专利名称：检测血清β2－糖蛋白I及其自身抗体的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与血清β2-糖蛋白I(β2-GPI)特异性结合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物7-酮胆固醇酯(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate)；以本衍生物为底物用于检测和分离纯化β2-糖蛋白I；用以确定是否存在与β2-糖蛋白有关的疾病，特别是用以确定是否存在动脉硬化和血栓形成发生危险性升高或降低有关的抗体，从而来检测疾病。
背景技术：
隶属于系统性红斑狼疮症的抗磷脂综合症(antiphospholipid syndrome；APS)是一种临床上十分难治的一类自身免疫性疾病，其临床的主要症状就是动脉硬化以及动静脉血栓的形成、习惯性流产和血小板减少等症状。血清学特征为大量自身抗体的存在。
其中抗心磷脂抗体由于与血栓形成、血小板减少、系统性红斑狼疮、习惯性流产、神经系统疾病、急慢性白血病、消化系统疾病、肾脏疾病等凝血系统改变等密切相关，所以抗心磷脂抗体可作为系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的辅助诊断指标及抗磷脂综合症诊断依据之一，也可作为临床上预测血栓形成趋势的标志。
长年以来，抗心磷脂抗体的测定在梅毒检测法中呈现梅毒生物学试验假阳性，其特异性和敏感性很差，1983-1984年间，开发了固相化心磷脂RIA和ELISA测定方法，而且近年来由于使用纯净的心磷脂作为抗原，抗心磷脂抗体的实验室和临床研究发展很快。目前抗β2-GPI抗体的检测方法是以纯净的心磷脂作为抗原检测抗β2-GPI抗体的IgG、IgM和IgA，但在临床患者血清自身抗体检测中，由于敏感性过高，相对特异性较差，更重要的是未能提供特异性的抗磷脂综合症发病机理相关的信息，所以，在目前的抗磷脂综合症实验室诊断检测中，仍然存在着诊断困难，缺乏有效药物，患者的死亡率高达75％以上。所以寻找能够提供抗磷脂综合症特异性发病原因即动脉硬化和血栓形成发病原因的特异性抗β2-GPI抗体的检测方法显得意义十分重大。
发明内容
1、氧化低密度脂蛋白衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate
在动脉粥样硬化的发生发展中，众多的理论研究和实验结果证实了LDL的氧化扮演了非常重要的角色，为了探索动脉粥样硬化的发病机理，在体外研究中，几种主要的LDL的实验模型是MDA-LDL、acetylated-LDL和Cu2+-LDL，在这些实验模型中，Cu2+-LDL显示了作为体外实验模型的优势，Cu2+能够诱导LDL氧化，导致LDL结构的高度破坏，产生了多种oxLDL的氧化产物。Cu2+所导致的LDL的破坏和产生的氧化产物与几种细胞(如血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等)诱导的LDL氧化以及从动脉硬化巢中所提取的oxLDL具有非常相似的性质和结果，而且在动脉硬化巢中提取出来的oxLDL展示了与Cu2+-oxLDL相似的物理和免疫学性质。而MDA是一个亲水性的短链乙醛结构，它很容易从LDL中分离和扩散，在透析之后，oxLDL的TBARS分离物减少到无法检测的低水平。所以，这已经成为一种共识，即将Cu2+-oxLDL作为一种体内外实验研究动脉硬化的自身抗原。
β2-GPI是抗磷脂综合症抗心磷脂抗体的主要抗原，具有结合如心磷脂(cardiolipin)等阴性磷脂、活化血小板及雕亡细胞膜表面暴露出来的磷脂酰丝氨酸的性质。近年来，通过对β2-GPI的变异蛋白质及体外合成多肽的研究以及结晶构造体的解析，发现β2-GPI的第五个domain上，特别是C281KNKEKKC288领域存在着与脂质结合的部位，更确切地说，结晶构造体表明，在第五个domain上K317与T318的位置如果发生断裂，β2-GPI与磷脂的结合活性消失。最近，George等报告在对LDL受体缺乏小鼠进行β2-GPI免疫之后，发现β2-GPI促进了小鼠动脉壁脂肪斑的形成。还报告在人动脉硬化巢中含有丰富的β2-GPI，并且是与CD4-阳性淋巴细胞共存。Lin等报告冠心病(CAD)患者血清LDL升高的同时，HDL、apoA-1和β2-GPI显示了低于正常人的水平。越来越多的证据表明β2-GPI卷入了脂蛋白和脂质的代谢中。这些结果和现象与Ross等提倡的伤害反应学说相加在一起，表明既不仅是各种细胞因子和免疫细胞，而且β2-GPI也显示了对动脉硬化发生和发展过程中重要的调节作用。
