发明之中。在这些情况下，本发明的基本发明原理仍旧是本发明方法及所获得的高活性糖蛋白的重要和关键部分。对于这点也可参见上下文所述实例的其它说明。其中一个实例是无唾液酸化或最低唾液酸化的GPA，它将在下文一个实施例中进一步描述，其中目标可从具有最小唾液酸化程度和最大Thomsen-Friedenreich的形式的产生开始。因此,不添加唾液酸前体添加物并优选地在培养基中无唾液酸糖蛋白仅产生具有最低唾液酸化程度的形式是足够的。此种形式进一步使用的适合性可通过将其与至少一种其它唾液酸化形式对比而确定，但另外也可通过将其与唾液酸化和较小唾液酸化的人源GPA对比而确定。另一个实例是已知需要最大唾液酸化的情况，其中使用最大量唾液酸前体添加物是足够的。然而，在后一种情况下，通过产生如本发明其它部分描述的不同唾液酸化形式优化唾液酸前体添加物的组成和浓度从而优化最大唾液酸化几乎无论如何都是有利的。在此特有情况下，使用一种测定唾液酸化程度的技术作为单一的生物测定方法是足够的，然而，优选与其它生物测定方法组合。
[0037]新技术对于新型糖蛋白的产生和不同糖蛋白的改进包括改进的生物属种(biogenerics)的产生具有高度潜在优势。
[0038]在下文中进一步描述了唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的缺陷。在本发明中，高活性糖蛋白通过一种具有缺陷的表达细胞系产生，所述缺陷导致细胞唾液酸化能力减小，优选地唾液酸化能力完全丧失，并可被重建而允许不同程度控制的唾液酸化。还被称为“唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的缺陷”的细胞的分子缺陷可为唾液酸代谢有关的蛋白质的功能丧失，如糖转运中，如CMP-唾液酸运载体，或在CMP-唾液酸生物合成中，如激酶、脱氢酶、磷酸酶、合成酶 、酮糖移转酶、转二羟丙酮基酶、异构酶、转移酶及差向异构酶。产生具有减小的唾液酸化或无唾液酸化的唾液酸化机能不全细胞的分子缺陷还可为唾液酸代谢有关的蛋白功能增加，例如从碳水化合物裂解去除唾液酸的酶，如神经氨酸酶。优选的靶目标是用于转运CMP-唾液酸的蛋白质及催化唾液酸生物合成途径的限速步骤的酶。更为优选地，缺陷与差向异构酶有关，最优选地是UDP-GlcNAc-2-差向异构酶。
[0039]现有技术教授N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)在CMP-唾液酸的生物合成中起重要作用。ManNAc通过在唾液酸的细胞生物合成中代表限速步骤的UDP-GlcNAc-2-差向异构酶的作用从Μ)Ρ-Ν-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)产生。然后，ManNAc被特异激酶(如N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶)磷酸化。通过Neu5Ac-9-P-合成酶使ManNAc-6-P与磷酸烯醇丙酮酸缩合成N-乙酰神经氨酸-9-P (NeuAc-9-P),接着通过Neu5Ac_9_P-磷酸酶释放磷酸，通过CMP-Neu5Ac合成酶活化Neu5Ac。然后通过特异运载体(如CMP-唾液酸运载体)将CMP-Neu5Ac转运至细胞的高尔基小室，在此处它作为不同唾液酸转移酶供体，例如 ST6GlcNAc 唾液酸转移酶、ST6GalNAc-1 至 ST6GalNAc_VI，ST3Gal_I 至 ST3Gal_VI 及ST6Gal-1，这些酶将唾液酸转运至糖蛋白或糖脂的末端半乳糖(Gal)-、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基。
[0040]唾液酸生物合成的每一种酶，例如UDP-GlcNAc-2-差向异构酶、激酶、Neu5Ac-9-P-合成酶、Neu5Ac-9_P-磷酸酶及CMP_Neu5Ac合成酶或用于转运至高尔基小室所必需的每一种蛋白质可被影响而改变，优选地减小且更优选地完全干扰细胞唾液酸化的能力，作用方式是通过向缺陷细胞提供缺陷酶产物而重建缺陷。细胞唾液酸化的能力还受唾液酸转移酶催化将唾液酸转移至碳水化合物的变化的影响。
[0041]关于所述细胞缺陷如何产生或如何针对靶向蛋白合成及关于基因、转录、翻译或蛋白质水平的功能而具体产生具有许多选择方式。
[0042]编码特定蛋白的基因突变常导致该蛋白功能丧失或有时产生获得一种功能的蛋白。例如，通过一个或两个核苷酸的替代在基因编码区内制造终止密码子的突变或由(1+n)或(2+n)个核苷酸的引入或缺失引起的移码突变，η为3的正整数倍数。有许多本领域普通技术人员已知的“功能丧失”和“功能获得”基因突变。这些基因突变还可影响基因的转录。有许多本领域普通技术人员已知的方法可诱导随机基因突变，所述诱导可使用化学诱变剂例如甲基磺酸乙酯(EMS)，或物理诱变剂，例如紫外光。另外，目前的分子生物学技术使本领域普通技术人员能够使突变特异靶向一种基因。通过使用这些技术，本领域普通技术人员能够敲除特定基因或导入新基因以产生获得功能的突变体。
[0043]在转录水平，编码特定蛋白的mRNA的合成是受控的。基因转录的缺陷或改变可切断或启动特定酶的mRNA合成。例如，编码涉及唾液酸生物合成的酶的DNA的甲基化，或者DNA结合蛋白(如组蛋白、转录因子或转录装置的蛋白)的修饰(如乙酰化)，可阻止或启动特定基因的转录。上述通过基因和分子生物学方法并为本领域普通技术人员已知的突变的诱导可为影响任何基因转录效率的选择方法。影响转录产生功能丧失缺陷的一个实例是NM-F9细胞中UDP-GlcNAc-2-差向异构酶mRNA缺乏，该缺陷是使用EMS诱变剂处理野生型细胞产生的。
[0044]在翻译水平，靶向特定酶的合成mRNA，优选地阻止或减少核糖体蛋白的生物合成。例如，通过核糖核酸酶(RNAse)使用祀向特定mRNA分子的反义分子或小干扰RNA分子阻止特定mRNA的翻译和/或降解。 两种技术均为本领域普通技术人员已知。
[0045]在蛋白质水平，酶活性缺乏可由基因突变引起。可能的突变包括至少一个氨基酸的替代、缺失和/或修饰。突变可通过以下方式涉及酶的催化性质:通过蛋白的结构重折叠，借此新的或非天然结构不允许底物的结合和/或转化，或通过改变负责与底物相互作用的活性中心的残基。产生所述突变的技术如上所述。
[0046]CMP-唾液酸的生物合成或转运也可受特异抑制剂影响。所述抑制剂可为唾液酸类似物，它们可阻断CMP-唾液酸生物合成有关的酶或蛋白质的活性，或者阻断CMP-唾液酸转移所必需的运载体的活性。这些抑制剂可结合至酶或蛋白质的调节中心和/或催化中心，由此阻止底物的结合和/或转化或转运。抑制剂是具有高结合亲和力的分子，选自唾液酸类似物、小有机分子、肽配体、抗体及其片段、DNA适体、RNA适体、Spiegelmers等。
[0047]由 Nemod Biotherapeutics GmbH&C0.KG, Robert- Rossle-Str.10, 13125Berlin (Germany)于 2003 年 8 月 14 日以 DSM ACC2606 (匪-F9)及 DSM ACC2605 (NM-D4)在德国微生物保藏中心(〃DSMZ_Deutsche Sammlung vonMikroorganismen undZel lkulturen GmbH〃in Braunschweig (Germany))保藏的 NM-F9 和 /或NM-D4细胞，是用于表达本发明高活性糖蛋白及用于本发明下述方法的理想合适的表达细胞系的糖工程细胞，这是因为NM-F9及NM-D4细胞丧失唾液酸化能力，此能力可通过代谢互补作用重建。因此，在本发明中，NM-F9和/或NM-D4细胞是具有高活性糖蛋白的唾液酸的糖核苷酸生物合成途径缺陷及用于本发明下述方法的最优选缺陷细胞系。
[0048]NM-F9及NM-D4细胞唾液酸化的细胞缺陷由缺少UDP-GlcNAc_2-差向异构酶活性引起，借此唾液酸化可通过向培养基添加差向异构酶催化的酶反应唾液酸生物合成上游的细胞产物(也称为代谢互补)而恢复，所述唾液酸中间体可为ManNAc、ManNAc_6_P、NeuAc-9-P、Neu5Ac及CMP_Neu5Ac。ManNAc为优选。令人吃惊的是，细胞唾液酸化程度可由添加至细胞培养基中的ManNAc量控制，不仅如此，而且甚至更令人吃惊的是自细胞分泌或释放的糖蛋白可以该方式被调节。令人吃惊的是，细胞培养基中主要由添加胎牛血清(FCS)至培养基提供的唾液酸化的血清蛋白的存在，影响细胞或分泌性糖蛋白的唾液酸化程度。这似乎是因为细胞在某种程度上可明显利用吸收的糖蛋白的唾液酸用于重新糖基化，而不需要其自身生物合成途径产生CMP-唾液酸或通过分解途径将唾液酸导入已知或未知的唾液酸的前体生物合成途径。因此，当于无FCS或甚至无唾液酸化蛋白的培养基中培养细胞时获得极低程度的唾液酸化。在FCS存在下，唾液酸化程度总是高于无FCS的相同细胞培养条件。因此，为在给定的细胞系统中获得最高唾液酸化程度，向培养基中添加FCS或更优选地唾液酸化糖蛋白，或最优选地唾液酸化糖蛋白胎球蛋白。这样，NM-F9细胞或分泌性糖蛋白上的唾液酸化程度被控制在处于与原始NM-wt细胞唾液酸化相比低于20%唾液酸化，优选地低于10%唾液酸化,最优选地几乎无唾液酸化,至与无差向异构酶缺陷的原始NM-Wt细胞唾液酸化相比完全唾液酸化(100 % )之间。
[0049]在此范围内，可通过向培养基添加确定的糖中间体不同程度控制唾液酸化的程度，糖中间体例如在O — 200mM、优选地O — 140mM、及更优选地O — 90mM的浓度范围内的ManNAc0为获得高程度唾液酸化，可向培养基添加唾液酸糖蛋白。可从具有不同唾液酸化程度的相同糖蛋白分离及分别分析具有不同程度唾液酸化的各糖蛋白。因此，一种唾液酸化程度对应于一种唾液酸化形式，唾液酸化形式可包括本发明其它部分所述的单一糖形或糖形组合物。
[0050]因此，本发明提供一种糖蛋白不同唾液酸化的方法或程序，如下文所述。
[0051]如上所述，通过分析不同唾液酸化程度的各糖蛋白的活性，确定唾液酸前体添加物的最佳浓度。待分析活性取决于目的糖蛋白。例如，如果所述糖蛋白是细胞因子，可以分析糖蛋白刺激免疫细胞的潜能，免疫细胞优选地为已知由该细胞因子刺激的细胞，更优选地为用于标准测定方法测定所述细胞因子活性的细胞。在另一实例中，所述糖蛋白为生长因子时，可分析糖蛋白诱导细胞增殖的潜能，细胞优选地为已知由该生长因子刺激的细胞，更优选地为用于标准测定方法以测定所述生长因子增殖活性的细胞。在第三个实例中，关注的是血清半衰期，这是因为它对治疗应用的糖蛋白的生物活性影响很大。本发明使具有不同唾液酸化程度的同一糖蛋白的不同形式得以表达和分离，并通过使用测定方法分析所述糖蛋白活性，可确定所述糖蛋白活性的最佳唾液酸化程度。
