专利名称：新的糖链连接的凝血调节蛋白样肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有新糖链并具有凝血调节蛋白活性的一种新肽。更具体地讲，本发明涉及含有3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖链(此后本文将其称为3SAGGX链)并具有凝血调节蛋白活性的一种肽。
本发明还涉及特异性地结合到抗-人天然杀伤细胞-1抗体(此后本文将其称为抗-HNK-1抗体)并具有凝血调节蛋白活性的一种肽。
本发明还涉及含有这种肽作为有效成分的药用组合物或包括给予这种药用组合物的治疗血栓形成等疾病的方法。
本发明还涉及这种肽的纯化方法和检测方法。
本发明还涉及由这种肽释放的和纯化的所述3SAGGX链及其还原端修饰的产物。
一般来讲，具有抗-血液凝固作用的抗凝血酶Ⅲ和肝素或具有溶栓作用的尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物等物质用作由异常血液凝固能力引起的疾病的治疗因子。然而，这些物质具有诸如出血倾向的副作用，并且对于或者抗血液凝固作用或者溶栓作用它们的作用具有不完全性。因而，人们非常关注具有发挥这两种作用可能性的凝血调节蛋白以及基本上具有凝血调节蛋白活性的凝血调节蛋白样物质在临床上的应用，其中凝血调节蛋白样物质对凝血酶具有亲和力并增强对蛋白质C活化作用。
关于这种凝血调节蛋白或凝血调节蛋白样物物的制备，迄今为止已经报道了以下实施例。在这方面，除非另外说明，否则分子量显示为由在非还原性条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(此后本文将其称为SDS-PAGE)测得的值。
P.W.Maierus等已经从人胎盘中纯化了凝血调节蛋白并报道了其分子量为75K(The Journal of Biological Chemistry,259,12246-12251,1984)。Maruyama等已经从人肺中纯化了凝血调节蛋白，并报道了其特性与胎盘凝血调节蛋白的那些特性相同(Journal of ClinicalInvestigation,75,987-991,1985)。另外，Suzuki等从人血小板中部分地纯化了凝血调节蛋白，确定其分子量为78K，并报道了基于其电泳行为、对凝血酶的亲和力以及对蛋白质C的底物亲和力，得自血小板、胎盘和肺内皮的凝血调节蛋白的制备物具有相互完全相同的特性(The Journal of Biochemistry,104,628-632,1988)。
关于通过采用基因工程技术进行的研究，Suzuki等已经克隆了得自人肺cDNA文库的含有信号肽的人凝血调节蛋白前体基因，阐明了全部基因结构并由此揭示出其从18个氨基酸信号肽延续的575个氨基酸残基的氨基酸序列(EMBO Journal,6,1891-1897,1987)。此后，Suzuki等报道了，通过基因工程方法制备的人凝血调节蛋白与从天然组织纯化的人凝血调节蛋白具有相同的活性(The Journal ofBiological Chemistry,264,4872-4876,1989)，并且人凝血调节蛋白活性限于从氨基端计数的345-462位氨基酸残基的序列，而甚至该部分的一部分缺失其活性也会丧失(The Journal of Biological Chemistry,264,10351-10353,1989；和论文摘要，the 12th Meeting of InternationalSociety on Thrombosis and Hemostasis，第334页，Subject No.1039,1989)。
另外，关于具有凝血调节蛋白活性的凝血调节蛋白样物质，有已知的天然类型诸如人尿可溶性凝血调节蛋白物质(JP-A-63-30423(本文所用的术语“JP-A”是指“未审查已公开的日本专利申请”)，旧-A-63-146898,JP-A-3-86900,JP-A-3-21 8399，和Yamamoto等，TheJournal of Biochemistry,113,433-440,1993)。
通过基因程技术方法获得的这种物质的实例包括除去跨膜区域和胞质内区域的可溶性凝血调节蛋白制备物(JP-A-1-6219,JP-A-2-255699,JP-A-3-133380,JP-A-3-259084,JP-A-4-210700,JP-W-3-503757(本文所用的术语“JP-W”是指“未审查已公开的日本国际专利申请”)，JP-W-4-505554,EP 474273,WO91/04276,WO91/05803,WO91/155]4,WO92/00325,WO92/03149,WO93/15755，和Doi等，论文摘要No.3,the 113th Annual Meeting of Pharmaceutical Society ofJapan,Subject No.30EM14-1,1993)。
已经报道了，血液或尿液中可溶性凝血调节蛋白的量在某些疾病和发病状态中发生变化，因此表明其可用作这些疾病和发病状态的标记。例如，已经报道了血液中凝血调节蛋白的量在弥散性血管内凝血综合症(在下文称为DIC)、系统性红斑狼疮、血栓形成性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、进行性硬皮病、糖尿病、肾病、成年呼吸窘迫综合症、肺病诸如肺血栓栓塞(Rinsho Kensa(ClinicalInspection)，第33卷，第1643-1647页，1989)、妊娠中毒(Ketsueki toMyakukan(Blood and Vessel)，第19卷，第490页，1988)、肝病(Ketsuekito Myakukan，第20卷，第407页，1989)、川崎病(Journal of JapaneseSociety on Thrombosis and Hemostasis，第3卷，第343页，1992)、慢性肾小球肾炎Journal of Japanese Society on Thrombosis andHemostasis，第3卷，第349页，1992)、定期血液透析后(Journal ofJapanese Society on Thrombosis and Hemostasis，第1卷，第395页，1990)、衰老(Journal of The Japan Hematological Society，第54卷，第286页，1991)等病例中增加。还报道了由于肾功能不全尿中凝血调节蛋白减少(Rinsho Ketsueki(Clinical Blood)，第31卷，第1191页，1990)。
