专利名称：天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖链的化学合成领域、尤其是涉及化学合成糖蛋白的糖链的简便方法及其合成中间体。
背景技术：
糖蛋白是指含有称为糖链的寡糖部分的蛋白质。
目前已经发现，糖蛋白与细胞粘附或信号传导等生物学过程密切相关，而且已逐渐知道触发不同生物学过程的糖链结构。然而，仅少量糖蛋白在活体内表达为糖链，以介导生物学过程，而且获得足够量的纯的糖蛋白以测定糖链的理化性质是非常困难的。
天冬酰胺结合型糖蛋白是一种在人血清或卵清蛋白中广泛存在的糖蛋白。按照糖链的分枝和/或组成糖的特征，天冬酰胺结合型糖蛋白可分为高甘露糖型、复合型和混合型。所有这些类型都具有共同的五糖核心糖链结构，该五糖在链的还原端包含3分子甘露糖和2分子N-乙酰葡糖胺； 天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构因此，上式所示的核心糖链结构的化学合成，为天冬酰胺结合型糖链的功能研究提供了基础。
发明内容
然而，尚不知道合成天冬酰胺结合型糖链的核心糖链结构的有效方法。原因之一是因为核心糖链结构含有很难化学合成的部分。
在核心糖链结构的化学合成中，特别困难的是形成甘露糖β-糖苷键，该键是β-甘露-糖苷键(Manβ1→4-GlcNAc)。这是由于以下事实所致邻基效应是无用的，因为甘露糖的2-OH基团连接在直立位置(axial position)上，而β-甘露糖苷键给糖中常见的端基异构效应带来电不稳定结构。Kunz等公开了制备β-甘露糖苷结构的化学方法，该方法包括一个复杂的过程，而且耗时、成本高(Kunz，H.和Gunther，W.(1988)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27，1086-1087)。
之所以难以形成β-甘露糖苷键(Manβ1→4-GlcNAc)的其它原因是糖苷化反应的受体是N-乙酰葡糖胺，其在反应介质中的溶解度低，而且4-OH基团的活性要比其它OH基团的活性低(OH基团的活性1-OH＞＞6-OH＞＞2-OH＞3-OH＞4-OH)。
此外，在天冬酰胺结合型糖链的核心糖链结构的化学合成中，GlcNAcβ1→4GlcNAc结构的合成存在一些困难。
如上所述，在天冬酰胺结合型糖链的核心糖链结构的化学合成中，三糖(Manβ1→GlcNAcβ1→4GlcNAc)在还原端的合成尤其存在很大困难。为了合成核心糖链结构，尤其是怎样有效合成β-甘露糖苷键，这是一个有待解决的问题。
本发明的发明人将注意力集中在具有甘露糖苷β1→4键结构的天然多糖(尤其是具有甘露糖苷β1→4键的半乳甘露聚糖、瓜尔胶和甘露聚糖)上。
本发明的目的是通过使用在天然多糖结构中包含Manβ1→4Man的二糖单元，解决合成核心糖链结构、尤其是形成β-甘露-糖苷键的问题，并且建立合成核心糖链结构的有效方法。
因此，本发明涉及包括下述步骤的方法(1)制备下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步骤 其中P1是OH保护基，波浪线表示-OP1连接在直立或平伏位置(equatorial position)或两者的混合，即通过水解具有甘露糖β-1，4-键的多糖，优选具有甘露糖β-1，4-键的半乳甘露聚糖、瓜尔胶或甘露聚糖，更优选下式(V)所示的半乳甘露聚糖衍生物 (n为50以上的整数)或者下式(VI)所示的甘露聚糖衍生物 (n为50以上的整数)并且保护所得化合物的羟基，(2)将所得的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)转化成烯糖(glycal)化合物的各步骤，其中通过卤化并还原甘露糖二糖，将甘露糖二糖化合物还原端的甘露糖转化成烯糖，和(3)通过上述烯糖化合物的叠氮化硝化反应(azidenitrationreaction)，制备下式(II)所示的叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)，其中甘露糖还原端的2-叠氮基连接在平伏位置； 