[0052]下文中进一步描述了糖蛋白和高活性糖蛋白。
[0053]糖蛋白的实例如上所述。前述许多糖蛋白属于“细胞因子”，在本发明中是指在免疫系统细胞中存在的一般种类的激素、淋巴因子和单核因子，以及其它细胞因子。该定义旨在包括但不限于那些在局部起作用而不在血液中循环的激素，当用于本发明时，会导致个体免疫反应改变。其它合适免疫调节细胞因子的实例包括但不限于干扰素(如干扰素-α、干扰素-β 和干扰素-Y )、白细胞介素(如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10及IL-12)、肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β )、促红细胞生成素(EPO)、FLT_3配体、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD2及ICAM。对于促红细胞生成素，认为该分子促进祖细胞成熟为红细胞，而血小板生成素被认为促进祖细胞趋向血小板途径。CSF是指诱导骨髓祖细胞分化为特定类型成熟血细胞的淋巴因子家族。祖细胞产生的成熟血细胞的具体类型依赖于现有CSF的类型。相似地，粒细胞-巨噬细胞集落形成依赖于GM-CSF的存在。另外，与IL-2、GM-CSF, TNF-α等等的人源形式基本同源的其它哺乳动物细胞因子，当被证明对免疫系统显示相似活性时可用于本发明。相似地，与特定细胞因子基本类似但蛋白质序列具有相对较小变化的蛋白质也用于本发明。已为人们熟知的是蛋白质序列的某些小的改变是可能的，不会影响蛋白质分子的功能性能力，因此可以制备在本发明中作为细胞因子起作用但与现有已知序列稍有不同的蛋白质。最后，在本申请中单词“细胞因子”的单数或复数形式的使用为非限定性，不会限制本发明及权利要求书的解释。粘附分子或辅助分子或其组合物可单独使用或与细胞因子联合使用。 [0054]优选的糖蛋白选自血型糖蛋白A、EPO、G-CSF, GM-CSF, FSH、hCG、LH、干扰素、白细胞介素、抗体和/或其片段。
[0055]在本发明中，高活性糖蛋白可为内源性蛋白或优选地在表达细胞系重组表达产生的蛋白质。因此，编码目的糖蛋白的cDNA或基因通过分子生物学方法被克隆至表达载体并在表达细胞系中表达。该表达优选地为稳定表达。所有这些技术为本领域普通技术人员已知。有许多表达载体可以使用，并适于在本领域普通技术人员已知的哺乳动物细胞中表达。在优选的实施方案中，糖蛋白由细胞分泌。因此，使用利于糖蛋白分泌的方法构建表达载体。分泌性糖蛋白可为可溶糖蛋白或跨膜结构域缺失的膜蛋白。在优选的实施方案中，编码分泌信号肽的核酸被包括在编码能够使得、利于和/或增加蛋白质分泌的糖蛋白的核酸之内。所述信号肽及其编码核酸为本领域普通技术人员已知。在本发明优选的实施方案中，信号肽的核酸具有SEQ ID NO:1的序列或所述序列的变异、缺失、插入和延长和含有所述序列的融合蛋白。
[0056]在本发明中，NM-F9细胞中两种高活性糖蛋白的重组表达、作为可溶蛋白的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及作为膜蛋白的血型糖蛋白A (GPA)以实施例给出。
[0057]GM-CSF为骨髓细胞的强效物种特异性生长因子，在先天及适应性免疫系统的活化中起重要作用。该因子刺激粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及其祖细胞的增殖、发育、分化及活化。另外，GM-CSF对于在体液及细胞免疫反应重要的树突前体细胞的分化和成熟是至关重要的。在红细胞和巨核细胞祖细胞增殖中观察到GM-CSF与促红细胞生成素(ΕΡ0)，及与各种其它细胞因子(如IL-1、IL-3、IL-4、G-CSF)的协同作用。GM-CSF增强杀微生物活性、氧化代谢作用、吞噬活性及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的细胞毒性，并诱导嗜碱性粒细胞释放组织胺和白三烯C4。用作标准治疗方法的人GM-CSF具有几个临床适应症，即接受骨髓移植，中性粒细胞减少症，尤其是化学和/或放射治疗后的中性粒细胞减少症，及化学治疗后感染和出血有关的血球减少。另外，它扩充了收集的外周干细胞库并诱导引起急性髓细胞样白血病及骨髓增生异常综合征的白血病细胞在化学治疗过程中对细胞周期特异药物的敏感性。重组人GM-CSF支持各种疾病中造血系统的重建。另外，具有几种试验性治疗方案，例如在癌症治疗中联合的GM-CSF/放射性疗法消除放射的杀伤效应并恢复造血作用，联合的GM-CSF/化学疗法增强细胞毒类药物的耐受性(如癌症化学治疗方法、HIV)，可使用较高剂量及使发病率显著减小。rhGM-CSF是抗癌症及感染性疾病的癌症疫苗及细胞疫苗具有前景的佐剂，并是树突细胞为基础的抗肿瘤及感染性疾病疫苗的关键组分。它也与过继T细胞转移有关。通常，rhGM-CSF可增强及刺激先天免疫系统。
[0058]本发明的人GM-CSF由于其较高的特异性活性与现有技术产生的GM-CSF相比更为有利。此增强的活性允许每一患者每剂量使用较少材料和/或较少给药次数和/或减少或无非期望的副作用，例如在重组GM-CSF治疗使用过程中观察到毛细血管漏综合征，和/或生产成本较低。
[0059]在本发明中，rhGM-CSF在UDP-GlcNAc-2-差向异构酶缺陷细胞例如NM-F9细胞中重组表达，通过逐渐增加唾液酸代谢产物量的代谢互补，产生在几乎无唾液酸化及最大唾液酸化程度之间的不同唾液酸化程度的各种形式rhGM-CSF，唾液酸代谢产物优选地为ManNAc,例如除与添加lmg/ml和3mg/ml唾液酸糖蛋白胎球蛋白同时添加90mM ManNAc外还可添加0-90mM ManNAc。为分析rhGM-CSF的不同唾液酸形式的活性，选择标准测定方法测定其刺激细胞增殖的能力，细胞优选地为TF-1细胞及人单核树突细胞系NemodDCO^w.nemod.com)。令人吃惊的是，rhGM-CSF的细胞增殖刺激活性很大程度上依赖于rhGM-CSF的唾液酸化程度，一种唾液酸形式的rhGM-CSF显示具有最高活性，具有高度唾液酸化但非最大唾液酸化。在相同测定方法中检测了可商购的rhGM-CSF，优选地在细菌和酵母中表达的Leukomax?和Leukine'?的细胞增殖活性，发现较NM-F9细胞中表达的最大活性唾液酸形式的活性低。为获得Leukomax?或Leukine?的最大活性，在相应活体外试验中需要少于最高达500倍的NM-F9细胞的最佳唾液酸形式。当使用相同浓度Leukomax ?、Leukine?或最佳唾液酸形式的rhGM-CSF分析活性时，发现活性增加至达1.5倍，优选地为2倍，更为优选地为3倍，最优选地为4倍，高度优选地为5倍。这些试验结果尤其令人吃惊，因为现有技术没有证明rhGM-CSF的活性依赖于其糖基化。
[0060]除发现rhGM-CSF的最佳唾液酸形式的较高活性外，还发现当用于治疗时所述唾液酸形式的较高唾液酸化 程度可保证较长的血清半衰期。有利的是，使用较长时间间隔内的较低给药剂量，同时伴有免疫原性和不良反应减轻或完全消除。后二者还受人相关糖基化形式积极影响。高活性rhGM-CSF的高程度唾液酸化大大改进了药物代谢动力学性质。
[0061]本发明提供了高活性糖蛋白分泌性rhGM-CSF，如上所述可有利地用于各种临床应用中，还可用于活体外应用，例如用于分化型树突细胞和活化T细胞的产生。
[0062]本发明的新技术对于其它生长因子和激素例如EP0、FSH及hCG的改进具有很大益处，并对其它各种糖蛋白例如上述的细胞因子和抗体及本发明其它部分描述的糖蛋白的改进具有很大益处。
[0063]作为另一个实例，无唾液酸血型糖蛋白A(AGPA)在NM-F9细胞中重组表达。根据从血液样品分离并之后酶作用去唾液酸化导致Thomsen-Friedenreich(TF, core-1)抗原暴露的血型糖蛋白A (GPA)，成功开发了用于治疗TF-阳性肿瘤的疫苗。
[0064]GPA及AGPA为完整的膜蛋白。为建立一种生产方法，表达由任何细胞系优选地为NM-F9细胞和NM-D4细胞分泌至细胞培养基中的GPA重组片段是非常有利的。因此，构建了编码含有GPA细胞外糖基化结构域及缺乏GPA跨膜结构域和细胞内结构域的GPA片段的表达载体secGPA。第一个试验显示在稳定转染的NM-F9细胞(见实施例)的培养基中仅检测到少量分泌性AGPA。为增加分泌率，将几种外源性信号肽融合至GPA片段，借此消除内源性信号肽。令人吃惊的是，含有SEQ ID NO:1表征的氨基酸序列的GM-CSF信号肽与GPA的内源性信号肽及其它T细胞受体及抗体K轻链的外源性信号肽相比是最有效的信号肽。本领域普通技术人员仅可获得和知道后两种信号肽可用于分泌蛋白的重组表达。
[0065]本发明提供由任何唾液酸化缺陷的细胞或细胞系表达或产生的高活性糖蛋白分泌性无唾液酸血型糖蛋白A，优选地，所述细胞为人细胞，更优选地，所述细胞为NM-F9或NM-D4细胞，所述细胞以优选的密度携带TF-抗原并不被唾液酸化作用掩盖。当高活性糖蛋白分泌性无唾液酸血型糖蛋白A被用作小鼠模型的抗肿瘤疫苗时，可引发强烈的抗TF和抗肿瘤反应，在人活体外研究中还显示有GPA唾液酸化形式和其它糖基化形式无法取得的强有力的TF特异性抗肿瘤反应，表明在本发明意义上是高活性糖蛋白形式，其强有力的抗肿瘤反应表明它可有效用作TF特异性肿瘤的治疗或预防的强有力的抗肿瘤疫苗组分。
[0066]TF糖是已知存在于许多肿瘤组织而不存在于健康人正常细胞上的肿瘤抗原。血型糖蛋白A(GPA)是由唾液酸化作用掩盖的TF抗原的载体。根据从血液样品分离并随后通过酶作用去唾液酸化导致TF抗原暴露的GPA，成功开发了用于治疗TF-阳性肿瘤患者的疫苗。在本发明中，仅为GPA的糖基化部分的细胞外结构域于唾液酸化缺陷的人细胞中重组产生，优选地为NM-F9和NM-4细胞中以分泌形式重组产生(secGPA，见上文)。使用唾液酸化缺陷细胞，例如NM-F9或NM-D4细胞的有利之处是以任何形式在所述细胞表达的GPA上的TF抗原无唾液酸，因此可被用作确定的、无酶预处理的标准化疫苗。 [0067]本发明还提供一种核酸，该核酸含有编码糖蛋白的核酸序列和SEQ ID NO:1的核酸序列或所述序列的突变、缺失、插入和延长以及含有所述序列的融合蛋白。具有SEQ IDNO:1或所述序列突变、缺失、插入和延长以及含有所述序列的融合蛋白表征的GM-CSF的信号肽可被用于驱动任何哺乳动物基因产物如GPA在哺乳动物细胞优选地在人细胞，更优选地在NMit细胞亚克隆，最优选地在NM-F9细胞和NM-D4细胞分泌表达。所述信号肽通过本领域普通技术人员已知的技术被整合入目的蛋白中，例如通过将编码信号肽的核苷酸序列分子克隆入在编码区框架内编码目的蛋白的cDNA中。由此，内源性信号肽被完全和部分消除。当此构建体被亚克隆入本领域普通技术人员已知的表达载体并通过本领域普通技术人员已知的方法例如化学转染、脂质体转染、电穿孔术或感染导入细胞，细胞合成含有所述信号肽和目的蛋白的融合蛋白。在此融合蛋白于细胞内加工过程中，信号肽被完全或部分去除。