人们认为，根据其氨基酸序列，N-型糖链和O-型糖链可以连接到这些凝血调节蛋白或凝血调节蛋白样物质上。然而，关于实际上连接到糖链的报道是极少的，仅仅包括由Niimi等报道的N-型糖链的信息(Iyakuhin Kenkyu(Medicament Research)，第28卷，第12期，第863-873页，1997)。
关于对凝血调节蛋白的O-型糖链的极少数量的报道，WO91/04276公开了含有软骨素和/或硫酸软骨素的糖链的重组可溶性凝血调节蛋白，WO91/05803公开了用硫酸化糖胺聚糖修饰的重组可溶性凝血调节蛋白，而JP-A-4-210700公开了没有连接硫酸糖胺聚糖的重组可溶性凝血调节蛋白。
在另一方面，Yamamoto等(The Journal of Biochemistry,113,433-440,1993)和Nakano等(Thrombosis andHaemostasis,79,331-337,1998)描述了硫酸软骨素不存在于由人尿液制备的可溶性凝血调节蛋白中。然而，目前的情况是，对O-型糖链，特别是对其结构等的细节并没有进行足够的分析。
在另一方面，当糖胺聚糖链连接到肽上时，没有3-O-硫酸化的葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖链已知作为连接区，但没有报道正好由四种糖组成的糖链，其中葡糖醛酸的3-位被O-硫酸化。本发明的公开为了将凝血调节蛋白或凝血调节蛋白样物质的血液凝固控制作用或血小板凝集控制作用应用到药物中，人们非常关注提供可以被纯化成较高纯度并且在生物学样品诸如已给予的患者的血液、尿液等中容易地检测到的一种肽。
本发明的一个目的为提供具有凝血调节蛋白活性的肽，所述肽可以被纯化成较高纯度并且在生物学样品诸如给予的患者的血液、尿液等中容易地检测到，以及提供含有所述肽作为有效成分的药用组合物。
本发明的另一目的为提供本发明刚才描述过的肽的纯化方法、检测方法和检测试剂盒。
在对凝血调节蛋白样物质深入地研究期间，本发明的发明人意外地发现了，有些凝血调节蛋白样物质可以特异性地结合到抗-HNK-1抗体上，并且进一步地研究结果意外成功地分离到具有一条新糖链(命名为3SAGGX链)的一种新凝血调节蛋白样肽，在所述链中其末端葡糖醛酸被O-硫酸化。我们还发现所述肽可用作为一种药物。另外，我们发现了纯化具有3SAGGX链的凝血调节蛋白样物质至高纯度的方法以及检测所述物质的方法。基于这些发现本发明已经完成。
本发明的第一个实施方案为含有3SAGGX链并具有凝血调节蛋白活性的一种肽。关于所述肽，优选在水溶液中是可溶的肽，更优选在缺乏非离子型表面活性剂的的情况下在水溶液中是可溶的肽，而更优选具有SEQ ID No.1的1-494位氨基酸残基的氨基酸序列、具有SEQ ID No.2的1-498位氨基酸残基的氨基酸序列或具有通过在所述氨基酸序列应用一个或几个氨基酸的取代、添加、插入和/或缺失而获得的氨基酸序列的肽。
本发明的第二个实施方案为特异性地结合到抗-HNK-1抗体上并具有凝血调节蛋白活性的一种肽。关于所述肽，基本上不含有软骨素和/或硫酸软骨素与其连接的一段肽的肽为优选的。关于所述肽，优选在水溶液中是可溶的肽，更优选在缺乏非离子型表面活性剂的情况下在水溶液中是可溶的肽，而更优选具有SEQ ID No.1的1-494位氨基酸残基的氨基酸序列、具有SEQ ID No.2的1-498位氨基酸残基的氨基酸序列或具有通过在所述氨基酸序列应用一个或几个氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失而获得的肽。
本发明的第三个实施方案为含有具有3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体上并具有凝血调节蛋白活性的肽作为有效成分的药用组合物。所述肽优选的实施例与本发明的第一个或第二个实施方案中描述的相同。
本发明的第四个实施方案为具有3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体上并具有凝血调节蛋白活性的肽的纯化方法，所述方法的特征是用可以特异性地识别和结合到所述3SAGGX链的抗体的亲和力的分离方法。优选的抗体为抗-HNK-1抗体，而更优选利用所述抗体连接到树脂的抗体亲和柱。
本发明的第五个实施方案为酶免疫测定(此后本文将其称为EIA)方法和具有3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血调节蛋白活性的肽的检测试剂盒，所述方法利用抗体可以特异性地识别和结合到3SAGGX链上的抗体。优选的抗体为抗-HNK-1抗体。
本发明的另一实施方案涉及通过从糖肽释放和纯化3SAGGX链获得的糖链及其还原端修饰的形式。关于所述糖链，最好是丝氨酸连接到其还原端的糖醇或糖肽。实施本发明最佳方式以下描述本发明的细节。
本文所用的术语描述如下。