其中P1的定义同上，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合；(4)用离去基团取代叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的各步骤，优选(4-1)用-OP10基团(P10为OH保护基)取代叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基，除去P10基团后，与三卤代乙腈反应而制备三卤代乙亚胺酸酯(trihaloacetoimidate)衍生物，或者(4-2)用离去基团取代叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基，和(5)通过使上述衍生物反应，制备下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型) 其中P1、P2、P3和P11的定义同上，其中离去基团是由氨基-保护的下式吡喃葡萄糖苷引入的 其中P2和P11为OH保护基，P3为氨基保护基，和(6)制备下式(IV)所示的天冬酰胺结合型三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)的步骤
其中P1和P2的定义同上，P4和P6独立地为氨基保护基，P5为羧基保护基，以及当在天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端上制备三糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)时，各步骤的方法。
此外，本发明涉及下式(II)的叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)，该化合物在本发明方法中是有用的合成中间体 其中P1为OH保护基，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合，并且涉及下式(III)所示的三糖化合物 其中P1、P2和P11为OH保护基，P3为氨基保护基。
按照本发明，容易合成天冬酰胺结合型糖蛋白糖链的核心糖链结构还原端的三糖部分(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)，并且可将其用于阐明引起不同生命过程的天冬酰胺结合型糖蛋白的功能和结构特征。
实施本发明的最佳方式合成本发明的核心糖链结构的新路线概述如下；
其中波浪线表示-OP1或硝基连接在直立或平伏位置或两者的混合。
首先，具有甘露糖β-1，4-键的多糖经酸水解并且所得产物乙酰化后，得到二糖化合物(I)Manβ1→4Man。然后，将其转化为烯糖衍生物，其中还原端的甘露糖通过化学方法转化成烯糖，接着通过叠氮化硝化反应，得到化合物(II)。在还原端具有平伏2-叠氮基的化合物(II)可转化成核心糖链结构的Manβ1→4GlcNAc部分，作为有用的关键中间体。
因此，容易将中间体(II)转化成Manβ1→4GlcNAc部分(该部分通过其它合成方案是难以制备的)，同时容易以合理成本、由化合物(I)大规模地制备中间体(II)，而化合物(I)可得自半乳甘露聚糖、瓜尔胶或甘露聚糖衍生物。此外，当中间体(II)用作糖基供体时，合成容易转化成核心糖链结构还原端的三糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)的三糖化合物(III)。
因此，本发明的发明人通过使用廉价可得的天然多糖，成功地简化了在核心结构还原端合成三糖的流程。
下面将详细说明本发明方法的各个步骤。
步骤(1)在步骤(1)中，由具有甘露糖β-1，4-键的多糖制备甘露糖二糖(ManP1β1→4ManP1)化合物(I)。首先，水解具有甘露糖β-1，4-键的多糖，保护OH基团，分离得到所需二糖。
作为原料，使用具有甘露糖β-1，4-键的多糖，优选具有甘露糖β-1，4-键的半乳甘露聚糖、瓜尔胶或甘露聚糖，更优选下式(V)的半乳甘露聚糖衍生物 其中n为50以上的整数；或者下式(VI)的甘露聚糖衍生物 其中n为50以上的整数。
半乳甘露聚糖(galactomannan)衍生物(也称为半乳甘露聚糖(galactomannoglycan)广泛存在于苜蓿或三叶草等豆科植物种子中。瓜尔豆(Cyamopsis tetragonolobus)和长角豆或槐豆(Ceratonia siliqua)种子中的半乳甘露聚糖是市售的植物源性树胶类产品。
从瓜尔豆种子中提取的瓜尔胶是包含一系列甘露糖β-1，4-键的直链糖链的天然多糖，其中半乳糖通过α1→6键连接每个甘露糖残基，作为支链。该物质的主要用途是食品添加剂，例如各种罐头食品的增稠剂、品质改良剂(防止外形松散)或各种食品的调味剂，它们容易以非常低廉的价格购得。
甘露聚糖(mannan)衍生物是由D-甘露糖组成的多糖的通称。象牙果的内胚乳或兰科植物球茎中所含有的植物甘露聚糖衍生物具有支链结构，其中D-甘露糖残基通过β-1，4-键连接，并且不溶于水。