[0068]根据本发明，术语“糖蛋白”还被定义为病毒、病毒颗粒或病毒蛋白。根据本发明可以产生的病毒、病毒颗粒或病毒蛋白包括肠病毒(如鼻病毒、脊髓灰质炎病毒或口疮病毒)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒、伪狂犬病病毒或牛疱疹病毒)、正粘液病毒(如流感病毒)、鼠疫病毒、杆状病毒、副粘病毒(如新城鸡瘟病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒或麻疹病毒)、逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒、细小病毒或乳多空病毒)、轮状病毒、冠状病毒、黄病毒(如黄热病病毒或壁虱脑炎病毒)、引起肝炎的病毒(如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒)。
[0069]在本发明意义上，高活性病毒、病毒颗粒或病毒蛋白具有可使用合适生物测定方法来测定的优点，合适生物测定方法例如特殊表达的病毒、病毒颗粒或病毒蛋白的唾液酸化形式的感染性测定，特殊表达的病毒、病毒颗粒或病毒蛋白的唾液酸化形式作为疫苗或疫苗组分的潜能的测定，特殊表达的病毒、病毒颗粒或病毒蛋白的唾液酸化形式的繁殖力的测定，或本领域普通技术人员已知的其它更多有利的医学生物学特征的测定。通过使用本发明，本领域普通技术人员可选择、采用或建立相应的生物测定方法。优选地，通过不同唾液酸化作用优化所产生病毒的感染性而产生改进疫苗。这使所述病毒、病毒颗粒或病毒蛋白的唾液酸化程度得以最佳。
[0070]优选地，人细胞系NM-F9或NM-D4用于生产用于疫苗的高活性人病毒、病毒颗粒或病毒蛋白。人细胞系能够进行正常的翻译后及per1-translation修饰，并组装所述糖基化，并如本发明其它部分所述，使唾液酸化及唾液酸化程度得以最佳。
[0071]已知病毒的唾液酸化常在病毒感染中起着重要作用。通过优化唾液酸化程度，可生产更安全和/或更有效的病毒疫苗。另外，此生产和/或更高级的生产可导致改进的并因此是更低廉的产品加工过程。
[0072]本发明还提供一种用于生产高活性糖蛋白的方法，包括在添加有一定浓度的至少一种唾液酸前体添加物的培养基中，使用一种表达细胞系表达所述高活性糖蛋白，所述表达细胞系携带唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷，并使用编码糖蛋白的核酸转染该表达细胞系，唾液酸前体添加物的浓度通过以下步骤确定:
[0073](i)通过使用不同浓度的至少一种唾液酸前体进行不同唾液酸化，表达所述糖蛋白的多种不同唾液酸化形式；
[0074](ii)使用合适的生物测定方法测定不同唾液酸化形式活性，与参考糖蛋白进行对比；
[0075](iii)筛选较高/最高活性的唾液酸化形式并测定与所述糖蛋白的较高/最高活性水平相关的唾液酸 前体添加物的浓度。
[0076]上述方法使确定为高活性糖蛋白的糖蛋白的最佳唾液酸形式得以产生。对于本领域普通技术人员来说，通过使用本发明的方法，将于分析规模或中试规模等级确定的条件转移至生产规模并调整和改进生产和培养基条件是可能的并比较容易的。本发明与其它方法相比的另一个优点是在与改进的生产率相关的扩大规模的操作中，高活性蛋白的期望唾液酸化程度除通过优化其它培养基组分外还可通过调节唾液酸前体添加物的浓度和组成而被稳定。
[0077]在本发明意义上上述所有高活性糖蛋白的定义和说明对于上下文所述的方法也是有效的。
[0078]另外，本发明提供一种鉴定/测定高活性糖蛋白的方法，包括:
[0079]i)使用编码糖蛋白的核酸转染携带唾液酸的糖核苷酸生物合成途径至少一种缺陷的表达细胞系；
[0080]ii)使用具有不同浓度至少一种唾液酸前体添加物通过不同唾液酸化作用表达所述糖蛋白的多种不同唾液酸化形式；
[0081]iii)使用合适生物测定方法测定不同唾液酸化形式的活性，与参考糖蛋白比较；
[0082]iv)筛选具有较高/最高活性的唾液酸化形式。
[0083]原则上，所述方法可用作以下用途的分析工具:(i)分析给定糖蛋白的活性与其唾液酸化程度之间是否有关，(?)确定何为给定糖蛋白与其活性有关的最佳唾液酸化形式，及(iii)确定产生最佳唾液酸化形式的条件。
[0084]另外，本发明可用于研究人糖基化，优选地唾液酸化在生物活性中的作用。[0085]本发明还提供糖蛋白不同唾液酸化形式的加工方法，其特征是，使用编码糖蛋白的核酸转化携带唾液酸糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷的表达细胞系，借此在添加多种不同浓度的至少一种唾液酸前体添加物的培养基中培养细胞，获得糖蛋白的多种不同唾液酸化形式。
[0086]本发明还提供用于鉴定/测定高活性病毒、病毒颗粒或病毒蛋白、其生产及其不同唾液酸化的方法以及本发明方法产生的高活性病毒、病毒颗粒或病毒蛋白。
[0087]在本发明意义上上述所有高活性糖蛋白的定义和说明对于上下文所述的方法也是有效的。
[0088]优选地，本发明被包含在以糖分布(GlycoProfiling)、糖工程(GlycoEngineering)、糖分析(GlycoAnalytics)及糖表达(GlycoExpress)为基础的技术平台中，其中:
[0089]糖分布被理解为分析细胞糖基化机制及糖基化机制产生优选地存在于细胞表面的糖的一系列技术，目的是选择用于糖工程的合适细胞。
[0090]糖工程被理解为用于改变细胞糖基化机制产生具有改变的糖分布的细胞的一系列技术。
[0091 ] 糖分析被理解为在用于在分子水平分析蛋白糖基化的一系列技术。
[0092]糖表达包括本发明的下述技术及方法，包括高活性蛋白的不同唾液酸化、鉴定和测定及高活性糖蛋白的产生。
[0093]将包括本发明的糖蛋白和方法的本发明所述技术结合起来的优点使较大改进的高活性蛋白、在本发明意义上更好的表达细胞系系统、其分析及生产得以实现。其它优点是方法和产品的速度、成本、稳定性及有效性。
[0094]上述所有定义和说明对于上下文所述的糖蛋白和方法也是有效的。
[0095]本发明另一个优点是其方法的组合似一个完整的系统，以产生与糖蛋白使用和功能相关的最佳唾液酸化的高活性糖蛋白。所述组合在下述优选的实施例中描述，但不限于此。
[0096]在第一步，将编码糖蛋白，优选地分泌形式的糖蛋白，优选地含有根据SEQ IDNO:1的序列的糖蛋白，及甚至更优选地为人GM-CSF或GPA的核酸转染至具有唾液酸的糖核苷酸生物合成途径缺陷的表达细胞系，优选地使用NM-F9或NM-D4转染，优选地通过电穿孔术转染，筛选稳定表达的克隆，优选地通过单细胞克隆筛选，优选地筛选在无血清培养基甚至在无蛋白质培养基中生长的克隆。
[0097]在第二步中，所述糖蛋白的不同唾液酸化形式通过使用不同浓度至少一种唾液酸前体的不同唾液酸化产生，优选地产生至少2种、更优选地超过2种，更优选地超过3种，甚至更优选地超过4种不同唾液酸化形式。通过至少一种生物测定方法测定较高活性糖形，例如 对于人GM-CSF的细胞增殖活体外测定或对于GPA使用小鼠或人的活体内免疫检测，显示针对某些肿瘤细胞具有较高特异免疫原性。在优选的形式中，生物测定方法组合用于测定具有依赖于糖蛋白使用的最高活性的高活性糖蛋白。如本发明其它部分描述，所选择的高活性糖蛋白不一定在所有生物测定方法中是较好的，在一种生物测定方法中的较高活性或改进的特征是足够的，然而，优选地所选择的高活性糖蛋白在至少两种生物测定中是较好的，例如在一种活体外模型中，如增殖测定，和/或在至少一种活体内模型中具有较高活性和/或较高稳定性和/或较长血清半衰期和/或较长生物利用度和/或改进的免疫原性和/或改进的抗原性。最优选地是在人活体内具有较高生物活性的糖蛋白，人活体内较高的生物活性可由于不同特征的结合，例如在受体介导的功能中的较高活性及表现较长血清半衰期的改进的生物利用度。例如，通过在所述条件下在培养基中使用NM-F9及90mMManNAc作为唾液酸前体添加物产生的rhGM-CSF唾液酸化形式显示最高活性，因此是优选的高活性糖蛋白。
[0098]通过一种生物测定从较大组选择一较小组糖蛋白的唾液酸化形式以用于另一生物测定的进一步检测对于速度和资源来说是有利的。对于GPA，从其中仅产生一种具有最低唾液酸化程度并因此在无血清培养基中无唾液前体添加物的唾液酸化形式是足够的(见上下文)。在此情况下，产生的高活性GPA可与显示出更高活性的人源唾液酸化GPA相当在本发明中上述高活性是导致动物模型和人的强烈抗TF免疫反应的较高免疫原性。然而，优选地通过本发明方法还产生至少另一种唾液酸化形式并在生物测定中进行比较。
[0099]在上述的高活性糖蛋白测定之后，整合系统允许使用带有编码糖蛋白的转染核酸的相同表达细胞系并通过使用相应浓度唾液酸前体添加物以生产所述高活性糖蛋白。对于高活性糖蛋白的生产常需要大规模。为此，唾液酸前体添加物的最佳条件可能是足够的，然而，通过优化例如其它培养基组分及使用不同反应容器，调整所述唾液酸前体添加物的浓度和组成以稳定高活性糖蛋白的所需唾液酸化程度是有利的甚至是必要的。通过使用本发明，本领域普通技术人员可达到此目的。通过调整唾液酸前体添加物能够稳定唾液酸的程度，这是本发明方法的很大的优点，是现有技术的传统表达系统未能取得的。
[0100]允许使用实际上相同或相似的高活性糖蛋白的鉴定和生产方法的整合系统除其它优点外还具有较高速度和较低成本的明显优点。
[0101]该整合系统当与本发明其它部分描述的其它操作程序、技术及方法结合时尤其有利及效力强大，例如在糖分布、糖工程及糖分析中。
[0102]要产生具有唾液酸 的糖核苷酸生物合成途径缺陷而缺陷可重建的表达细胞系是非常困难的，因为(i)许多酶与唾液酸化有关，即单一酶活性的消除不一定影响细胞唾液酸化的能力，(ii)许多酶是冗余的，即一种酶活性丧失常可由另一种酶补偿，(iii)缺陷的重建常是不可能的，以及(iv)缺陷的代谢互补常是不可能的。本发明提供一种产生具有唾液酸化糖核苷酸生物合成途径缺陷的表达细胞系的新方法，包括从原代细胞或细胞系筛选带有识别分子的表达细胞系，所述识别分子优选结合可被至少两种酶唾液酸化的去唾液酸结构。
[0103]在一个优选的实施方案中，原代细胞或细胞系的细胞在筛选前被诱变。可通过本发明其它部分描述或本领域普通技术人员已知的化学或物理方法随机诱变或定向诱变进行诱变。
[0104]与本发明方法相比，使用本领域普通技术人员已知的现有方法产生在唾液酸前体途径中具有基因缺陷的细胞，尤其当靶基因未知的情况下，非常困难、耗时、并常是不可能的。