所述3SAGGX链为3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3(±唾液酸α2-6)半乳糖β1-4木糖链，它包括在糖链中唾液酸通过cα2-6键连接到距末端的第三个半乳糖上和在糖链中没有连接唾液酸这两种情况。由于所谓的糖胺聚糖链没有连接到葡糖醛酸上，所以它具有仅有4个糖的结构。认为木糖部分与SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的472-位和/或474-位丝氨酸的羟基形成O-糖苷键，所述氨基酸序列为具有凝血调节蛋白活性的肽的氨基酸序列。
所述凝血调节蛋白活性是指结合到凝血酶并由此增强凝血酶活化蛋白质C的作用。其结合到凝血酶可以例如通过其对用凝血酶作配体的亲和柱的吸附作用而被证实。可以用公开于例如JP-A-3-218399中的方法，用合成的底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA，在凝血酶存在下，测量蛋白质C的活化能力，来证实凝血调节蛋白增强凝血酶对蛋白质C的活化作用。另外，具有凝血调节蛋白活性的肽统称为凝血调节蛋白样肽，其中凝血调节蛋白自身也包括在内。
用可以特异性地识别和结合到所述3SAGGX链的抗体的酶免疫测定方法(此后本文有时将其称为EIA)，是指用通过将过氧化物酶、半乳糖苷酶等酶化学结合到可以特异性地识别和结合到所述3SAGGX链的抗体上制备的抗体，检测具有所述3SAGGX链的肽，特异性地识别作为抗原的3-位-O-硫酸化葡糖醛酸并与其结合的抗体(例如，抗-HNK-1抗体)可以举例作为一种优选的抗体，但可以用任何其它抗体，前提是它可以特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合。通过加入酶反应显色的底物，根据着色程度来测量目的抗原的存在和数量。可以用任何物质，前提是它显示依赖酶浓度和依赖反应时间的着色强度而对测量系统不产生影响。必要时，可以通过将其另一个EIA结合，用比所述3SAGGX链更高准确度来进行测量，其中另一个EIA使用识别作为抗原的本发明肽的另一部分并与其结合的抗体。
所述抗-HNK-1抗体为特异性地识别人天然杀伤细胞、CD57的抗原并与其结合的抗体，并且它特异性地识别和结合到3-位被O-硫酸化的葡糖醛酸上。所述抗-HNK-1抗体可以作为市售的多克隆或单克隆抗体购买到(例如，抗-NK细胞克隆亚类(小鼠)IgM，由CosmoBio生产和供应，Code No.IT-0289)或按照常规方法制备。
具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的本发明的肽可以或者是天然来源的肽或者是作为重组肽获得的产物，前提是它具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性，但天然来源的肽为更优选的。假如为所述天然来源的肽，则它可以或者是人源肽或者是动物源肽，但人源肽为更优选的。适用于药物中的实施例为可溶性凝血调节蛋白，例如，具有SEQ IDNo.1的1-494位的氨基酸序列的肽、具有SEQID No.2的1-498位的氨基酸序列的肽或通过在所述肽中应用一个或几个氨基酸的取、缺失、添加和/或插入所获得的肽为优选的。由于所述N-端具有异质性，因此还具有Phe-Pro-的肽也是优选的。假如为所述重组形式，通过在SEQ ID No.2的1-498位的氨基酸残基上应用一个或几个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入，其修饰范围使得所述修饰作用没有对所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性产生影响，则具有如此获得的氨基酸序列的肽也包括在本发明中。
本发明也为具有凝血调节蛋活性的肽，所述肽可以通过利用可以特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体纯化或检测到。
特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血调节蛋白活性的本发明的所述肽可以或者是天然源肽或者是作为重组肽获得的产物，前提是它特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血调节蛋白活性，但天然源肽为更优选的。假如为所述天然源肽，则它可以或者是人源肽或者是动物源肽，但人源肽为更优选的。适用于药物的实施例为可溶性凝血调节蛋白，例如，具有SEQ ID No.1的1-494位氨基酸序列的肽或SEQ ID No 2的1-498位氨基酸序列的肽为优选的。由于所述N-端具有异质性，因此还具有Phe-Pro-的肽也是优选的。假如为所述重组形式，通过在SEQ ID No.2的1-498位氨基酸残基上应用一个或几个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入其修饰范围使得所述修饰作用没有对所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性产生影响，则具有如此获得的氨基酸序列的肽也包括在本发明中。基本上不含有软骨素和/或硫酸软骨素与其连接的一段肽的一种肽也是优选的。