上述内容详细描述于″Comprehensive Dictionary for Utilization ofRegional Biological Resources″，Hiroshi Fujimaki主编，1998，RuralCulture Association；Y.C.Lee等(1977)Analytical Biochem.，79，329-337；和Shiryo Yaga等(1995)Mokuzai Gakkaishi，第41卷，第4期，440-443。
通常，酸水解用于水解具有甘露糖β-1，4-键的多糖。为此，使用硫酸、优选10-20％硫酸、三氟乙酸或硫酸-乙酸，优选的反应温度为50-70℃。
通过分离溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖，除去聚合度为9以上的材料。一般而言，聚合水平再升高，则衍生物就会存在不溶性残基。
为了保护羟基，通常使用乙酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、甲氧基甲基、四氢吡喃基(tetrahydropiranyl)、三甲基甲硅烷基和三乙基甲硅烷基等。
用硅胶色谱和/或HPLC，进行二糖的分离。
步骤2在步骤2中，由甘露糖二糖化合物(I)(ManP1β1→4ManP1型)制备烯糖化合物。首先，通过还原端甘露糖1位的卤化反应、接着通过还原反应，由二糖制备烯糖化合物。通常，在室温下，使用卤化氢或酰卤等卤化甘露糖。使用锌等金属进行还原反应，同时避免反应在高温下进行。
步骤3在步骤3中，通过烯糖化合物的叠氮化硝化反应，制备还原端甘露糖的2-叠氮基连接在平伏位置的叠氮二糖化合物(II)。
通过同时叠氮化和硝化，进行叠氮化硝化反应。得到平伏异构体和直立异构体的混合物，通过纯化该混合物，将在还原端甘露糖的平伏位置具有2-叠氮基的化合物分离出来。
步骤4在步骤4中，叠氮二糖化合物中的硝基被离去基团取代，该离去基团通常包括氟、溴、氯、三氯乙亚胺酸酯基、4-戊烯基、烷硫基和芳硫基。
优选叠氮二糖化合物中的硝基被-OP10基团取代(P10为OH保护基)，除去P10基团后，通过与三卤代乙腈反应而得到三卤代亚胺酸酯衍生物，或者通过与卤化氢反应，得到卤化衍生物。或者，-OP10衍生物或P10-脱保护的衍生物可转化成具有戊烯基、乙酰基硫基或芳硫基等等离去基团的衍生物。
步骤5在步骤5中，使所得具有离去基团的衍生物与氨基-保护的吡喃葡萄糖苷反应，制备三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)。
按照以下流程，可制备氨基-保护的吡喃葡萄糖苷。
作为氨基保护基的P3基团，通常使用邻苯二甲酰亚氨基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、乙酰基、苯甲酰基或苄基等。
然后，在酸性(路易斯(Lewis)-酸)条件下，使该化合物与上述具有离去基团的衍生物反应。
步骤6在步骤6中，将三糖化合物与天冬酰胺偶联。与天冬酰胺的偶联是按照例如以下流程实施的。
以上制备的三糖可以与所需蛋白质的天冬酰胺残基偶联，该糖链可以通过添加新糖单元而延伸。另外，也可将通过向三糖添加糖单元而制备的预先延伸糖链引入到所需蛋白质上。
或者，当标准肽化学用于天冬酰胺结合型三糖衍生物的天冬酰胺残基时，可以延伸蛋白质序列。另外，当标准碳水化合物化学用于还原端甘露糖时，可以延伸糖链。
实施例下述实验将更详细地说明本发明，但并不是对本发明的限制。
实验所用材料得自以下市售来源。
SANSHO Co.，Ltd.(Food DiVision)瓜尔胶MEYPROGAT 120SKANTO CHEMICAL CO.，INC锌粉五水硫酸铜(II)(结晶粉末)硝酸二铵铈(IV)Wako Pure Chemical Industries，Ltd.
乙酸钠乙酸酐三氟乙酸叠氮化钠DBU，1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯CCl3CN，三氯乙腈BF3OEt2，三氟化硼乙醚络合物乙酸，用于有机合成吡啶，用于有机合成四氢呋喃，THF，用于有机合成CH2Cl2，二氯甲烷，用于有机合成乙腈，用于有机合成乙酸乙酯氯仿甲苯无水MgSO4三乙胺Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.
30％HBr-AcOH，30％溴化氢/乙酸Nacalai Tesque，Inc.