β2-GPI是抗磷脂综合症抗心磷脂抗体的主要抗原，大量的实验研究证实了β2-GPI与系统性红斑狼疮以及抗磷脂综合症动脉硬化发生血栓形成之间的重要相互关系，其动脉硬化及血栓形成的发病机制是一种相关于β2-GPI的自身免疫性机制。基于β2-GPI与系统性红斑狼疮以及抗磷脂综合症动脉硬化发生和血栓形成之间的重要相互关系以及结合阴性物质的特点，设想在系统性红斑狼疮以及抗磷脂综合症患者动静脉硬化和血栓发病中β2-GPI与动脉硬化危险因子oxLDL之间是否存在某种相关性，这种相关性是否能够提供更为有价值的特异性的动脉硬化和血栓发生的信息？我们在抗磷脂综合症的发病机制研究过程中，首次发现了β2-GPI和抗β2-GPI抗体与Cu2+氧化来源的氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)之间的相互关系，我们的结果还显示在抗磷脂综合症患者血清中存在的抗β2-GPI·oxLDL复合体抗体的出现与即往性动脉血栓症之间呈现正相关性。而且，这一抗体与抗磷脂综合症患者血清中β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体及抗β2-GPI抗体之间也呈现良好的相关性。我们的研究进一步显示，在血清中，确实存在着β2-GPI和oxLDL的复合体，而且这种复合体是稳定且不可分离的。体外实验还表明β2-GPI与oxLDL结合的复合物与致病性自身抗体尤其是IgG型血栓高危险性自身抗体特异性结合，经由巨噬细胞吞噬摄取，可能导致了抗磷脂综合症动脉硬化及血栓形成。
上述结果和实验数据均表明正常机体血浆中存在的一种糖蛋白β2-糖蛋白I(β2-GPI)和血中过多的低密度脂蛋白(LDL)在血管壁上的沉积以及由此而引起的LDL的氧化(oxLDL)卷入了抗磷脂综合症动脉硬化和血栓形成的自身免疫性发病机制中。既在抗磷脂综合症患者循环血流中，抗β2-GPI自身抗体识别oxLDL·β2-GPI复合体，三者形成了免疫复合物，这一三元免疫复合物可能是经由巨噬细胞的Fcγ受体摄取oxLDL的胆固醇脂，形成泡沫细胞，这可能是抗磷脂综合症患者动脉硬化及血栓形成的原因。这一研究成果为抗磷脂综合症特异性的临床诊断和治疗提供了十分重要的理论依据。上述研究结果提供了一种与β2-GPI特异性结合的oxLDL及其oxLDL活性衍生化合物应用于与动脉硬化和动静脉血栓发生有关的自身抗体的ELISA(酶联免疫吸附实验)测定。
然而β2-GPI与oxLDL的结合是由什么结构位点来介导，仍然不清楚，所以鉴定和分离纯化β2-GPI与oxLDL的结合的结构位点，将能够了解和实行一种更加易行简便的测定体系，此外，试剂在操作和储存上更易于运输，可以提供价廉低成本的质量稳定的测定试剂和测定试剂盒。
本发明的检测血清β2-糖蛋白I及其自身抗体的试剂，是能与血清β2-糖蛋白I(β2-GPI)特异性结合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物，本发明特有的特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一种结构为7-酮胆固醇酯衍生物，化学结构即是7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，用于检测与β2-糖蛋白I及相关的疾病。特别是用于检测与血清β2-糖蛋白I相关的动脉硬化和血栓形成发生危险性升高或降低有关的抗体。为了提供一种可以与β2-GPI特异性结合的底物，本发明人分离了与β2-GPI特异性结合的来源于oxLDL的一种配体，通过LC-MS及NMR方法确定其化学结构为7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate。研究表明，这一配体介导了oxLDL与β2-GPI的特异性结合，并且结合的活性中心就是配体结构中7-酮胆固醇的第三位所连接的短链脂肪酸末端的羧基团。毫无疑问，oxLDL的阴性基团即7-酮胆固醇酯的ω-COOH直接卷入了oxLDL与β2-GPI的特异性结合以及巨噬细胞吞噬摄取oxLDL的过程。本发明人并且以这一β2-GPI特异性配体7-酮胆固醇酯7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate为特异性抗原建立了β2-GPI和其抗体的特异性检测体系。
因此，含有这些抗原决定基的衍生物意味着可以用于ELISA方法中，这种方法比现有的将oxLDL颗粒作为抗原的ELISA方法更加准确和可靠，建立的ELISA测定体系和方法将能够更加准确的测定致病抗体。以及针对致病源有效预防和治疗动脉硬化。
所以，本发明公开和提供了1、一种氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物的分离或化学合成的方法；2、本活性衍生物在检测β2-GPI的应用方法；3、本活性衍生物在检测抗β2-GPI-衍生物复合物抗体的应用方法；2、本发明衍生物在ELISA测定体系中的应用1)、固相化载体作为固相化试剂的载体，典型的载体包括一种合成有机高分子化合物。例如载体可以做为各种形状，主要根据所用方法来确定载体的形状。