[0105]通过使用本领域普通技术人员已知的技术，使用至少一种所述识别分子富集和/或分离细胞进行筛选，所述技术例如亲合层析，如磁性细胞分离技术(MACS technology)或免疫沉淀或层析，和/或通过流式细胞术进行细胞分选和/或通过鉴定具有结合至少一种识别分子的性质的细胞，例如流式细胞术或分泌蛋白的免疫细胞化学或生物化学分析。
[0106]所筛选的细胞可用作表达细胞系或优选地通过已知技术例如通过单细胞克隆进
一步克隆以产生纯克隆。
[0107]令人吃惊的是，使用靶向可被至少两种酶唾液酸化的去唾液酸结构的识别分子能够进行和/或强烈偏倚针对具有可被代谢物质重建的酶活性缺陷的细胞的筛选，这是表达细胞系唾液酸化程度代谢控制的前提。
[0108]本发明方法使所述细胞系完全能够产生或在速度、减少工作量和/或成功的可能性方面大大有利于其产生。这尤其但不仅见于使用人细胞系的情况。
[0109]当诱变的靶基因未知及筛选基于唾液酸化下调的表型效应时，本发明方法尤其是合适的。但当使用例如位点定向重组敲除GlcNAc-差向异构酶活性的定向诱变时，由于通过唾液酸化的表型下调大大有利于稳定诱变克隆的筛选，因此本发明方法也是有利的。
[0110]这些产生的细胞系在本发明意义上可用于不同唾液酸化或用作表达细胞系，然而，它们也可用于其它目的，在这些目的中它们是有益或有用的。
[0111]为产生具有唾液酸化能力缺陷并可选择重建该缺陷的细胞系，原则上可应用每一种哺乳动物细胞系。对于生产方法来说，优选生物技术合适的细胞系，例如Per.C6、HEK293、K562、CVl、C0S-7、杂交瘤细胞、Namalwa、BHK及CH0。所选择的产生具有所述缺陷的新细胞系的方法为如上所述的方法，属于我们的糖工程技术。
[0112]在开始使用所 述方法产生具有所述缺陷的细胞系之前，表征候选细胞系的至少部分糖基化机制是非常有用的(糖分布)。为此，使用至少一种下述技术但优选地首选所述技术的组合，所述技术可分析以下项目:(i)糖基化机制的相关基因的mRNA表达，例如唾液酸转移酶、对糖结构重要的酶的转移酶(所述结构为唾液酸转移酶的底物)、运载体、差向异构酶、唾液酸酶、及前述本发明说明书其它部分所描述的其它酶，(ii)相关酶的酶活性，优选地为唾液酸转移酶，(iii)测定可被或已被合适的识别分子唾液酸化的碳水化合物决定子。糖分布有助于理解候选细胞系的糖基化机制，使得能够决定糖基化机制的改变策略(糖工程)。例如，在候选人细胞系(如 ZR75-l、HEK293、NM-wt(K562)、KG1、LS174T、MCF_7、SW480及T47D)中糖基化有关的酶和蛋白质的mRNA表达情况，如糖基转移酶、单糖生物合成的酶以及运载体，通过RT-PCR进行分析。生物测定方法还用于分析候选细胞系的酶活性，优选地为唾液酸转移酶活性。生物测定方法还用于分析碳水化合物决定子，优选地是已被或可被至少两种酶唾液酸化的碳水化合物决定子，所述生物测定通过合适的方法，例如流式细胞术和/或免疫荧光显微技术，使用特异抗体和凝集素优选地结合唾液酸酶或使用其它去除或破坏唾液酸的方法，例如温和的高碘酸盐氧化作用。合适的生物测定方法为本领域普通技术人员已知或可被其调整或开发。
[0113]根据本发明，术语“原代细胞或细胞系”包括所有细胞，包括例如来自生物样品，例如血细胞、来自组织或其它来源的细胞，及现有的细胞系。如在已公开的细胞系常可见到的那样，细胞和细胞系可由来源于单一细胞或混合细胞的确定的克隆起源组成。细胞可已经被永生化，或可作为本发明方法延伸部分被永生化。永生化可为自发的，例如肿瘤来源获得的细胞，或可通过本领域普通技术人员已知的技术被永生化，例如通过病毒转化，借此本领域普通技术人员能够根据具体细胞确定永生化的最佳时间点。细胞可被或变成被其它基因或在其它基因中修饰。[0114]根据本发明，术语“唾液酸的糖核苷酸合成途径缺陷”是指本发明说明书其它部分所述的相同缺陷。
[0115]根据本发明，术语“识别分子”是指优选结合和/或特异性结合被部分或优选地被完全去唾液酸化并且可被至少两种酶唾液酸化的分子的分子。优选的分子是凝集素，甚至更优选地是识别相应碳水化合物结构的抗体。甚至更优选的是结合TF (Thomsen-Friedenreich, core-1)抗体，例如 Nemod-TFl、Nemod_TF2、A78-G/A7,或识别末端半乳糖残基的抗体或凝集素如RCA、ECL> PNA> Jacalin、ACA> BPL或Amaranthin,或结合唾液酸的凝集素或抗体如SNA和MAA或PankoMab。
[0116]在更优选的实施方案中，识别分子结合的去唾液酸结构可被α 2-3及α 2_6结合的唾液酸唾液酸化。
[0117]在甚至更优选的实施方案中，识别分子结合的结构为O-聚糖(0-Glycan)。
[0118]在甚至更优选的实施方案中，识别分子结合的结构为core-1结构(GalNAca l_3Gal),也被称为 Thomsen-Friedenreich(TF)结构。 [0119]在甚至更优选的实施方案中，具有唾液酸的糖核苷酸生物合成途径缺陷的表达细胞系的产生方法包括使用一种识别core-1结构的抗体从原代细胞或细胞系筛选表达细胞系O
[0120]在甚至更优选的实施方案中，原代细胞或细胞系在筛选之前被诱变。
[0121]作为一个实例，根据本发明携带唾液酸的糖核苷酸生物合成途径缺陷的表达细胞系通过工程NMit细胞产生。基于糖分布(见上述)揭示的许多侯选细胞系的糖基化模式，筛选用于糖工程以产生TF阳性细胞的细胞系。优选地所筛选的细胞系是C2GNT-L或C2GNT-M阴性细胞，更优选地是隐蔽TF阳性细胞，甚至更优选地能够在2，3及2，6连接的唾液酸以非常高程度唾液酸化的细胞，最优选地细胞为NMit细胞。简单地说，通过本领域普通技术人员可使用的任何方法分析细胞的TF表达，优选地通过流式细胞术或免疫细胞化学(如实施例中所述)。通过使用单克隆抗体A78-G/A7或PankoMab筛选TF-阳性细胞。如果TF阳性细胞数目较低，使用诱变剂优选地化学诱变剂，优选地甲基磺酸乙酯(EMS)处理TF-阴性细胞系。之后，如上所述筛选TF阳性细胞。TF阳性细胞的筛选需要被重复，之后TF阳性细胞需要被克隆至接受稳定TF阳性的细胞。这样，产生NM-F9和NM-D4细胞。
[0122]通过相似的修改的方法，对细胞系进行糖工程至接受具有新糖分布的新细胞系以用于例如产生具有确定糖基化模式的糖蛋白是可能的。所述糖基化模式可为改进的唾液酸化，为更多的人糖基化、类似于天然糖蛋白的糖基化或较少或较多的免疫原性糖基化。
[0123]下文进一步描述了糖蛋白和高活性糖蛋白药用组合物或组合物及其使用。
[0124]本发明涉及用于活体内或活体外的本发明高活性糖蛋白的组合物或药用组合物，包括本发明的糖蛋白，以及稀释剂或载体。本发明所述的哺乳动物糖蛋白及其组合物可用于由糖蛋白性质确定的广泛用途。在所有应用中，高活性糖蛋白的使用总是具有很大益处的。例如，根据本发明的哺乳动物糖蛋白可用于活体外测定方法中，例如任何种类的细胞和免疫学测定方法，或分析测定方法，如ELISA或RIA。生长因子GM-CSF作为本发明优选的糖蛋白实例，可用于活体外以诱导某些免疫细胞的增殖和/或分化，例如树突细胞或巨噬细胞，然后用于某些免疫学测定方法，例如ELISP0T测定、T-细胞测定、细胞毒性测定、细胞迁移测定、细胞粘附测定或吞噬测定。根据本发明的GM-CSF还可直接用于细胞增殖测定。[0125]本发明所描述的高活性哺乳动物糖蛋白及其组合物还用于诊断目的。例如，糖蛋白的最佳唾液酸化形式可产生作为诊断标准。优选的是本发明所述高活性哺乳动物糖蛋白及其组合物的活体内应用。根据本发明高活性哺乳动物糖蛋白在活体内的广泛应用，例如任何类别感染、癌症、白血病、造血系统疾病、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、骨髓增生异常综合征及自身免疫性疾病的预防和/或治疗，是由特定糖蛋白的性质确定的，并为本领域普通技术人员已知。所述糖蛋白的来源决定了糖蛋白活体内用于哪类哺乳动物种类。例如，牛GH用于治疗奶牛以增加牛奶产量。根据本发明高活性牛GH的应用可改进治疗，这是由于预期应用数量和非期望副作用会减少。
[0126]在人类，本发明所述糖蛋白用于治疗目的。因为预期给药数量和非期望副作用会减少，使用高活性糖蛋白总是具有很大益处。对于给患者用药，根据常规操作程序将本发明纯化的糖蛋白与药用载体或稀释剂混合。治疗药剂通过静脉输注或皮下注射给药，或使用其它本领域普通技术人员已知的可接受的方法给药。所述治疗药剂还可含有(如果需要的话)其它治疗剂。给药量、频率及给药周期不同并取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、给药饮食时间、给药途径、排泄速率、药物联合及疾病特异性治疗的严格性。与载体物质结合以产生单一剂量形式的活性成分的量根据被治疗的主体及给药的具体模式而不同。
[0127]在本发明优选的实施方案中，所述药用组合物为疫苗或疫苗一佐剂。根据本发明，术语“疫苗组合物”是指可用作哺乳动物和人的疫苗的组合物。疫苗是指诱导免疫反应的药用组合物的治疗或预防性应用。根据本发明生产疫苗组合物的形式或方法不受特殊限制，期望形式的组合物可通过使用本领域可使用的单一方法或以合适组合方式的方法进行制备。疫苗和/或疫苗一佐剂的给药可为皮下、皮内、静脉、肠胃外、肌内、或通过任何其它可接受的方法。上述剂型的制剂和药用组合物可使用常规技术添加常规的药用辅料和添加物进行制备。其它佐剂可同疫苗或糖蛋白一起给药。
[0128]人肿瘤疫苗的一个实例是无唾液酸血型糖蛋白(AGPA)。血型糖蛋白A (GPA)是位于红细胞膜中的唾液酸化糖蛋白，还见于某些细胞系。对于疫苗生产，从人血液制剂中分离GPA,酶处理去除所有与GPA结合的唾液酸。结果产生的AGPA是肿瘤特异性碳水化合物抗原Thomsen-Friedenreich(TF)的载体，因此被用作疫苗诱导持续的抗TF免疫反应，由此去除或至少减少患者的TF阳性肿瘤负荷。本发明所述唾液酸化缺陷细胞的使用使AGPA得以重组产生，而不需要酶处理且不限于使用人血液制剂生产。AGPA是糖蛋白及其其药用组合物作为疫苗用于肿瘤及癌症患者免疫治疗的一个实例。
[0129]另外，本发明提供由本发明提供的方法产生的用于疫苗的高活性病毒蛋白、病毒颗粒和/或病毒，尤其当生产包括合适辅料和/或佐剂的药用组合物时。本领域普通技术人员可通过临床前和临床发展确定给药剂量及途径。