苄胺Japa Alcohol Trading CO.，LTD99％乙醇实施例11.瓜尔胶的水解和Manβ1→4Man的分离合成流程(1) 1.1.瓜尔胶的水解(小规模)(A)用TFA水解瓜尔胶，得到溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖。
将2.0g瓜尔胶(1)溶于16.6ml 1N TFA中，在油浴中边搅拌边加热至110℃达90分钟。将反应混合物倒入40ml 99％EtOH中，放在室温下。用布氏漏斗过滤，除去所得白色沉淀，真空浓缩滤液。将甲苯加入到残余物中，共沸蒸馏几次，得到溶于70％EtOH的2.26g半乳甘露聚糖(2)和不溶于70％EtOH的73mg半乳甘露聚糖(3)。
用MALDI-TOFMS对溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖(2)进行分析表明，其聚合度下降至1-8。
(B)将溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖乙酰化，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-α-和β-D-吡喃甘露糖苷(4)。
将以上得到的溶于70％EtOH的2.26g半乳甘露聚糖(2)溶于23ml吡啶中，向在冰浴中冷却的溶液中加入23ml乙酸酐，在10℃搅拌22小时。向反应混合物中加入冰水，用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液，所得残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到450mg所需产物(4)。
样品；α∶β＝2∶1的混合物；[a]D-0.5(c 0.012，氯仿)；1H NMRδ(CDCl3)1.99～2.19(all s，24H，8COCH3)，3.64(m，1H，H-5’)，3.77(m，1/3H，H-5β)，3.95～4.13(m，2+2/3H，H-5α，H-4β，H-4α和H-6’b)，4.23～4.37(m，3H，H-6bβ，H-6aα，H-6bα，H-6a’和H-6aβ)，4.72(d，1/3H，Jβ1’，2’＝1.1Hz，H-1β’)，4.75(d，2/3H，Jα1’， 2’＝1.1Hz，H-1α’)，5.04(m，1H，H-3’)，5.17～5.25(m，2H，H-4’，H-2α和H-3β)，5.39～5.45(m，2H，H-2’，H-2β和H-3α)，5.81(d，1/3H，Jβ1，2＝1.1Hz，H-1β)，6.03(d，2/3H，Jα1，2＝2.0Hz，H-1α).
C28H38O19的分析计算值C，49.56；H，5.64；实测值C，49.34；H，5.67。
HR-FAB MS[M+Na]+C28H38O19Na的计算值701.191；实测值709.190。
T.L.C；Rf＝0.30(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
1.2.瓜尔胶的水解(大规模)(A)′用TFA水解瓜尔胶，得到溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖。
将200g瓜尔胶(1)溶于1660ml 1N TFA中，在带有机械搅拌的油浴中加热至110℃达35分钟。当瓜尔胶悬浮时，将混合物超声处理15分钟并在110℃机械搅拌80分钟。将反应混合物在冰浴中冷却，倒入4升99％EtOH中，放在室温下。用布氏漏斗过滤，除去所得白色沉淀，真空浓缩滤液。将甲苯加入到残余物中，共沸蒸馏几次，得到溶于70％EtOH的200.3g半乳甘露聚糖(2)和不溶于70％EtOH的9.9g半乳甘露聚糖(3)。用MALDI-TOFMS对溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖(2)进行分析表明，其聚合度下降至1-8。
(B)′将溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖乙酰化，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-α-和β-D-吡喃甘露糖苷(4)。
将以上得到的溶于70％EtOH的200.3g半乳甘露聚糖(2)溶于2100ml吡啶中，向冰浴冷却的溶液中加入2100ml乙酸酐，在10℃搅拌22小时。向反应混合物中加入冰水，用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液，所得残余物用硅胶柱色谱法部分纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到25.2g所需产物(4)。2.O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(8)的合成合成流程(2) (C)溴化O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖(5)的合成将2.20g化合物(4)溶于19ml乙酸，向溶液中加入4.6ml 30％HBr-AcOH，将所得混合物在室温下避光搅拌150分钟。在T.L.C上证实反应终止后，将冰水加入到反应混合物中，所得产物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液，得到含有所需产物(5)的2.21g残余混合物。