固相化试剂在载体上可以通过传统的方法固定在载体上。例如物理吸附，离子结合等方法，由于物理吸附法的简单易行，常常被用来进行固相化试剂的载体固定。
在本发明中，固相化试剂也可以通过传统的封闭处理方法来获得，例如BSA或gelatin，可以避免非特异性结合反应。
2)、本发明的固相化
本发明是一种不溶于水的衍生物，可以固定于包括板状、管状、珠状、膜状和凝胶上。固定材料可以是聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙或聚丙烯酰胺，在这些材料中聚苯乙烯为首选物质。固相化的方法通常采用脂类固定方法，如物理吸附法或共价键结合法，一般物理吸附法为首选，因为其方法简便，使用范围广泛。
本发明的固相化衍生物通常溶解于乙醇、甲醇、或者甲醇与三氯甲烷的混合物中。溶解物在固相材料上蒸发干燥，吸附于固相材料之上。当固相化表面的衍生物还没有被固定时，如果β2-GPI或者样品中所含有的其他分子此时接触固相化表面，就不能够得到精确正确的测定结果，所以，为避免这样的现象出现，通常用封闭物添加于固相化的衍生物上，例如封闭物主要包括血清白蛋白、干酪素(酪蛋白)、脱脂乳、白明胶或者商业用封闭物也可以用来进行封闭。封闭后的固相物储存在37℃，30min-2h，或者在15-25℃下2h。
3)、样品在本发明中，对于所测样品没有特殊的要求，所测样品可以是任何生物学的其中含有oxLDL的生物学样品。所测样品可以是全血、血清或血浆。所测样品需要一个前处理，既需要添加β2-GPI已形成能够测定的β2-GPI-oxLDL复合体，但是当所测样品为血清时，本身即含有β2-GPI，能够形成β2-GPI-oxLDL复合体，则前处理可以省略。当然，如果按照本发明的方法，前处理也可以省略。
4)、试剂盒体系本发明的试剂盒是一种β2-GPI的测定试剂盒。
试剂盒1A和BA固相系统B一种与β2-GPI结合的底物试剂盒2A和BA固相系统B一种与抗体结合的底物，这一抗体能够辨认β2-GPI-衍生物的复合体。
只要每一个试剂盒含有A和B即可。
试剂盒还可以包括(1)对于测定β2-GPI或抗体时制备标准曲线时所用的标准浓度曲线。
(2)一种测定标记底物的试剂，一种测定底物与β2-GPI、或抗体与β2-GPI-衍生物结合的试剂。
除了这些，试剂盒还同时可以包括封闭底物、洗脂物、样品稀释剂和酶反应终止剂。
这些试剂盒成分，可以单独储存，使用时按照测定方法操作使用即可。
本发明试剂盒的组成和装配试剂盒11、一个96孔的免疫板(Immuno-plate)，oxLig-1固定于其上。(1sheet)2、β2-GPI标准溶液(1set)3、抗β2-GPI抗体(WB-CAL-I)(1ViaL)4、HRP-labeled anti-mouse IgG antibody(1Vial)5、O-phenyenediamine solution(1Vial)6、Agueous hydrogen peroxide(1Vial)7、Reaction-terminating liquid(1N HCI)(1Vial)试剂盒21、一个96孔的免疫板(Immuno-plate)，oxLig-1固定于其上。(1sheet)2、β2-GPI(1Vial)3、HRP-labeled anti-mouse IgG antibody(1Vial)4、四甲基苯丁(Tetramethylbenzidine)溶液(1Vial)5、Agueous hydrogen peroxide(1Vial)6、Reaction-terminating liquid(1N HCI)(1Vial)
图1为7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的结构模式图；图2为7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate作为底物进行β2-GPI的测定；图3为7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate作为底物进行系统性红斑狼疮(SLE和抗磷脂综合症(APS)患者抗β2-GPI-配体复合物抗体和抗心磷脂抗体的测定比较血清样品。
实施方案的描述材料和方法1、试剂
L-α-Dipalmitoylphosphatidylserine(DPPS)，7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one，7KC)以及cholesteyl linoleate(5-cholesten-3β-3-linoleate)从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)购入。Dioleoylphosphatidyl-choline(DOPC)从Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster，AL)购入。其它试剂均为特级分析试剂。