[0130]疫苗一佐剂通常用于增强动物或人疫苗提供的弱保护性(即，提供在保护水平、保护程度和/或保护持续时间上的较小的保护性)。用作疫苗一佐剂的糖蛋白的实例是GM-CSF和某些细胞因子，例如IL-2和IL-7。作为疫苗一佐剂的糖蛋白可与疫苗分开给药，或与疫苗联合给药。当糖蛋白作为疫苗一佐剂与疫苗联合使用时，所给予的组合物含有一种有效引发针对某些病原或抗原的特异性应答的免疫原，一种药用疫苗载体和一种免疫增强量的糖蛋白。此概念的一个实例是本领域普通技术人员已知的全细胞疫苗，其中疫苗一佐剂由作为抗原载体的细胞重组表达。全细胞疫苗通常作为注定会死亡的活细胞应用。免疫接种之后，这些细胞在一定时间段产生一定量的作为免疫佐剂起作用的糖蛋白，例如GM-CSF、IL-2或IL-7。全细胞疫苗还可在免疫接种之前被杀死，仍具有全细胞疫苗的优点，然而在免疫接种之后全细胞疫苗不另外产生疫苗一佐剂。本发明不仅提供疫苗一佐剂，还提供可由本发明提供的方法产生、作为全细胞疫苗使用的一种细胞系或多种细胞系。用于全细胞疫苗的细胞的特征是所述细胞系或多种细胞系组合表达尽可能多的抗原。如本领域每位普通技术人员已知，这些细胞或细胞系组合可通过本【技术领域】普通技术人员已知的方法被直接接种或装配于抗原呈递细胞例如树突细胞上。然后，负载抗原的树突细胞可使用本领域普通技术人员已知的方法被用于免疫接种或用于体外刺激T细胞的过继性T细胞治疗。在本发明中，所述疫苗可为本发明所述方法生产并表达本发明糖蛋白作为疫苗一佐剂的细胞系或细胞系的组合。 [0131]糖蛋白或其药用组合物可用作治疗某些感染性疾病如AIDS、SARS或某些类型肝炎的疫苗或疫苗一佐剂。哺乳动物糖蛋白是根据本发明产生的减毒活病毒产物或被杀死的病毒产物或重组抗原病毒产物的一部分，可诱导针对感染细胞的免疫反应，用于治疗人感染性疾病例如HIV、SARS、乙型肝炎或甲型流感和乙型流感，或动物感染性疾病，如牛病毒性腹泻、马流感、猫白血病、猫呼吸系统疾病。
[0132]本发明涉及一种药盒，该药盒包括本发明的糖蛋白，和/或其药用组合物，和/或其类似物、修饰物和药理活性片段，及任选地包括如何使用该药盒的说明书。在本发明优选的实施方案中，药盒可用于增强哺乳动物针对疫苗抗原的免疫原反应，该药盒含有高/较高活性糖蛋白如GM-CSF、EP0或FSH的药用组合物及其药用载体的容器，以及疫苗的药用组合物和药用载体的容器。
[0133]本发明的糖蛋白可用作治疗感染性疾病的疫苗或疫苗一佐剂。另外，本发明的糖蛋白还可用于制备治疗感染性疾病的疫苗或疫苗一佐剂。
[0134]本发明的糖蛋白可用于疾病的预防和/或治疗，例如白血病、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、癌症、骨髓移植、造血系统疾病、不育症及自身免疫性疾病。本领域普通技术人员已知的糖蛋白的治疗用途范围非常广泛。例如，G-CSF是治疗中性粒细胞减少症的重要治疗剂，中性粒细胞减少症是白血病癌症患者化学治疗导致的发生于中性粒细胞的威胁生命的疾病。GM-CSF尤其用于治疗化学治疗后高龄AML患者以取得中性粒细胞减少症的快速恢复。另外，GM-CSF被批准作为治疗剂用于骨髓移植的一些用途及用于动员外周血干细胞。另外，GM-CSF具有一些临床用途，目前处于研究中，例如治疗HIV和癌症。某些造血系统疾病使用EPO治疗，IFN-β是目前用于治疗多发性硬化症(一种自身免疫性疾病)的重要治疗剂。另一个实例是广泛用于男性和女性不育症治疗的FSH。hCG也用于不育症的治疗，但治疗的焦点集中于女性不排卵。hGH具有临床证实的效果，如体脂肪减少和肌肉组织增加。
[0135]本发明的糖蛋白还可用于制备用于一些疾病预防和/或治疗的药剂，所述疾病选自白血病、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、癌症、骨髓移植、造血系统疾病、不育症及自身免疫性疾病。
[0136]本发明的糖蛋白、疫苗或药剂可通过常规给药途径应用，例如肠胃外、眼睛、局部、吸入、经皮肤、阴道、口腔、经粘膜、经尿道、直肠、鼻、口服、肺或耳途径。[0137]根据本发明治疗性糖蛋白的另一个实例是抗体。抗体通过以高亲和力结合特异靶目标而起作用。当抗体与毒素或放射性同位素结合时，对于肿瘤细胞或被感染的细胞是作用强大的治疗剂。然而，“裸”抗体还能够通过使具有细胞毒和/或吞噬作用活性的特异免疫细胞(ADCC)或补体(CDC)针对靶目标而介导特殊或细胞靶目标的消除。抗体的ADCC和/或CDC活性尤其可通过给定抗体的糖基化的合适改变而改进。
[0138]应该知道本发明不限于本发明所述的具体方法、组合物及细胞系，这是由于所述方法、组合物及细胞系当然可以不同。还应该知道本发明所使用的术语仅作为描述具体实施例的目的，不旨在限制仅由附加的权利要求书限定的本发明的范围。
[0139]如本发明，包括附加的权利要求书所使用的单词的单数形式，如“一”、“一种”及“该”包括相应的复数形式，除非本发明上下文明确指出。因此，例如提及“一种生物体”包括一种或多种不同的生物体，提及“一个细胞”包括一个或多个所述细胞，提及“一种方法”或“一种操作程序”包括本领域普通技术人员所知的等同步骤、方法或操作程序，等等。
[0140]除非另有定义，本发明所有技术及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本发明所述相似或等同的方法、操作程序和材料可用于本发明实践或检测中，但合适的方法和材料如下所述。
[0141]下列表1和表2，及图1 一 15举例说明本发明生产具有最佳唾液酸化的高活性人蛋白。
[0142]表1:糖基转移酶在不同人细胞系的表达情况。所给出的数值是相对于ZR75-1的百分比。在每一种情况下，使用双重RT-PCR测定糖基转移酶mRNA表达，以β-肌动蛋白持家基因作为对照。
[0143]表2:通过单克隆抗体及凝集素检测在不同人细胞系中的碳水化合物决定子。给出的数值是流式细胞术分析测定的抗体/凝集素结合的消减均值，以同种型或次级反应物作为阴性对照。例如，单克隆抗体A78-G/A7和凝集素PNA (花生凝集素)及波罗蜜(Artocarpusintegrifolia) Jacalin为TF特异性。使用神经氨酸酶(白色突出显示)处理细胞引起能够亲和结合的TF暴露。
[0144]图1: NM-wt细胞的糖工程及产生的NM-F9细胞的鉴定。通过EMS处理进行随机诱变。去唾液酸化表位的暴露使亲和筛选及随后EMS处理的NM-wt细胞的克隆产生TF结构高暴露的细胞克隆能够进行，所述TF结构在免疫细胞化学中使用TF特异抗体A78-G/A7测定(Α，上图:EMS处理的NM-wt细胞；下图:亲和筛选及克隆的NM-F9细胞)。唾液酸化程度通过流式细胞术使用TF特异抗体A78-G/A7，识别凝集素PNA的末端-Gal及唾液酸特异凝集素SNA进行测定(B)，或通过硫代巴比土酸方法进行测定(C)。
[0145]图2:TF、STF、TN、STN、血型糖蛋白A(GPA)、无唾液酸血型糖蛋白A(AGPA)、LEX、SLEX及LeX由NMit细胞、衍生细胞NM-F9及NM-D4的表达。通过流式细胞术分析细胞。另外，唾液酸化处理细胞并分析AGPA(A63-C/A9)及TF (A78-G/A7)表达。
[0146]图3:NM-wt细胞、衍生细胞NM-F9及NM-D4中，膜复合糖结合的唾液酸的测定:(A)通过流式细胞术使用凝集素PNA、SNA、MAA及UEAI或(B)通过硫代巴比土酸方法。
[0147]图4:NM-F9细胞的基因缺陷分析:(A)mRNA表达分析及(B)酶活性分析。mRNA表达分析包括RNA的分离、使用UDP-GlcNAc-2-差向异构酶特异引物的RT-PCR及凝胶电泳。肌动蛋白作为对照。酶活性测定基于活体外14C-UDP-N-乙酰葡萄糖胺转化为14C-N-乙酰甘露糖胺的检测。UDP-GlcNAc-2-差向异构酶的mRNA不能被检测到，缺乏的酶活性证实了差向异构酶的基因缺陷。
[0148]图5:通过代谢互补进行唾液酸化的重建。分别在不含或含50mMManNAc或GlcNAc的血清中培养NM-F9及NM_wt细胞4天。单克隆抗体A78-G/A7 (抗-TF)和A63-C/A9 (抗-AGPA)及凝集素SNA、MAA和PNA被用于流式细胞术检测。ManNAc的添加导致唾液酸化重建和TF的消失。由于UDP-GlcNAc-2-差向异构酶缺陷，GlcNAc不能够被代谢。
[0149]图6:通过基因互补重建唾液酸化。使用编码差向异构酶的构建体pcDNA3.1Zeo (-) /2Epi稳定转染NM-F9细胞。单克隆抗体A78-G/A7和A63-C/A9及凝集素SNA和PNA被用于流式细胞术检测。唾液酸化被完全恢复。
[0150]图7:rhGM-CSF在NM-F9中的表达。使用人GM-CSF表达载体稳定转染NM-F9细胞，进行克隆并于添加或不添加FCS的培养基中培养。于I天(Id)、2天(2d)、3天(3d)及4天(4d)后通过ELISA测定上清液中的GM-CSF浓度。4天之后，每105NM_F9细胞分泌14ng/ml GM-CSF。
[0151]图8:通过NM-F9细胞使用不同分泌信号肽对重组表达分泌性AGPA的表达。对于分泌性AGPA的表达，构建了含有GM-CSF的信号肽(secGM/GPA)、T细胞受体的信号肽(secTCR/GPA)、抗体轻链的信号肽(secAK/GPA)及内源性信号肽(secGPA)的四种表达载体。通过夹心ELISA，使用A83-C/B12 (抗GPA)作为捕捉剂，A63-C/A9作为检测剂，检测细胞上清液中的分泌性AGPA。
[0152]图9:通过代谢工程进行膜复合糖的不同唾液酸化。NM-F9细胞于添加不同浓度ManNAc的无血清培养基(A)中或含FCS的培养基(B)中培养4天。通过细胞膜部分的硫代巴比土酸方法测定膜复合糖结合的唾液酸量。为进行对比，NM-wt细胞也于未添加ManNAc的含FCS的培养基中培养4天。
[0153]图10:通过代谢互补，细胞表面膜蛋白的不同唾液酸化。NM-F9细胞于添加不同浓度ManNAc的无FCS培养基中培养4天。为进行对比，NM-wt细胞也于未添加ManNAc的无FCS培养基中培养4天。使用识别无唾液酸TF表位的凝集素PNA进行流式细胞术分析。
[0154]图11:所分泌的rhGM-CSF通过代谢互补进行的不同唾液酸化。产生rhGM-CSF的细胞于添加(A)不同浓度ManNAc (O、50、70或90mM)和(B)-/+I或3mg/ml的唾液酸糖蛋白胎球蛋白的无血清培养基中培养4天。通过ELISA测定无唾液酸rhGM-CSF。首先，测定上清液中的rhGM-CSF浓度，然后将其调整至100ng/mL NM-F9细胞培养物。其次，为检测无唾液酸rhGM-CSF，抗人GM-CSF单克隆抗体用于捕捉rhGM-CSF，通过PNA检测无唾液酸N-聚糖及O-聚糖。