T.L.C；Rf＝0.35(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(D)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-D-糖醇(6)的合成向在冰水浴中冷却的三颈烧瓶中，依次加入3.8ml乙酸、7.6ml水、2.06g乙酸钠、0.20g五水硫酸铜和1.65g锌，同时用机械搅拌器搅拌。然后，将含有化合物(5)的反应混合物溶于7.6ml乙酸中，将其加入到以上在冰水浴中冷却的反应混合物中，将所得混合物在室温下避光搅拌4小时。在T.L.C上证实反应终止后，通过硅藻土过滤从反应混合物中除去锌，将冰水加入到滤液中。产物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液。残余物用快速硅胶色谱法纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到0.64g所需产物(6)。
由化合物(4)的收率36％。
1H NMRδ(CDCl3).200，2.05，2.08，2.10，2.12 and 2.17(all s，18H，6COCH3)，3.66(ddd，1H，J4’，5’＝9.8Hz，J5’，6a’＝5.8Hz，J5’，6b’＝12.2Hz，H-5’)，4.05(dd，1H，J3，4＝6.0Hz，J4，5＝8.1Hz，H-4)，4.12(dd，1H，J5’，6b’＝2.6Hz，J6a’，6b’＝12.2Hz，H-6b’)，4.13-4.17(m，1H，H-5)，4.23(dd，1H，J5，6b＝5.3Hz，J6a，6b＝12.2Hz，H-6b)，4.30(dd，1H，J5’，6a’＝5.8Hz，J6a’，6b’＝12.2Hz，H-6a’)，4.42(dd，1H，J5，6a＝2.9Hz，J6a，6b＝12.2Hz，H-6a)，4.79(dd，1H，J1，2＝6.1Hz，J2，3＝3.1Hz，H-2)，4.86(d，1H，J1’，2’＝1.1Hz，H-1’)，5.05(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝10.1Hz，H-3’)，5.22(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，5.45(dd，1H，J1’，2’＝1.1Hz J2’，3’＝3.4Hz，H-2’)，5.51(m，1H，H-3)，6.40(dd，1H，J1，2＝6.1Hz，J双键顺式＝1.2Hz，H-1)13C NMRδ(CDCl3)20.5-21.0(m，6COCH3)，61.8(C-6)，62.5(C-6’)，65.9(C-4’)，68.5(C-3and C-2’)，70.8(C-3’)，72.6(C-5’)，74.0(C-4)，74.4(C-5)，97.9(C-1’)，99.0(C-2)，145.6(C-1)，169.5-170.6(m，6COCH3)T.L.C；Rf＝0.40(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(E)硝酸O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-和β-D-吡喃葡萄糖苷(7)的合成将510mg化合物(6)溶于5.4ml无水乙腈中，在-20℃搅拌。向该溶液中，加入89mg叠氮化钠(NaN3)，然后每隔15分钟分4次加入1.50g硝酸二铵铈(IV)。将反应混合物在氦气氛下、在-20℃搅拌18小时。在T.L.C上证实反应终止后，将冰水加入到反应混合物中，所得产物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液，得到含有所需产物(7)的460mg残余物。
T.L.C；Rf＝0.50(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(F)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(8)的合成将含有化合物(7)的460mg残余物溶于2.0ml乙酸中，向该溶液中加入170mg乙酸钠，在80℃油浴中搅拌75分钟。在T.L.C上证实反应终止后，将冰水加入到反应混合物中，产物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液。残余物用快速硅胶色谱法纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到360mg含有所需产物(8)和O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃甘露糖苷(9)的残余物。将混合物加热溶于少量EtOH中，再在冰水中冷却，得到晶体。因此得到201mg所需产物。
T.L.C；Rf＝0.39(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
由化合物(6)的收率33％。
1H NMRδ(CDCl3)1.99，2.05，2.10，2.12，2.17 and 2.20(all s，21H，7COCH3)，3.51(dd，1H，J1，2＝3.8Hz J2，3＝10.5Hz，H-2)，3.61(ddd，1H，J4’，5’＝9.9Hz，J5’，6a’＝5.0Hz，J5’，6b’＝2.8Hz，H-5’)，3.83(t，1H，J4，5＝10.2Hz，H-4)，3.99(m，1H，H-5)，4.12(dd，1H，J5’，6b’＝2.8Hz J6a’，6b’＝12.3Hz，H-6b’)，4.24(dd，1H，J5，6b＝3.7Hz J6a，6b＝12.5Hz，H-6b)，4.30(dd，1H，J5，6a＝2.8Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)4.38(dd，1H，J5，6a＝2.8Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)，4.66(d，1H，J1’，2’＝0.6Hz，H-1’)，5.03(dd，1H，J2’，3’＝3.2Hz，J3’，4’＝9.9Hz，H-3’)，5.23(t，1H，J4’，5’＝9.9Hz，H-4’)，5.42(dd，1H，J1’2’＝0.6Hz，J2’，3’＝3.2Hz，H-2’)，5.43(dd，1H，J2，3＝10.5Hz，J3，4＝9.3Hz，H-3)，6.24(d，1H，J1，2＝3.8Hz，H-1)13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.9(m，6COCH3)，60.3(C-2)，61.9(C-6)，62.2(C-6’)，65.8(C-4’)，68.1(C-2’)，69.7(C-3)，70.4(C-5)，70.7(C-3’)，72.5(C-5’)，74.0(C-4)，89.9(C-1)，97.5(C-1’)，168.6-170.4(m，6COCH3)C26H35O17的分析计算值C，47.20；H，5.33；N，6.35；实测值C，46.90；H，5.32；N，6.39。