具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的本发明的所述肽，可以用能够特异性地识别和结合到所述3SAGGX链上的抗体的亲和力的分离方法得到。虽然原材料没有特别地限制，但是最好是，在按照常规方法用阴离子交换层析、用凝血酶作配体的亲和层析或凝胶过滤层析等方法从人源或动物源天然源(诸如人肺、人胎盘、人尿液或人血液等)纯化的凝血调节蛋白或可溶性凝血调节蛋白上，或在通过基因工程技术的方法制备的重组凝血调节蛋白或重组可溶性凝血调节蛋白上，应用利用所述亲和力的另一分离步骤，但它也可以作为所述常规纯化方法的起始步骤或中间步骤进行，或必要时它也可以重复几次。如果需要，它也可以与阳离子交换层析、疏水层析或羟基磷灰石层析等方法相结合进行。假如通过基因工程技术方法制备，则以常规的途径，用可以表达具有凝血调节蛋白活性的肽的载体转化宿主细胞。用可以表达具有凝血调节蛋白活性的肽的载体与可以表达具有葡糖醛酸基转移酶活性的肽的载体和/或可以表达具有磺基转移酶活性(例如HNK-1磺基转移酶)的肽的载体一起同时转染(共转染)到宿主细胞也是一种期望的方法。宿主细胞的转化也可以用可以表达具有凝血调节蛋白活性的肽和具有葡糖醛酸基转移酶活性的肽和/或具有磺基转移酶活性(例如HNK-1磺基转移酶)的肽的载体进行。
虽然没有特别地限制，但是特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体最好是抗-HNK-1抗体，其中更优选的是单克隆抗体。另外，在使用可以特异性地识别3SAGGX链并与其结合的抗体的亲和力的分离方法中，所述抗体可以结合到载体诸如琼脂糖、纤维素或葡聚糖等上，并且分离可以通过柱或分批等方法进行，其中柱方法为特别可取的。
当通过柱方法进行时，在柱中所述抗体用溴化氰连接到载体上并填充柱，而样品溶液通过所述柱去进行具有3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽的吸附。此后，通过将洗脱液通过柱来洗脱所述肽，其洗脱条件使得由此吸附的肽对抗体的亲和力减弱了。必要时，它可以与凝血酶亲和层析或凝胶过滤层析相结合。
本发明这样获得的肽通过于60±2℃处理10小时灭活病毒或用中空纤维膜除去病毒，制成作为药物更合适的状态。
本发明所述肽的作用和特性显示如下。试验实施例1本发明实施例1的所述肽的结构分析(1)末端氨基酸序列按照C.H.W.Hirs等的方法(Methods in Enzymology(CH.W.Hirs著)，第11卷，199-203,Academic Press，纽约，1967)，得自本发明实施例1中的所述肽进行还原性羧甲基化，然后脱盐用作氨基酸序列分析的样品。
N-端氨基酸序列分析用气相氨基酸序列自动分析仪(470型，Applied Biosystems制造)进行，羧基端(此后本文将其称为C-端)氨基酸通过肼解方法测定，而C-端氨基酸序列分析通过用羧肽酶Y处理样品进行，然后用高效液相层析通过氨基酸分析仪(JASCO制造)定量分析这样释放的氨基酸。
本发明实施例1的本发明肽的N-端侧和C-端侧氨基酸序列的分析结果显示如下。N端Ala-Pro-Ala-G1u-Pro-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Gln-Cys-Val-Glu-His-Asp-Cys-Phe-Ala-Leu-Tyr-Pro-Gly-Pro-Ala-Thr-Phe-Leu-C-端-Val-Gly-Leu从这些结果可证实，得自本发明实施例1中的肽的N-端氨基酸序列与迄今为止已表明的人凝血调节蛋白的报道完全相一致，但所述C-端侧氨基酸序列对应于所述492-494位氨基酸残基的部分。即认为本发明实施例1的肽为具有对应于人凝血调节蛋白l-494位氨基酸残基的氨基酸序列的肽。(2)糖链分析按照N.Kuraya和S.Hase的方法(The Journal of Biochemistry,112,122-126,1992)，得自本发明实施例1中的肽进行肼解(60℃,50小时)以释放糖链，然后对所述糖链进行N-乙酰化作用和吡啶基氨基化作用，用作糖链分析的样品(吡啶基氨基化糖链；此后本文将其称为PA-糖链)。在还原端侧含有木糖的PA-糖链(结合到氨基酸的一侧)通过凝胶过滤层析和反相层析纯化，然后通过基于结合外切糖苷酶消化(β-葡糖醛酸糖苷酶和β-半乳糖苷酶的依序使用)(Methods in Enzymology(Ginsburg,V.著)，第230卷，225-237,Academic Press，纽约，1994)、甲基化作用分析、质谱分析法和NMR分析的S.Hase的双相糖链图谱方法的分析方法，分析这些结构。
连接到本发明实施例1的所述发明的肽的含有木糖的糖链的分析的结果显示如下。在这种情况下，每个单糖缩写如下。
SO4-3GlcA:3-位-O-硫酸化葡糖醛酸Gal半乳糖Sia唾液酸Xyl木糖SO4-3GlcA β1-3Gal β1-3(±Sia α2-6)Gal β1-4 Xyl基于这些结果，它们连接到所述肽并且具有葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖的仅4个糖结构的结果来看，发现连接到得自本发明实施例1中的肽的糖链的含有木糖的糖链结构为新的发现，并且在O-硫酸基连接到葡糖醛酸的3-位方面这些为迄今为止没有报道过的新糖链。
另外，当按照J.Suzuki等的方法(Agricultural and BiologicalChemistry,55,283-284,1991)，将得自本发明实施例1中的肽在4M三氟乙酸中于100℃加热3小时，然后将这样释放的单糖进行吡啶基氨基化并根据离子交换HPLC测定时，每1mol所述肽检测到1mol木糖。基于这些结果，由于除了所述3SAGGX链外没有发现含有木糖的糖链，因此证实1mol所述3SAGGX链是连接到1mol所述肽上。(3)软骨素酶处理通过软骨素酶处理，经SDS-PAGE测量的分子量和凝血调节蛋白活性没有变化。因此，再次证实软骨素和/或硫酸软骨素没有连接到本发明实施例1的所述肽上。试验实施例2得自本发明实施例1中的所述肽的活性在凝血酶和抗-血液凝固活性存在时，通过JP-A-3-218399中描述的方法测量对凝血酶的亲和力(抗-凝血酶作用)、蛋白质C活化能力。