[0155]图12:不同唾液酸化rhGM-CSF对于TFl细胞的增殖活性。于无血清培养基中培养NM-F9细胞，并在培养基中添加递增的、最高达90mM的ManNAc CA),以及添加90mMManNAc和lmg/ml确定的血清唾液酸糖蛋白(B)以进行不同唾液酸化。使用含5ng/ml不同唾液酸化rhGM-CSF的NM-F9上清液培养TFl细胞48小时。Leukine? (酵母中产生)和Leukomax?(在大肠杆菌产生)被用作标准。通过BrdU-增殖测定方法使用无GM-CSF的NM-F9上清液作为阴性对照测定细胞增殖。具有高唾液酸化程度但非最高唾液酸化程度的rhGM-CSF是TFl细胞增殖的最具活性的生长因子。
[0156]图13:不同唾液酸化rhGM-CSF对于树突细胞的增殖活性。于无血清培养基中添加递增的、最高达90mM的ManNAc，培养NM-F9细胞以进行不同唾液酸化。使用含5ng/ml不同唾液酸化rhGM-CSF的NM-F9上清液培养NemodDC细胞24小时。LeukineO被用作标准。通过BrdU-增殖测定方法使用无GM-CSF的NM-F9上清液作为阴性对照测定细胞增殖。不同程度唾液酸化可对糖蛋白的所选活性具有积极或消极影响。
[0157]图14:增殖活性对rhGM-CSF浓度的依赖。于添加有90mMManNAc的无血清培养基中培养NM-F9细胞以获得rhGM-CSF的最高活性。使用含不同浓度rhGM-CSF的NM-F9细胞上清或不同浓度的Leukomax?分别培养TFl细胞48小时。通过BrdU-增殖测定使用无GM-CSF的NM-F9上清液作为阴性对照测定细胞增殖。完全人GM-CSF的活体外活性是大肠杆菌(Leukomax)或酵母(Leukine)表达的hGM-CSF的约500倍。
[0158]图15:rhGM-CSF增殖活性的抑制。于含+/_90mM ManNAc的无血清培养基中培养NM-F9细胞。使用5ng/ml唾液酸化rhGM-CSF (a)或非唾液酸化的rhGM-CSF (c)或Lpukine? (b)的NM-F9上清液培养TFl细胞48小时。使用不同浓度抗人GM-CSF抗体BVD2-23B6成功阻断rhGM-CSF。通过BrdU增殖测定使用无GM-CSF的NM-F9上清液作为阴性对照(d)测定细胞增殖。
[0159]下述实施例通过举例说明方式但非限制性方式提供。在实施例中，使用无污染活性的标准试剂和缓冲液。优选地小心避免核糖核酸酶及PCR产物污染。
[0160]实施例1:糖分布
[0161]研究了不同人细胞系的糖基转移酶CIGalTl、C2GNT-L、C2GNT-M、ST6GalNAc_1、ST6GalNAc-1、ST3Gal_1、ST3Gal_II 及 ST6Gal_I 的表达情况。于 DMEM 中培养 HEK293、LS174T、MCF-7 及 SW480 细胞系，而于 RPMI 1640 中培养 T47D、ZR75-1、NM-wt 及 KGl 细胞系。两种培养基中均被添加有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺。所有细胞于37°C、6% CO2的潮湿环境下生长。使用本领域普通技术人员已知的标准技术收获细胞并裂解。使用硫氰酸胍-酚-氯 仿方法提取RNA，使用无核糖核酸酶的DNA酶处理RNA。使用分光光度计方法测定RNA产量。
[0162]mRNA表达分析如下进行:使用随机核苷酸六聚物由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶逆转录5ug总细胞RNA。反转录混合物包括反转录酶、mRNA模板、引物、缓冲液及dNTP。β-肌动蛋白持家基因的表达用于测定cDNA产量和完整性以及检查基因组DNA的可能污染。为达此目的，设计跨内含子的肌动蛋白特异引物:肌动蛋白正向引物5’-GGCATC GTG ATG GAC TCC G-3’ 和 β -肌动蛋白反向引物 5’-GCT GGA AGG TGG ACA GCG Α-3’(扩增子长度，622bp)。
[0163]结果产生的cDNA链被直接用于扩增。设计正向和反向引物以特异杂交至编码前述酶类之一的cDNA的5’-(正向)及3’-区(反向)(扩增ClGalTl使用正向引物GAG ATT CCAGAG ATA CCA TTG 和反向引物 CGT TCA GGT AAG GTA GGT TG(扩增子长度 262);扩增 C2GNT使用正向引物GTG CTC AGA ATG GGG CAG GATGTC ACC TGG，反向引物TCA CTA CTA GGA TTCTCC CCAGCA AGC TCC (扩增子长度 360);扩增 ST3Gal_I 使用正向引物:ATG AGG TGG ACTTGT ACG GC，反向引物:AAC GGC TCCAGC AAG ATG (扩增子长度 375);扩增 ST3Gal_II 使用正向引物:CCC TGC TCT TCA CCT ACT CG，反向引物:GCA TCA TCC ACCACC TCT G (扩增子长度282) d/^t|ST6Gal-1 使用正向引物AAAAAC CTT ATC CCT AGG CTG C，反向引物:TGG TAGTTT TTGTGC CCA CA (扩增子长度 379);扩增 ST6GalNAc_I 使用正向引物:ACC ACA GCC AAGACG CTC，反向引物:AAG GGT GGT GCAAAG TGT TC (扩增子长度 407);扩增 ST6GalNAc_II使用正向引物:CTG CCA GTA AAT TCA AGC TGC，反向引物:TTG CTT GTGATG AAT CCA TAGG (扩增子长度 184) XPCR反应混合物含 1.5 μ IPCR缓冲液[IOOmM Tris-HCl (pH8.3)，500mMKC1],0.8-1.0 μ I 25mM MgCl2, 5 μ I cDNA, 1.5μ I 2mM 三磷酸脱氧核苷酸，0.2 μ IAmpliTaq聚合酶，0.2μ I 0.25 μ M β-肌动蛋白引物，0.7-0.8μ I 50 μ M的酶特异引物及水至体积为15μ I。PCR运行变性、退火及延伸的多个温度循环。循环条件为:94°C I分钟，59°C I分钟及72°C2分钟，在同一管内使用0.2μ1 β-肌动蛋白引物共扩增β-肌动蛋白。每一PCR反应进行两次。
[0164]26-28次循环后获得的PCR反应物等份于2 %琼脂糖凝胶进行电泳并通过溴乙锭染色强度进行定量。对于RT-PCR数据的半定量分析，每一 cDNA特异条带的染色强度与共扩增的β_肌动蛋白相应条带的染色强度对比。每一酶条带的染色强度通过计算比例[(酶条带的荧光单位/β-肌动蛋白的荧光单位)X 100]与合适的β_肌动蛋白条带相关。检出限是Ing双链DNA。该分析在最高达25ng的范围内均呈线性。
[0165]糖分布揭示了仅NM-wt细胞由于缺少C2GNT-L和C2GNT-M而具有合成core 2的完全缺陷。mRNA表达的其它减少涉及ST6GalNAc-1I减少至8%及ST3Gal_I减少至32%，可由完整的ST6GalNAc-1和ST3Gal_II补偿(表1)。NM_wt的所述糖基转移酶分布通过使用TF表位表现了未来糖工程和唾液酸化研究的最佳起点。
[0166]通过流式细胞术使用一些单克隆抗体和凝集素在前述人细胞系中检测尤其与唾液酸有关的碳水化合物决定子。
[0167]收获细胞，使用PBS洗2次，在37°C恢复I小时。对于神经氨酸酶处理，于添加或不添加霍乱弧菌(V. choIerae)神经氨酸酶的含0.l%CaCl2和0.4%NaCl的0.1M咪唑缓冲液(pH 6.8) 37°C培养细胞30分钟。在染色缓冲液(含4%BSA的HBSS或含10%FCS的培养基)中重悬细胞。对于细胞表面碳水化合物决定子的检测，使用不同抗体和凝集素。例如，使用生物素标记的凝集素花生凝集素(PNA)、来自波罗蜜的jacal in、尾穗觅(Amaranthuscaudatus)凝集素(觅色素(Amaranthin)或 ACA))及 Bauhinia purpura 凝集素(BPL)、及TF特异性单克隆抗体A78-G/A7分析TF的表达。PankoMab可检测tumor-MUCl，A83_C/B12是不依赖于糖基化识别血型糖蛋白A的抗GPA抗体。在4°C使细胞与凝集素或抗体一起培育I小时，使用染色缓冲液洗两次。通过第二抗体Cy3-山羊抗小鼠IgG/IgM抗体检测抗体的结合。通过Cy3_结合的链霉亲和素检测凝集素的结合。使用Coulter Epics XL流式细胞仪(Beckman Coulter, Germany)进行流式细胞计数分析。使用Expo32软件(BectonCoulter)进行定量分析。
[0168]除ZR75-1之外，人细胞为TF阴性。然而，当使用裂解去除唾液酸的神经氨酸酶处理细胞后，许多细胞系上隐蔽的TF可变得可见。在所分析的细胞系中，NM-wt细胞是隐蔽TF的主要载体。关于本发明，大量的原始的隐蔽TF和释放的唾液酸是有利的(表2)。
[0169]实施例2:新克隆的糖工程及鉴定
[0170]通过使用烷化剂甲磺酸乙酯处理NM-wt细胞进行随机诱变。每样品NM-wt细胞使用PBS洗涤并以IO6细胞/ml细胞培养基接种于添加EMS(0.lmg/ml,甲磺酸乙酯，Sigma-Aldrich)培养基，37°C及5%C02条件下培养过夜。洗涤细胞并添加新鲜培养基。每隔一天使用台盼蓝染色测定细胞活力，并通过免疫细胞化学染色分析细胞(图W。[0171]随后，使用TF特异抗体筛选暴露高TF表达新表型的细胞。使用B_PBS(PBS中含0.5%BSA)洗涤NM-wt细胞，使用50 μ I单克隆抗体A78-G/A7或PankoMab的杂交瘤培养物上清液和950 μ IB-PBS于4°C培养NM_wt细胞30分钟。洗涤细胞之后，使用50 μ I微珠(MicroBeads) (Miltenyi Biotec, Kolll, Germany)结合的大鼠抗小鼠 IgM 抗体或大鼠抗小鼠IgG抗体重复上述步骤。洗漆之后，按操作手册所述通过Miltenyi Biotec ( Κδ--?,Germany)提供的两个连续柱分离磁性标记的TF阳性细胞。培养9天之后，重复分离步骤共3次。以抗体染色开始FACS分析(流式细胞术):大约3 X IO5细胞使用第一单克隆抗体(A78-G/A7 (IgM), PankoMab (IgGl)的杂交瘤培养上清，均使用细胞培养基I '2稀释)于4°C培养1.5小时，然后使用第二抗体073结合的山羊抗小鼠1811/186抗体(使用？83 1:200稀释)于4°C培养30分钟并再次洗涤。通过流式细胞术检测重悬细胞(200 μ I PBS)。使用Expo32软件(Becton Coulter)使用下列用于抗体标记细胞的参数进行定量分析:前向散射(FS):26V，放大(gain) I ;侧向散射(SS):807V，放大5 ;FL2:740V，放大I，凝集素标记的细胞使用下列参数:FS:26V，放大1，SS:807V，放大5，FLl:740V，放大I。