HR-FAB MS[M+H]+C26H36N3O17的计算值662.205，实测值662.202。
mp+183.5-184.0℃(来自EtOH)，T.L.C；Rf＝0.39(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
3.O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-β-D-葡糖吡喃糖基)-(1→4)-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-2-邻苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(13)的合成合成流程(3) (G)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(10)的合成将300mg化合物(8)溶于3.0ml THF中，向在冰水中冷却的溶液中加入89μl苄胺，在室温下搅拌48小时。在T.L.C上证实反应终止后，将冰水加入到反应混合物中，所得产物用氯仿萃取，依次用水、1N HCl水溶液和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥。用硅藻土过滤除去MgSO4后，真空浓缩滤液。残余物用快速硅胶色谱法纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到257mg所需产物(10)。
由化合物(8)的收率92％。
HR-FAB MS[M+H]+C24H34N3O16的计算值620.194；实测值620.192。
T.L.C；Rf＝0.26(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(H)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-葡糖吡喃糖基三氯乙亚胺酸酯(11)的合成将85mg化合物(10)溶于CH2Cl2(550μl)和CCl3CN(275μl)中，向在冰水中冷却的该溶液中加入10.2μl DBU，在室温下搅拌2小时。在T.L.C上证实反应终止后，真空浓缩反应混合物。所得残余物用快速硅胶色谱法纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到80mg所需产物(11)。
由化合物(10)的收率76％。
1H NMRδ(CDCl3)1.97，2.02，2.07，2.08，2.16 and 2.17(all s，18H，6COCH3)，3.56-3.60(m，1H，H-5’)，3.60(dd，1H，J1，2＝3.4Hz，J2，3＝10.5Hz，H-2)，3.88(t，1H，J4，5＝9.8Hz，H-4)，4.09(dd，1H，J5’，6b’＝2.7Hz，J6a’，6b’＝12.5Hz，H-6b’)，4.09-4.14(m，1H，H-5)，4.21(dd，1H，J5，6b＝3.9Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6b)，4.33(dd，1H，J5，6a＝2.2Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)，4.33(dd，1H，J5’，6a’＝4.9Hz，J6a，，6b’＝12.5Hz，H-6a’)，4.69(s，1H，H-1’)，5.01(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝10.0Hz，H-3’)，5.20(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，5.38(d，1H，J2’，3’＝3.4Hz，H-2’)，5.51(dd，1H，J2，3＝10.5Hz，J3，4＝9.5Hz，H-3)，6.41(d，1H，J1，2＝3.4Hz，H-1)，8.79(s，1H，NH)13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.7(m，6COCH3)，60.8(C-2)，61.9(C-6)，62.3(C-6’)，65.8(C-4’)，68.2(C-2’)，69.3(C-3)，70.7(C-5 and C-3’)，72.6(C-5’)，74.1(C-4)，90.5(C(NH)CCl3)，94.1(C-1)，97.3(C-1’)，160.6(C(NH)CCl3)，169.5-170.4(m，6COCH3)T.L.C；Rf＝0.37(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(I)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-2-邻苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(13)的合成将47mg化合物(11)和45mg O-3，6-O-二-苄基-2-脱氧-2-邻苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(12)溶于700μl CH2Cl2中，向该溶液中加入70mg MS4A(分子筛)，在氮气氛下、在-20℃搅拌30分钟。