结果，本发明的所述肽显示结合到凝血酶的作用并由此强烈地抑制其凝固活性。本发明的所述肽还显示在凝血酶存在时很强的活化蛋白质C的能力。本发明的所述肽还显示延长血液凝固时间的强作用。试验实施例3小鼠中的急性毒性将得自本发明实施例1或本发明实施例2中的所述肽通过静脉注射给予到五只ddY雄性小鼠，然后一直观察所述动物7天，但用药学上有效剂量没有发现显著性毒性和死亡率。试验实施例4溶解性于室温下得自本发明实施例1或本发明实施例2中的所述肽溶解于蒸馏水中至少到浓度30mg/ml。
根据前面所述的描述和试验的结果，显然本发明的所述肽具有凝血调节蛋白活性并显示低毒性，因此预期该肽对预防和治疗涉及血液凝固加剧的疾病是有效的，所述疾病诸如DIC、血栓形成、外周血管梗阻、心肌梗死、大脑梗死、一过性大脑缺血发作、妊娠中毒、肝功能不全和肾功能不全。本发明的所述肽与那些已知的天然或重组凝血调节蛋白样肽有相同的活性。
可以用药物中一般所用的合适的载体或介质，诸如无菌水、生理盐水、植物油或无毒有机溶剂等，必要时与填充剂、着色剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂等添加剂相结合，将本发明的所述肽制成药用制剂，最好是适合于有效地给予患者的注射剂。当本发明的所述肽用作注射剂时，所述制剂通过每天分1-6个剂量、以一份或连续地给予每个患者。关于本发明的所述肽，但日用量0.01-500mg，最好是0.05-10mg，虽然依每个患者的年龄、体重和症状等日用量可以可选地变化。
另外，本发明的所述肽可以用交联剂等结合或吸附到人造血管、人造器官、导管等医疗装置的表面。通过这样的应用，可以预防医疗装置表面的血液凝固。它也可以用作所述体外血液循环的凝固抑制剂。
使所述已浓缩的尿液通过预先用含有O.068M NaCl的pH6.5、0.05M磷酸盐缓冲液处理的300ml DEAE纤维素柱(Whatman制造)，以吸附所述活性部分，所述柱用750ml与在所述处理中所用的相同的缓冲液洗涤，然后用含有0.05M NaCl的pH4.0乙酸盐缓冲液洗脱所述活性部分。
所述洗出物用标称截留分子量为30,000的超滤膜浓缩，用2MNaOH调pH到7.5，然后通过预先用含有0.1M NaCl、1mM盐酸苯甲脒和0.5mM CaCl2的pH7.5、0.02M Tris-HCl缓冲液处理的2.5mlDIP-凝血酶-琼脂糖柱，由此吸附活性部分。接下来，用25ml在所述处理中所用的相同缓冲液洗涤所述柱，用含有1M NaCl、1mM盐酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl洗脱，而所述洗出物用在所述处理中相同的缓冲液透析，然后在如上所描述的相同的条件下通过DIP-凝血酶-琼脂糖层析再次纯化。在第二次DIP-凝血酶-琼脂糖层析中，使用相同的柱体积并用在所述处理下所用的10ml缓冲液洗涤，然后用10ml含有0.8M NaCl、1mM盐酸苯甲脒和0.5mM CaCl2的pH7.5、0.02M Tris-HCl缓冲液洗涤，然后所述活性部分用含有1M NaCl、1mM盐酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl缓冲液洗脱。
所述洗出物用标称截留分子量为30,000的超滤膜浓缩，并通过预先用含有0.14M NaCl的pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液处理的2.5ml抗-HNK-1抗体-琼脂糖柱，以吸附含有本发明所述肽的活性部分。凝血调节蛋白部分也得自通过柱的部分。此后，所述柱用25ml在所述处理中所用的相同的缓冲液洗涤，用含有1M NaCl、1mM盐酸苯甲脒和0.5mM EDTA的pH7.5、0.02M Tris-HCl缓冲液进行洗脱，然后所述洗出物对在所述处理中所用的相同的缓冲液透析以得到含有本发明所述肽的活性部分。
通过上述生产方法最终得到的含有本发明所述肽的活性部分分离为在SDS-PAGE中显示为一条单带的肽。本发明实施例2特异性地结合到抗-HNK-1抗原的重组可溶性凝血调节蛋白的生产按照WO92/00325的方法生产重组可溶性凝血调节蛋白。即从得自人胎盘cDNA文库的DNA，制备可以表达由498个氨基酸残基组成的具有Ala-Pro-Ala-氨基酸序列作为其氨基端(此后本文将其称为N-端)的可溶性凝血调节蛋白的载体，并将该载体转染到CHO细胞，然后通过基因扩增得到高表达菌株。该将高表达菌株的培养物肉汤应用到DIP-凝血酶-琼脂糖柱层析和凝胶过滤。使用本发明实施例1中描述的所述抗-HNK-1抗体-琼脂糖柱，以相同的方式收集含有本发明所述肽的活性部分。从通过所述抗-HNK-1抗体-琼脂糖柱的部分也得到凝血调节蛋白活性部分。本发明实施例3使用抗-HNK-1抗体的EIA将抗-HNK-1抗体(Cosmo Bio Co.,Ltd.,Code No.IT-0289)溶解于碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中到浓度2μg/ml，将200μl该溶液加入市售EIA板中并进行包被。于4℃静置3小时或3小时以上后，该板用200μl 3％牛血清白蛋白-磷酸缓冲盐溶液包被并使该板于4℃静置过夜进行封闭。在洗涤所述板后，加入100μl样品和具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽的标准溶液，并使其于37℃反应2小时。洗涤后，加入100μl结合生物素的抗-HNK-1抗体，于37℃反应2小时。洗涤后，加入100μl抗生物素蛋白-过氧化物酶。洗涤后，加入100μl邻苯二胺、0.024％过氧化氢溶液作为底物，于室温下反应10分钟，然后加入50μl 1N硫酸终止反应。使用微量培养板读出器于492nm测量吸光度，并从标准曲线测定样品中具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的所述肽。