[0172]分离三轮之后，得到含有93%TF阳性细胞的细胞群。然而，TF阳性细胞的百分比随时间而减少，在分离程序之后14天期间达到大约20%TF阳性细胞这一基础水平。为了稳定表达TF阳性表型，第四次分离细胞，最后于96孔培养板通过有限稀释(I个细胞/100 μ I)克隆所分离的TF阳性细胞。在所获得的30个细胞克隆中，13个细胞克隆表达高量的TF抗原，并且其中8个细胞克隆表现TF抗原于整个细胞群细胞表面均一表达(图1Α)。这些细胞克隆稳定表达TF抗原直至现在(大约30个月)。流式细胞术分析揭示了 NM-F9细胞的TF表达水平增加大约31倍，反映了 TF于该克隆的强烈表达，这还通过FACS分析大约35的消减均值被选择用于进一步的表征而证实。克隆以获得稳定的TF阳性细胞群的必要性归因于TF阴性细胞的高增殖率，因此在一定时间内生长超过TF阳性克隆，如NM-F9较NM_wt细胞具有较低的倍增速率。
[0173]另外，根据TF筛选进行MUCl筛选，但除了使用PankoMab和微珠(Mi ItenyiBiotec,Koln，Germany)结合的大鼠抗小鼠IgG抗体。为了生成表达更多肿瘤特异性MUCl表位TA-MUCl的TF阳性克隆，根据上述使用PankoMab筛选的方法处理、筛选及单细胞克隆NM-F9细胞。稳定克隆NM-D4由于其于流式细胞术中增加的PankoMab染色被筛选进行进一
步鉴定。
[0174]NM-F9和NM-D4可通过传代入具有逐渐降低浓度的胎牛血清(FCS)的培养基而适
应无血清培养基。
[0175]对NM-F9和NM-D4的碳水化合物决定子和转移酶表达进行详细鉴定。通过流式细胞术，使用实施例1描述的TF特异性抗体A78-G/A7及一些凝集素，如识别末端β-Gal的PNA,唾液酸特异的黑接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA),或其它例如山槐(Maackiaamurensis)凝集素 I(MAA)及荆豆(Ulex europaeus)凝集素 I(UEAI),测定可评估的膜复合糖的唾液酸化程度。使用PBS洗涤细胞两次及使用含4%BSA的 HBSS (Hanks’ Balanced Salt)洗涤一次之后，使用 HBSS/4%BSA 中与 FITC 结合的PNA(1:400)、FITC 结合的 SNA(1:50)、FITC 结合的 MAA(1:50)或 FITC 结合的 UEAI 于 4°C培养I小时。洗涤细胞之后，使用200 μ I的HBSS/4%BSA重悬细胞沉淀以用于分析。使用Expo32软件(Beckman Coulter)按照下列用于抗体标记细胞的参数进行定量分析:前向散射(FS):26V，放大I ;侧向散射(SS):807V，放大5 ;FL2:740V，放大I，对于凝集素标记细胞，使用以下参数:FS:26V，放大I ;SS:807V，放大5 ;FL1:740V，放大I (图2和3A)。
[0176]尽管野生型细胞的隐蔽TF阻止与A78-G/A7和PNA的结合，但衍生细胞NM-F9和NM-D4的暴露的TF，根据所使用的检测试剂不同，可使识别能力增强30-75倍。试验结果由SNA的反亲和力定性地证实(图1B)。另外，对膜结合唾液酸的量进行定量。简言之，收获细胞，使用 PBS 洗涤一次，于裂解缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8,150mM NaCl，0.5%NonidetP40, ImM EDTA, 200 μ g/ml苯甲基磺酰氟)结合针式剪切(needle sheering)裂解。粗制的膜部分通过40.0OOXg离心20分钟沉淀。沉淀使用水洗涤两次并冻干。上清液用于酶活性测定(见实施例3)。使用Rot1-Quant-Kit (Roth, Germany)测定蛋白浓度。膜复合糖结合的唾液酸的含量通过使用2M乙酸80°C水解沉淀I小时测定，所释放的唾液酸通过硫代巴比土酸方法(Aminoff，Biochem.J.81,384-392，1961)测定。NM-F9 和 NM-D4 细胞的膜结合唾液酸与野生型细胞相比被减少至大约三分之一(图1C，3B)。
[0177]实施例3:NM-F9细胞的基因缺陷分析
[0178]预期NM-F9细胞的TF暴露需要一些唾液酸转移酶、糖核苷酸生物合成途径或运载体的缺陷。不同酶的mRNA表达分析按实施例1所述进行，借此将NM-F9酶的凝胶带与NMit的凝胶带进行对比，显示了 UDP-GlcNAc-2-差向异构酶mRNA的总体缺乏(图4A)。NM-wt和NM-F9细胞中的UDP-GlcNAc-2-差向异构酶的酶活性于细胞上清液(见实施例2)中使用纸层析法检测14C-UDP-N-乙酰葡萄糖胺转化为14C-N-乙酰甘露糖胺来测定。IU相当于在37°C每分钟合成I μ mo I ManNAc。UDP-GlcNAc-2-差向异构酶活性从最初的NM_wt细胞中300U/mg至NM-F9细胞中完全下降(图4B)。
[0179]为研究NM-F9细胞重建唾液酸化的能力，在培养基中添加50mM ManNAc。培养4天后，余下的无唾液 酸糖表位如已述通过流式细胞术使用单克隆抗体A78-G/A7和A63-C/A9,及凝集素PNA、SNA及MAA进行检测。添加ManNAc的代谢互补根据检测试剂导致大约50% (PNA)至80%(A78-G/A7)隐蔽膜复合糖TF。由于UDP-GlcNAc-2-差向异构酶缺陷，对照GlcNAc不能被NM-F9细胞代谢(图5)。
[0180]另外，研究了通过基因互补的唾液酸化重建。
[0181]将UDP-GlcNAc-2-差向异构酶cDNA克隆至pcDNA3.1载体。使用SuperFect试剂利用编码差向异构酶的构建体pcDNA3.1Zeo (-) /2Epi稳定转染NM-F9细胞。细胞生长至40%汇合。于150ml DMEM中溶解5 μ g DNA,并与30 μ I SuperFect混合。于室温培育10分钟后，将该溶液添加至细胞。3小时后去除培养基，使用PBS洗涤细胞三次，使用新鲜生长培养基培养。培养48小时后，使用含70(^/11116418或75(^8/1111 zeocin更换生长培养基。抗性克隆被连续保持在含400 μ g/ml G418或250g/ml zeocin的生长培养基中，并通过流式细胞术分析。单克隆抗体A78-G/A7和A63-C/A9，和凝集素PNA和SNA被用于检测无唾液酸糖表位。唾液酸化程度被完全恢复(图6)。
[0182]实施例4:分泌性糖蛋白于NM-F9细胞的重组表达
[0183]通过使用电穿孔术，使用表达载体pGT60hGM-CSF(InViVogen，USA)转染细胞产生稳定表达重组人生长因子rhGM-CSF的NM-F9细胞。为了进行电穿孔术，收获IO6细胞，洗涤，使用400 μ I高渗缓冲液(Eppendorf，Germany)重悬，于室温培育15分钟。之后，将细胞悬液与8 μ g质粒DNA混合,并将其转移至具有2mm间隙的电穿孔试管中(Eppendorf)。通过使用340V电压和5微秒时间于Multiporator (Eppendorf)进行电穿孔术。于培养基(10%FCS，溶于RPMI1640的1%谷氨酰胺，Biochrom)电穿孔恢复1-2天后，使用100 μ g/ml抗生素潮霉素B筛选稳定转染的细胞并通过有限稀释技术克隆。大约4周后，使用可用于进行GM-CSF含量定量的GM-CSF特异ELISA (Becton-Dickenson, USA)分析一些细胞克隆上清液中分泌性rhGM-CSF的存在。筛选具有最高rhGM-CSF分泌速率的一个细胞克隆用于进一步试验。
[0184]在第一个试验中，大约IO5稳定表达GM-CSF的NM-F9细胞于含有和不含胎牛血清(FCS)的培养基(见上述)中培养。在培养I天、2天、3天及4天后，不更换培养基在一定时间累积的分泌性rhGM-CSF的量通过使用GM-CSF特异的ELISA测定。无论是使用或不使用FCS培养，IO5细胞于4天内独立释放大约14ng GM-CSF (图7)。当使用FCS培养时，I天后的分泌速率比不使用FCS (大约4ng/ml)培养稍高(大约6ng/ml)。 [0185]使用表达载体构建体secGPA在NM-F9细胞中以分泌性无唾液酸化血型糖蛋白A的形式重组表达人膜蛋白血型糖蛋白A(GPA)。SecGPA含有编码无跨膜结构域及胞质尾区的GPA的N末端91个氨基酸(aa)的cDNA。所述cDNA被亚克隆至真核表达载体 pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO 和 / 或 pcDNA3.1/myc-His C(均来自 Invitrogen)。另外，NM-F9细胞用于表达分泌性AGPA蛋白的重组融合蛋白，其中内源性信号肽被外源性人信号肽取代。因此，使用本领域普通技术人员已知的分子生物学方法，构建cDNA secGM/GPA、secTCRGPA及secAK/GPA，其中为代替编码N末端19个氨基酸的cDNA，整合入编码GM-CSF(MWLQSLLLLGTVACSIS, secGM/GPA)、T 细胞受体(MACPGFLWALVISTCLEFSMA, secTCR/GPA)或抗体K轻链(METDTLLLWVLLLWVPPGSTCD，secAK/GPA)信号肽的外源性cDNA。后两种信号肽为本领域普通技术人员已知作为外源性信号肽增加任何基因产物的分泌性表达。对于secGM/GPA，在信号肽和GPA编码骨架之间还多表达一个丙氨酸。将这三个cDNA构建体亚克隆至上述表达载体，确认核苷酸序列。
[0186]通过使用上述操作程序、电穿孔术、使用潮霉素B筛选及单细胞克隆，将每一所得的表达载体用于产生稳定转染的NM-F9细胞。在使用表达载体pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO时，使含有由两个FRT重组酶识别位点构成的IacZeo DNA盒(Invitrogen)的基因修饰NM-F9细胞与pcDNA5/FRT/V5-His-T0P0和重组酶表达载体pOG44(Invitrogen)共转染。通过夹心ELISA，使用A83-CB12抗体捕捉细胞培养上清以外的任何GPA和识别位于细胞外结构域的 TF-抗原的 A63-C/A9 抗体，筛选表达 secGM/GPA、secTCR/GPA、secAK/GPA 或 secGPA的细胞克隆的释放至细胞培养基中的分泌性AGPA的分泌。图8显示产生最大量分泌性AGPA(每ml和每IO5细胞最高达40ng)的细胞克隆为secGM/GPA构建体产生。使用其它构建体，最高可检测到每ml和每IO5细胞为13ng分泌性AGPA。另外，当secGM/GPA构建体被用作表达载体时，产生分泌性AGPA的细胞克隆数显著增多(图8)。
[0187]实施例5:代谢互补的不同唾液酸化