然后，加入2.3μl BF3OEt2，将所得混合物在氮气氛下、在-20℃搅拌24小时。在T.L.C上证实反应终止后，加入三乙胺(TEA)中和反应混合物，通过硅藻土过滤除去MS4A，真空浓缩滤液。所得残余物用快速硅胶色谱法部分纯化(洗脱甲苯/乙酸乙酯＝5/2)，得到32mg含有所需化合物(13)和O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-2-邻苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(α∶β＝1∶2)的残余混合物。进一步用HPLC纯化(洗脱己烷/乙醇＝12/1)，得到21mg所需产物(13)。
由化合物(11)的收率31％。
1H NMRδ(CDCl3)1.90，1.92，1.96，2.00，2.07，2.15(all s，18H，6COCH3)，3.08(m，1H，H-5’)，3.27(dd，1H，J1’，2’＝8.1Hz，J2’，3’＝10.2Hz，H-2’)，3.46(ddd，1H，J4″，5″＝9.9Hz，J5″，6a″＝4.8Hz，J5″，6b″＝2.6Hz，H-5″)，3.51-3.56(m，1H，H-5)，3.56(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，3.76(dd，1H，J5，6b＝1.4Hz，J6a，6b＝10.9Hz，H-6b)，3.87(dd，1H，J5，6a＝2.9Hz，J6a，6b＝10.9Hz，H-6a)，3.91(dd，1H，J＝6.3Hz，J＝13.0Hz，CHH’CH＝CH2)，3.98-4.20(m，7H，H-6b″，H-6b’，H-4，H-2，H-6a’，H-3，CHH’CH＝CH2)，4.27(dd，1H，J5″， 6a″＝4.8Hz，J6a″，6b″＝12.3Hz，H-6a″)，4.27 and 4.66(ABq，2H，J＝12.5Hz，PhCH2)，4.30(d，1H，J1’，2’＝8.1Hz，H-1’)，4.42和4.73(ABq，2H，J＝12.0Hz，PhCH2)，4.45(s，1H，H-1″)，4.76(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝9.9Hz，H-3’)，4.92(dd，1H，J2″，3″＝3.4Hz，J3″，4″＝9.9Hz，H-3″)，4.93(dd，1H，J＝1.5Hz，J反式＝10.4Hz，CH＝CH反式H)，4.93(dd，1H，J＝1.5Hz，J顺式＝17.2Hz，CH＝CHHcis)，5.06(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1)，5.14(t，1H，J4″， 5″＝9.9Hz，H-4″)，5.30(d，1H，J2″，3″＝3.4Hz，H-2″)，5.60(m，1H，CH＝CH2)，6.70-7.58(m，14H，Ar-H)
13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.6(m，6COCH3)，55.5(C-2)，62.2(C-6’和C-6″)，64.5(C-2’)，65.9(C-4″)，67.8(C-6)，68.1(C-2″)，69.7(CH2CH＝CH2)，70.7(C-3″)，71.9(C-3’)，72.0(C-5’)，72.5(C-5″)，73.5和74.3(2PhCH2)，74.6(C’-4和C-5)，78.2(C-4)，97.3(C-1和C-1″)，100.8(C-1’)，117.3(CH2CH＝CH2)，127.0-133.7(m，18Ar-C)，137.9(CH2CH＝CH2)，169.6-170.4(m，8C＝O)HR-FAB MS[M+Na]+C55H62N4O22Na的计算值1153.375，实测值1153.374T.L.C；Rf＝0.53(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(J)(糖基受体的数据)O-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-2-邻苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(12)按照以下合成流程，合成氨基-保护的吡喃葡萄糖苷(12)。
1H NMRδ(CDCl3)3.63(m，1H，H-5)，3.76-3.85(m，3H，H-4，H-6a and H-6b)，3.97(dd，1H，J＝13.1Hz，J＝6.1Hz，CHH’CH＝CH2)，4.15-4.26(m，3H，H-2，H-3和CHH’CH＝CH2)，4.52and 4.73(ABq，2H，J＝12.2Hz，PhCH2)，4.58和4.64(ABq，2H，J＝11.9Hz，PhCH2)，4.99(dd，1H，J＝1.3Hz，J反式＝10.3Hz，CH＝CH顺式H反式)，5.07(dd，1H，J＝1.3Hz，J顺式＝17.2Hz，CH＝CH顺式H反式)，5.17(d，1H，J1，2＝8.1Hz，H-1)，5.61-5.70(m，1H，CH＝CH2)，6.93-7.67(m，14H，Ar-H)13C NMRδ(CDCl3)55.3(C-2)，69.7(C-C＝C)，70.7(C-6)，73.5(C-5)，73.8and 74.3(Ph-C)，74.5(C-4)，78.7(C-3)，97.4(C-1)，117.3(C-C＝C)，127.4-128.5(m，Ar-C)，133.6(C-C＝C)，137.6和138.2(C＝O)HR-FAB MS[M+H]+C31H32NO7的计算值530.218，实测值530.215。
T.L.C；Rf＝0.72(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