在含有本发明所述肽的本发明实施例1的所述活性部分中检测所述肽，并在抗-HNK-1抗体亲和层析之前和之后纯化到每蛋白质大约4倍的水平。本发明实施例4用抗-HNK-1抗体的EIA本发明实施例1中纯化的所述连接了3SAGGX链的凝血调节蛋白通过用0.6mg/kg剂量静脉注射给予到雄性大鼠。在给予后1分钟和60分钟从尾静脉收集血液样品，分离血浆，然后按照本发明实施例3的方法通过EIA测量具有3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的所述肽。结果，在给予后1分钟它的浓度为16μg/ml，而在给予后60分钟它的浓度为4μg/ml。制剂实施例1本发明实施例1的肽10mg纯化的明胶 50mg磷酸钠 34.8mg氯化钠 81.8mg甘露醇 25mg将以上组分溶解于注射用蒸馏水中，并将所述溶液调到总体积10ml，除菌过滤，将其以一份1.0ml分装到无菌管形瓶中，然后冷冻干燥制成冻干组合物。制剂实施例2本发明实施例2的肽20mg白蛋白 20mg磷酸钠 34.8mg氯化钠 81.8mg甘露醇 25mg称量每个以上组分，如制剂实施例1中所描述的相同的方式得到冻干制剂。工业适用范围根据具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的所述肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血蛋白活性的所述肽，抗-HNK-1抗体等抗体特异性地结合到这些肽的所述所述糖链上。因此，可以利用使用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体(诸如抗-HNK-1抗体)的亲和力的分离方法，例如应用抗-HNK-1抗体亲和柱，将它们纯化成高纯度，以使得到的不含污染成分的肽适合制成药物。它也适合于酶免疫测定试剂盒的标准物质，以利用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体，诸如抗-HNK-1抗体，检测具有凝血调节蛋白活性的肽。
由于本发明的所述肽具有凝血调节蛋白活性并显示低毒性，因此预期该肽对预防和治疗涉及血液凝固加剧的疾病是有效的，所述疾病诸如DIC、血栓形成、外周血管梗阻、心肌梗死、大脑梗死、一过性大脑缺血发作、妊娠中毒、肝功能不全和肾功能不全。另外，本发明的所述肽可以通过交联剂等结合或吸附到人造血管、人造器官、导管等医疗装置的表面。通过这种应用，可以预防医疗装置表面的血液凝固。它还可以用作所述体外血液循环中的凝固抑制剂。
此外，当例如在纯化过程中，或在诸如在给予具有凝血调节蛋白活性的所述肽之后患者的血液和尿液的生物学样品中必需监测具有凝血调节蛋白活性的肽的浓度时，通过使用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体(诸如抗-HNK-1抗体)的EIA，可以容易地和准确地检测到所述肽，因此就该肽预防或减弱产生副作用并可经济地使用的能力而论，该肽可用作药物。
通过在硼氢化钠或还原剂等存在时，用氢氧化钠等碱处理本发明的所述肽，所述3SAGGX链也可以作为糖醇释放。或者，通过使本发明的所述肽还原性羧甲基化，然后用蛋白酶诸如肌动蛋白酶(Actinase) E(由Kaken Pharmaceutical生产和提供)消化它，它可以作为其中所述3SAGGX链连接到丝氨酸的糖肽释放。这样释放的糖醇或糖肽可以通阴离子层析或使用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体(诸如抗-HNK-1抗体)的亲和柱纯化，并可以结合用凝胶过滤或酰胺柱进一步地纯化。这样纯化的糖醇或糖肽可以用作酶免疫测定试剂盒的标准物质，用以利用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体(诸如抗-HNK-1抗体)检测具有凝血调节蛋白活性的肽。
另外，利用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗-HNK-1抗体等抗体的亲和力的分离方法，诸如用具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血调节蛋白活性的肽的抗-HNK-1抗体亲和柱的纯化方法，以及通过利用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗-HNK-1抗体等抗体的EIA，检测具有所述3SAGGX链和凝血调节蛋白活性的肽或特异性地结合到抗-HNK-1抗体并具有凝血调节蛋白活性的肽的方法或检测试剂盒，也是有用的。当利用特异性地识别所述3SAGGX链并与其结合的抗体(诸如抗-HNK-1抗体)的本发明的所述EIA，与利用识别凝血调节蛋白中所述3SAGGX链以外的另一部分(诸如从所述氨基-端计数的345-462位氨基酸残基的序列)作为抗原并与其结合的抗体的EIA结合使用时，已经可能容易并准确地测定健康人与患者的血液、尿液等生物学样品中本发明的所述肽、确实不具有所述3SAGGX链但具有凝血调节蛋白活性的肽和具有所述3SAGGX链但不具有凝血调节蛋白活性的肽。
序列表<110>Mochida Pharmaceutical Co.,Ltd<120>含有可溶性凝血调节蛋白的组合物<130>PCT100<141>1999-06-30<160>2<210>1<211>494<212>PRT<213>人类<223>在455位置的Xaa为Val或Ala。<400>1Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp15 10 15Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln20 25 30Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val35 40 45Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly
