专利名称：一种体外检测锌-a2-糖蛋白的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及检测血清或尿液等体液中脂肪动员因子锌-a2-糖蛋白(ZAG)的试剂盒和方法。
背景技术：
锌-a2_糖蛋白(ZAG)是存在于血浆及多种体液中的一种蛋白质，主要功能是促进脂肪动员分解，减少脂肪含量，故又名脂肪动员因子。ZAG是一种约41KD大小的可溶性蛋白，属于免疫球蛋白超家族，与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子a链的氨基酸序列有 30% -40% 同源。ZAG广泛分布于体液中，以及脂肪组织，前列腺，乳房，皮肤，肺，胰脏，肝，肾等多种组织中。ZAG作为一种脂肪动员因子能促进脂肪分解，在脂肪利用和减少脂肪含量中发挥重要作用，特别是在恶病质患者中例如忍受癌症、艾滋病和其他长期性疾病的病人患者当中。 ZAG在恶性肿瘤恶病质中能够直接影响与能量平衡调节密切相关的非偶联蛋白质(UCPs) 的表达。在人脂肪组织中，通过TM^a和PPAR γ核受体来调节ZAG的表达。ZAG的表达还受到糖皮质激素的上调和EPA和β _3_肾上腺素受体抑制剂的下调影响。ZAG的表达受交感神经系统、糖皮质激素及某些细胞因子的调节，地塞米松、肾上腺素受体类似物BRL37344等能增加ZAG mRNA的表达；多元不饱和脂肪酸EPA和肿瘤坏死因子 TNF- α等能明显抑制ZAG的mRNA水平。ZAG在一些特定的人类恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌或膀胱癌等分化性肿瘤中过量表达。此外，ZAG在肥胖症，糖尿病患者的肾脏紊乱和黑色素产生中发挥重要作用。ZAG推测能在肥胖症和恶病质中起治疗作用，并能作为肾脏性糖尿病患者和一些特定恶性肿瘤中的一种诊断性指标。临床研究表明，ZAG与原发性前列腺癌、乳腺癌及其引起的恶病质状况有密切关联，有明显恶病质的肿瘤患者血浆中ZAG的含量是年龄、性别匹配正常人的20倍；恶病质患者肿瘤组织中ZAG的表达比不具有恶病质患者肿瘤组织中ZAG 的表达明显高；恶病质肿瘤患者尿中含有大量ZAG，而在不具有恶病质的患者和正常人的尿中，检测不到ZAG ；血、尿ZAG的水平和体重减少存在明显的相关关系，ZAG水平越高，体重减少越多。目前用于ZAG检测的试剂盒有酶联免疫ELISA试剂盒，采用抗ZAG多克隆抗体进行检测，不仅测定步骤多、时间长、使用不方便，且存在特异性较差、准确性参差不齐、线性范围窄，这些因素大大限制了酶免试剂盒的推广与应用。因此，本领域迫切需要开发更快速、更准确、更方便的ZAG检测试剂盒，以满足准确、快速检测ZAG指标的需求。
发明内容
本发明旨在提供一种体外检测锌-a2_糖蛋白的方法。本发明还提供了用于体外检测锌-a2_糖蛋白的试剂盒。
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一种用于体外检测锌-a2-糖蛋白(ZAG)的方法，包括如下步骤(1)将待测样品和带有标记物的抗ZAG蛋白的单克隆抗体分别加入包被ZAG的固相载体的样品孔中，从而使样品孔中固相的ZAG和游离的ZAG分别与带有标记物的抗ZAG 蛋白的单克隆抗体形成固相载体-ZAG-单克隆抗体-标记物和游离-ZAG-单克隆抗体-标记物这两种二元复合物；(2)洗涤后检测固相载体-ZAG-单克隆抗体-标记物，并用与标记物相对应的底物进行化学发光或酶联显色反应检测信号，从而确定待测样品中ZAG存在与否以及存在的量。上述固相载体的材料可选用聚丙乙烯多孔板，硝酸纤维素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。上述的标记物可选用辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶(AP)，葡萄糖氧化酶， β -D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶，或葡萄糖淀粉酶。与标记物相对应的底物是指可被单克隆抗体上的标记物所催化显色，用于显示抗体与ZAG结合的信号，例如用于辣根过氧物酶的邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(ΤΜΒ)、 ABTS ；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯。所述的固相载体的材料可选用聚丙乙烯多孔板，硝酸纤维素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。固相载体上样本孔的数量为1 197个。用于体外检测锌-a2_糖蛋白(ZAG)的试剂盒，包括包被ZAG的固相载体和容器a， 容器a中含带有标记物的抗ZAG蛋白的单克隆抗体。所述的固相载体的材料可选用聚丙乙烯多孔板，硝酸纤维素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。固相载体上样本孔的数量为1 197个。更优选的，上述试剂盒还包括装有ZAG标准品的容器b、装有与标记物相对应的底物的容器C、装有显色剂的容器d、装有洗涤剂的容器e和装有中止液的容器f。标记物可选用辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶(AP)，葡萄糖氧化酶， β -D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶，或葡萄糖淀粉酶。与标记物相对应的底物是指可被单克隆抗体上的标记物所催化显色，用于显示抗体与ZAG结合的信号，例如用于辣根过氧物酶的邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(ΤΜΒ)、3， 4，5_三甲氧基苯甲醛(ABTS)；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯。本发明的基本原理是竞争法，将抗原固定于固相载体上，然后加入抗原和带标记的抗体，使固相载体上的抗原与液相中的游离抗原和抗体产生竞争性结合作用，反应后进行洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。