[0188]参照使用50mM ManNAc (图5)对NM-F9细胞的代谢互补获得的唾液酸化的部分重建，详细研究了确定量糖中间体对唾液酸化的影响。于含或不含FCS的培养基中在0-90mMManNAc存在下培养NM-F9细胞，通过硫代巴比土酸法分析细胞膜的唾液酸化程度(见实施例3)。可以证明细胞唾液酸化程度可于FCS存在或不存在情况下使用增加量的ManNAc通过代谢互补被控制(图9)。无FCS培养基中未添加ManNAc时，于NM-F9细胞的膜部分仅检测到低量的唾液酸。唾液酸化程度随添加至无FCS培养基中的不断增加的ManNAc的而逐渐增加，在50mM ManNAc时达到平台期。另外在添加30mM ManNAc的含FCS的培养基中获得了唾液酸化的进一步增加。当含FCS的培养基中添加90mM ManNAc时，获得与原始NM_wt细胞水平相当的最高唾液酸化程度。
[0189]通过流式细胞术，使用识别无唾液酸TF表位并因此与唾液酸化程度呈负相关的凝集素PNA分析使用不同浓度ManNAc进行代谢互补的膜蛋白的不同唾液酸化。结果显示不仅细胞膜中的唾液酸量而且膜中糖蛋白上的唾液酸化程度均可受使用不同量ManNAc的代谢互补的控制(图10)。于培养基中随着存在的ManNAc的增加可观察到逐渐增加的唾液酸化程度。使用90mM ManNAc，NM-F9细胞中糖蛋白的唾液酸化程度几乎与NM-wt细胞中一样闻。
[0190]最后，检测了分泌性蛋白rhGM-CSF唾液酸化程度是否也可受添加ManNAc和血清蛋白代谢互补的控制。使用不断增加量的0_90mM ManNAc及另外90mM ManNac在lmg/ml和3mg/ml唾液酸糖蛋白胎球蛋白存在下再培养rhGM-CSF表达载体稳定转染的NM-F9细胞(见实施例4)。4天后，通过ELISA测定结果产生的细胞培养上清液中rhGM-CSF的浓度(见实施例4)，然后将其调整至100ng/ml细胞培养基。为测定无唾液酸rhGM-CSF的唾液酸程度，建立夹心ELISA方法。简言之，GM-CSF特异的ELISA的抗人GM-CSF单克隆抗体(Becton-Dickenson)被用于捕捉rhGM-CSF，因此以1:250稀释度溶于PBS，铺于微孔板上，4°C过夜。使用PBS/0.05%Tween 20洗涤之后，使用溶于PBS的10%FCS封闭，向微孔板添加100 μ I细胞培养上清， 室温培养2小时。使用生物素化PNA(5-10g/ml)和过氧化物酶结合的链霉亲和素(以1:250稀释)检测无唾液酸O-聚糖。证实了所分泌的重组糖蛋白，例如rhGM-CSF可通过向NM-F9细胞中补充增加量的ManNAc而被不同唾液酸化(图11)。通过向90mM ManNAc添加lmg/ml胎球蛋白取得最高程度的唾液酸化。向90mM ManNAc添加3mg/ml胎球蛋白不会导致唾液酸化进一步增加。
[0191]实施例6:通过测定不同唾液酸化形式的活性鉴定高活性人GM-CSF
[0192]为评价所述不同唾液酸化蛋白的活性，筛选GM-CSF刺激增殖的能力。于含有添加
0、30、50、70及90mM ManNAc和90mMManNAc同lmg/ml胎球蛋白的无血清培养基的不同制品中培养表达rhGM-CSF的NM-F9细胞(见实施例4和5)。按照实施例5所述检测唾液酸化。将增殖速率均依赖于GM-CSF的TF-1细胞或单核树突细胞系NemodDC，分别与被调整不同唾液酸化rhGM-CSF为5ng/ml的细胞上清液一起培养48小时或24小时。根据厂商的方法(Roche Diagnostik GmbH, Mannheim, Germany),通过BrdU增殖测定测定细胞增殖。固定之后，使用POD标记的抗BrdU抗体培养细胞。使用IM硫酸终止随后的染色反应，并使用分光光度法在450nm (以690nm参照)光密度下检测。无GM-CSF的NM-F9上清被用作阴性对照。Schering AG 的商品Leukine?及Schering-Plough的Leukomax?，分别为酵母和大肠杆菌中表达的非唾液酸化rhGM-CSF形式，被用作标准。
[0193]令人吃惊的是，rhGM-CSF的刺激细胞增殖活性很大程度上依赖于rhGM-CSF的唾液酸化程度，rhGM-CSF的一种唾液酸化形式显示最高活性，为从含90mM ManNAc的培养物中获得的高唾液酸化但非最大程度唾液酸化。所述rhGM-CSF当与LeukinelS(ioo%)比较时，显示TF-1细胞和NemodDC的刺激增殖活性增加大约178±10% (图12和13)。发现可商购的rhGM-CSF Leukomax?和Leukine?的细胞增殖活性较NM-F9细胞表达的最大活性唾液酸化形式的活性低(图12)。0.01ng/ml来自NM-F9细胞的最佳唾液酸化形式取得了使用5ng/ml Leukomax?或Eeukine?观察到的最大增殖活性(与Leukine?或Leukomax?相比小约500倍的GM-CSF)。当于相同浓度的Leukine?、Leukomax?或rhGM-CSF的最佳唾液酸化形式分析活性时，活性的增加最高达5倍(图14)。
[0194]如果将抗人GM-CSF抗体BVD2-23B6添加至TFl细胞增殖测定中，可特异性阻断GM-CSF活性。在5 μ g/ml的抗体浓度下，由；Leukine?或rhGM-CSF的最佳唾液酸化形式刺激的TF-1细胞增殖被阻断约60%，于40 μ g/ml的抗体浓度下完全消失(图15)。
[0195]序列表:
[0196]SEQ ID NO 1:甲硫氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸 、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、丝氨酸
【权利要求】
1.人细胞系NM-F9 (DSM ACC2606)或 NM-D4 (DSMACC2605)。
2.一种表达糖蛋白的方法，包括在权利要求1的细胞系的细胞中表达所述糖蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述糖蛋白为人源的。
4.权利要求2或3的方法，其中所述糖蛋白选自:细胞因子及其受体，如肿瘤坏死因子TNF-α及TNF-β ;肾素；人生长激素及牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链及B链；促性腺激素如促卵胞生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、促甲状腺激素及人绒毛膜促性腺激素(hCG);降血钙素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、因子VI1、组织因子及血管假性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C ;心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子如尿激酶、人尿和组织型纤溶酶原激活剂；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；人巨噬细胞炎症蛋白；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A链及B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A及蛋白D ;类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子、神经营养因子_3、神经营养因子-4、神经营养因子-5、神经营养因子-6及神经生长因子-β ;血小板源生长因子；成纤维细胞生长因子；表皮生长因子；转化生长因子如TGF-α及TGF-β ;胰岛素样生长因子-1及胰岛素样生长因子-1I ;胰岛素样生长因子结合蛋白AD蛋白如⑶-3、⑶-4、⑶-8及⑶-19 ;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白；干扰素如干扰素-α、干扰素和干扰素-Y ;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF ;白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-12 ;超氧化物歧化酶；Τ-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；抗体及免疫粘合素；血型糖蛋白A、MUC1。
5.—种表达病毒、病毒颗粒或病毒蛋白的方法，包括在权利要求1的细胞系的细胞中表达所述病毒、病毒颗粒或病毒蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述病毒、病毒颗粒或病毒蛋白选自:肠病毒如鼻病毒、脊髓灰质炎病毒和口疮病毒；疱疫病毒如单纯疱疫病毒、伪狂犬病病毒和牛疱疫病毒；正粘液病毒如流感病毒；鼠疫病毒；杆状病毒；副粘病毒如新城鸡瘟病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒；逆转录病毒如人免疫缺陷病毒、细小病毒和乳多空病毒；轮状病毒；冠状病毒；黄病毒如黄热病病毒和壁虱脑炎病毒；引起肝炎的病毒如甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。
7.—种产生具有唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的一种缺陷的表达细胞系的方法，包括从具有识别分子的原代细胞或细胞系筛选表达细胞系，所述识别分子结合可被至少两种酶唾液酸化的去唾液酸化结构。
8.权利要求7的方法,其中来自原代细胞或细胞系的细胞于筛选前被诱变。
9.权利要求7或8的方法，其中所述结构为O-聚糖。
10.权利要求7的方法，其中去唾液酸化结构可通过α2_3和α2-6结合的唾液酸唾液酸化。
11.权利要求7的方法，其中所述识别分子为凝集素或碳水化合物特异性抗体。
12.权利要求7的方法，其中识别分子为识别core-1结构的凝集素或碳水化合物特异性抗体。
13.权利要求7的方法，其中表达细胞系来自Per.C6、HEK293、K562、CVU C0S-7、杂交瘤细胞、NamaIwaλ BHK 及 CHO。
【文档编号】C07K14/535GK103627670SQ201210539948
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2005年2月14日 优先权日:2004年2月13日
【发明者】S·戈莱兹, H·鲍迈斯特, U·舍贝尔 申请人:格莱克托普有限公司