50 55 60Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp65 70 75 80Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp85 90 95Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala100 105 110Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr115 120 125Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala130 135 140Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu145 150 155 160Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly165 170 175Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly180 185 190Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala195 200 205Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala210 215 220Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala225 230 235 240Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln245 250 255Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp
260 265 270Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr275 280 285Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg290 295 300Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln305 310 315 320Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn325 330 335Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe340 345 350Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr355 360 365Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His370 375 380Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp385 390 395 400Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp405 410 415Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe420 425 430Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys435 440 445Gly Pro Asp Ser Ala Leu Xaa Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser450 455 460Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro465 470 475 480Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu485 490<210>2<211>498<212>PRT<213>人类<223>在455位置的Xaa为Val或Ala。<400>2Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp15 10 15Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln20 25 30Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val35 40 45Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly50 55 60Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp65 70 75 80Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp85 90 95Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala100 105 110Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr115 120 125Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala130 135 140Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu145 150 155 160Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly165 170 175Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly180 185 190Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala195 200 205Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala210 215 220Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala225 230 235 240Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln245 250 255Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp260 265 270Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr275 280 285Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg290 295 300Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln305 310 315 320Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn325 330 335Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe340 345 350Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr355 360 365Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His370 375 380Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp385 390 395 400Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp405 410 415Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe420 425 430Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys435 440 445Gly Pro Asp Ser Ala Leu Xaa Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser450 455 460Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro465 470 475 480Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly485 490 49权利要求
1．含有3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖链并具有凝血调节蛋白活性的肽。
2．按照权利要求1的所述肽，其中其氨基酸序列具有SEQ ID No.2的1-498位氨基酸残基的氨基酸序列或通过在所述氨基酸序列上应用用一个或几个氨基酸的取代、添加、插入和/或缺失所获得的氨基酸序列。
3．按照权利要求1或2的所述肽，其中其氨基酸序列具有SEQ IDNo.1的1-494位氨基酸残基的氨基酸序列。
4．特异性地结合到抗-人天然杀伤细胞-1抗体并具有凝血调节蛋白活性的肽。
5．按照权利要求4的所述肽，其中它基本上不含有连接了软骨素和/或硫酸软骨素的肽。
6．按照权利要求1或5中的任一项的所述肽，其中所述肽为天然来源肽。
7．按照权利要求1或5中的任一项的所述肽，其中所述肽为重组肽。
8．含有描述于权利要求1-7中任一项的所述肽作为有效成分的药用组合物。
9．用于纯化具有凝血调节蛋白活性的肽的方法，所述方法利用特异性地识别3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖链并与其结合的抗体的亲和力。
10．按照权利要求9的所述纯化方法，其中所述抗体为抗-人天然杀伤细胞-1抗体。
11．用于检测具有凝血调节蛋白活性的肽的酶免疫测定方法，所述方法利用特异性地识别3-位-O-硫酸化葡糖醛酸β1-3半乳糖β1-3半乳糖β1-4木糖链并与其结合的抗体。
12．按照权利要求11的所述检测方法，其中所述抗体为抗-人天然杀伤细胞-1抗体。
13．用于检测具有凝血调节蛋白活性的肽的酶免疫测定试剂盒，所述试剂盒含有抗-人天然杀伤细胞-1抗体。
全文摘要
本发明提供:具有在3－位硫酸化的β1－3半乳糖β1－3半乳糖β1－4木糖葡糖醛酸链并表现出凝血调节蛋白活性的新肽;含有所述肽作为有效成分的药用组合物;利用所述肽的治疗方法;通过用抗－HNK－1抗体的亲和层析分离上述肽的方法;以及用所述抗－HNK抗体的酶免疫测定方法。
文档编号C07K14/435GK1314915SQ99810075
公开日2001年9月26日 申请日期1999年6月30日 优先权日1998年6月30日
发明者长谷纯宏, 若林弘行 申请人:持田制药株式会社