当液相中游离抗原含量越高时，则结合固相载体上抗原的抗体越少，被检测到的信号则越低。ZAG是一种已知蛋白，其氨基酸和核苷酸序列都是本领域已知的。生产ZAG的方法也是已知的。例如，通过常规的DNA重组技术(kience，1984 ； 224 :1431)，可利用ZAG的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的ZAG蛋白，一般来说有以下步骤(1)用编码人ZAG蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。上述获得的重组ZAG蛋白可被加工成具有一定纯度的蛋白，用于制备标准品；此外，所述的ZAG也可分离自人体，例如，从人血清或尿液中提取和纯化ZAG。制备抗ZAG蛋白的抗体的技术是本领域中众所周知的，用于本发明的抗体是针对人ZAG具有高度特异性的单克隆抗体。可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol 6 ；511,1976 ；Kohler 等人， Eur. J. Immunol 6 ;292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and Tcell hybridomas,Elsevier,N. Y. , 1981) 0本发明的单克隆抗体可以利用人ZAG基因产物或片断或功能区，通过常规免疫技术获得。本发明的试剂盒和检测方法，灵敏度高，线性范围宽，能准确检测血清、尿液中的 ZAG ；而且测定步骤简单，可大大缩短检测时间，方便快捷。
图1为实施例IZAG标准品浓度参考曲线图2实施例2ZAG标准品浓度检测范围和灵敏度测定曲线
具体实施例方式实施例1(1)固相载体反应板的制备取96孔聚苯乙烯板，设置80个样本孔，2个阴性质控孔，2个阳性质控孔，12个不同浓度标准品孔。在每个反应孔均包被ZAG抗原QOOng/mg)。(2)试剂盒制备制备ZAG检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(13-37人份)，ZAG标准品1瓶(容器b)，高值质控品1瓶，低值质控品1瓶，酶标抗体(带有辣根过氧化酶的ZAG 特异性单克隆抗体)1瓶(容器a)，底物(邻苯二胺)1瓶(容器c)，显色剂1瓶(容器d)， 洗涤液1瓶(容器e)，终止液1瓶(容器f)。表1 ZAG检测试剂盒检测不同浓度标准品测定结果
权利要求
1.一种体外检测锌-a2-糖蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将待测样品和带有标记物的抗ZAG蛋白的单克隆抗体分别加入包被ZAG的固相载体的样品孔中，从而使样品孔中固相的ZAG和游离的ZAG分别与带有标记物的抗ZAG蛋白的单克隆抗体形成固相载体-ZAG-单克隆抗体-标记物和游离-ZAG-单克隆抗体-标记物这两种二元复合物；(2)洗涤后检测固相载体-ZAG-单克隆抗体-标记物，并用与标记物相对应的底物进行化学发光或酶联显色反应检测信号，从而确定待测样品中ZAG存在与否以及存在的量。
2.权利要求1所述检测锌_a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述固相载体的材料为聚丙乙烯多孔板、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
3.权利要求1所述检测锌_a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
4.权利要求1和3所述检测锌-a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述底物为标记物为辣根过氧物酶时，底物为邻苯二胺、四甲基联苯胺、3，4，5-三甲氧基苯甲醛；标记物为碱性磷酸酯酶，底物为对硝基苯磷酸酯。
5.一种体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，包括包被ZAG的固相载体和容器a，容器a中含带有标记物的抗ZAG蛋白的单克隆抗体。
6.权利要求5所述体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，固相载体的材料为聚丙乙烯多孔板、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
7.权利要求5所述体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，所述固相载体的材料为聚丙乙烯多孔板、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
8.权利要求5所述体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括装有ZAG标准品的容器b、装有与标记物相对应的底物的容器C、装有显色剂的容器d、装有洗涤剂的容器e和装有中止液的容器f。
9.权利要求5所述体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
10.权利要求5和9所述体外检测锌-a2-糖蛋白的试剂盒，其特征在于，所述底物为 标记物为辣根过氧物酶时，底物为邻苯二胺、四甲基联苯胺、3，4，5-三甲氧基苯甲醛；标记物为碱性磷酸酯酶，底物为对硝基苯磷酸酯。
全文摘要
本发明公开了一种体外检测锌-a2-糖蛋白ZAG的方法和试剂盒，利用竞争法，将抗原固定于固相载体上，然后加入抗原和带标记的抗体，使固相载体上的抗原与液相中的游离抗原和抗体产生竞争性结合作用，反应后进行洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。当液相中游离抗原含量越高时，则结合固相载体上抗原的抗体越少，被检测到的信号则越低。本发明的试剂盒和检测方法，灵敏度高，线性范围宽，能准确检测血清、尿液中的ZAG；而且测定步骤简单，可大大缩短检测时间，方便快捷。
文档编号G01N33/558GK102207505SQ20101013482
公开日2011年10月5日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者吴杨, 蔡兴锋 申请人:上海友科生物科技有限公司