工业实用性糖基转移酶和添加的糖单元通常用于糖链的自动合成仪，因为当糖链通过加入新的糖而延伸时，糖基转移酶是方便的。然而，尚未发现糖基转移酶能制备天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖部分(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)，化学合成法是制备它的唯一制备方法。
本发明通过利用以合理价格容易购得的半乳甘露聚糖、瓜尔胶和/或甘露聚糖衍生物等天然多糖，提供了制备核心糖链还原端的三糖部分的简便方法。
权利要求
1.天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制备方法，该方法包括下述步骤(1)通过水解具有甘露糖β-1，4-键的多糖并保护所得水解产物的OH基团，制备下式(I)的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步骤 其中P1为OH保护基，波浪线表示-OP1连接在直立或平伏位置或两者的混合。
2.权利要求1的天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制备方法，该方法还包括下述各步骤(2)制备烯糖化合物的步骤，其中甘露糖二糖还原端的甘露糖通过甘露糖二糖(ManP1β1→4ManP1型)的卤化和还原反应转化为烯糖，和(3)通过上述烯糖化合物的叠氮化硝化反应，制备下式(II)所示的叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步骤，其中还原端甘露糖的2-叠氮基连接在平伏位置； 其中P1的定义同上，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合。
3.权利要求2的天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制备方法，该方法还包括下述步骤(4)用离去基团取代叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的步骤，和(5)制备下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)的步骤 其中P1、P2、P3和P11的定义同上，所述步骤通过使具有离去基团的产物与下式所示的氨基-保护的吡喃葡萄糖苷反应而实施 其中P2为OH保护基，P3为氨基保护基，P11为OH保护基。
4.权利要求3的天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制备方法，该方法还包括下述步骤(6)通过将上述三糖化合物还原端与保护的天冬酰胺衍生物偶联，制备下式(IV)所示的天冬酰胺结合型三糖Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2化合物的步骤 其中P1和P2的定义同上，P4和P6独立地为氨基保护基，P5为羧基保护基。
5.下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的制备方法 其中P1为OH保护基，波浪线表示-OP1连接在直立或平伏位置或两者的混合，所述方法通过水解具有甘露糖β-1，4-键的多糖并保护所得水解产物的OH基团而实施。
6.下式(II)所示的叠氮二糖(ManP1β1→4ManP1型)的制备方法，其中还原端甘露糖的2-叠氮基连接在平伏位置 其中P1为OH保护基，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合；所述方法包括制备烯糖化合物的步骤，其中通过下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的卤化和还原反应，将所述甘露糖二糖还原端的甘露糖转化为烯糖，随后使所述烯糖化合物进行叠氮化硝化反应 其中P1的定义同上，波浪线表示-OP1连接在直立或平伏位置或两者的混合。
7.下式(III)所示的三糖化合物的制备方法 其中P1、P2、P3和P11的定义同上，所述方法包括用离去基团取代下式(II)所示的叠氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的步骤 其中P1的定义同上，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合；还原端甘露糖的2-叠氮基连接在平伏位置，然后，使所述具有离去基团的取代化合物与下式氨基-保护的吡喃葡萄糖苷反应 其中P2为OH保护基，P3为氨基保护基，P11为OH保护基。
8.下式(IV)所示的天冬酰胺结合型三糖化合物Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2的制备方法 其中P1和P2的定义同上，P4和P6独立地为氨基保护基，P5为羧基保护基，所述方法包括使以下三糖化合物(III)的还原端与保护的天冬酰胺衍生物偶联 其中P1、P2、P3和P11的定义同上。
9.下式(II)所示的叠氮二糖(ManP1β1→4ManP1型)化合物 其中P1为OH保护基，波浪线表示-NO2连接在直立或平伏位置或两者的混合。
10.下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型) 其中P1、P2和P11为OH保护基，P3为氨基保护基。
全文摘要
本发明涉及化学合成天冬酰胺结合型糖蛋白的核心糖链结构还原端的三糖部分。利用非常廉价的具有甘露糖β－1，4－键的天然多糖为原料，形成甘露糖的β1→4糖苷键。
文档编号C07H1/08GK1918174SQ200480041979
公开日2007年2月21日 申请日期2004年12月24日 优先权日2003年12月26日
发明者西村绅一郎, 武川泰启 申请人:盐野义制药株式会社