2、oxLDL衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的分离提纯采用密度梯度超速离心法(35000rpm/min，4℃，24h)分离低密度脂蛋白LDL(d＝1.019-1.063g/ml)。Cu2+氧化法进行LDL体外氧化，LDL蛋白浓度为100μg/ml，CuSO4浓度为5μM，37℃8小时孵育后EDTA 1mM中止反应。PBS透析24小时。氧化后的oxLDL采用thiobarbituric acid substance(TBARS)反应及琼脂糖电泳测定oxLDL的氧化程度。oxLDL来源的脂(lipid)点样于硅胶-薄层层析板(Polygram，Machery-Nagel，Duren，Germany分离配体用)和PLC硅胶-60层析板(PLC silicagel-60 Merck，Darmstadt，Germany分离脂)，层析板分别在三氯甲烷/甲醇/30％氨水/水(120/80/10/5溶液A)以及三氯甲烷/甲醇(8/1溶液B)溶媒中展开，展开后，分离脂的层析板分别进行碘和钼兰试剂染色。TLC薄层层析得到的来源于oxLDL粗制β2-GPI配体进一步通过逆相HPLC分析和精制。
β2-GPI配体粗制样品在C18柱(250×4.6mm Sephasyl peptide，Pharmacia)上经过溶媒C(氰化甲烷/异丙醇30/70，v/v)和溶媒D(0.2％醋酸水溶液)的浓度流动相{(50％溶媒C-50％溶媒D混合液(0分钟)-100％溶媒C(15-40分钟)}溶出，流速在0.5ml/min，234nm的吸光度检测测定。HPLC精制分离后的β2-GPI配体样品在LC/MS-QP8000α(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)HPLC系统，APCI法经Shim-pack VP-ODS柱(150×4.6mm)分析。
3、oxLDL衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的化学合成7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one，50.1mg，0.13mmol)和azelaic acid(70.6mg，0.38mmol)溶于4ml丙酮中，随后加入1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(WSC；95.8mg，0.50mmol)和4-(dimethylamino)Pyridine(DMAP；30.5mg，0.25mmol)。混合物在室温下，经过两天搅拌、离心，用三氯甲烷抽提，抽提物用2M的hydrochloric acid、brine连续洗涤，anhydrous magnesium sulfate(无水酒石酸硫酸盐)干燥。干燥成分经过silica凝胶柱层析得到合成的β2-GPI配体oxLig-1(36.0％mg，产量为50.4％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)＝5.71(s，1H，H-6)，4.78-4.69(m，1H，H-3)；13C-NMR(75.5MHz，CDCl3)202.5，179.7，173.4，164.5，127.1，72.4，55.2，50.4，50.2，45.8，43.5，39.9，38.7，36.6，36.1，29.2，28.9，28.4，25.3，25.0，24.2，23.2，23.0，19.3，17.7，12.4.；m/z(FD-MS)571[(M+H)+，C36H59O5](图1)4、自身免疫性单克隆抗体WB-CAL-1(IgG2a)抗体来源于抗磷脂综合症模型(NZW X BXSB)F1小鼠，它是能够特异性识别β2-糖蛋白I隐藏的(cryptic)抗原决定基的单克隆抗β2-糖蛋白I抗体10)。Cof-23(IgG1)以及Cof-22(IgG1)来源于β2-糖蛋白I免疫后的小鼠，是具有识别β2-糖蛋白I native构造结构的单克隆抗体11)。
5、β2-糖蛋白I的分离与纯化β2-糖蛋白I通过Heparin-Sepharose、DEAE-cellulose层析柱以及抗β2-糖蛋白I亲和层析柱分离纯化12)，最后用protein A-Sepharose层析柱除去IgG，并且通过n-butanol除去结合的脂质成分。
6、β2-GPI的重组表达β2-糖蛋白I是一个已知的糖蛋白质，它的氨基酸和核酸序列已被报告，然而生物活性β2-糖蛋白I在通常的E.coli和酵母表达体系中由于不能够形成功能二硫键，所以不能够正确表达蛋白，主要原因是天然β2-糖蛋白I分子中有多达11个半胱氨酸(S-S)键，并且还具有一个反复折叠所形成的五个结构域结构，此外，β2-糖蛋白I的编码核苷酸序列的先头蛋白有一个突变的蛋白附加物，是由19个氨基酸组成的多肽，位于在N-末端，在蛋白分泌时这个多肽应该被切割掉。1993年Igarash利用baculovirus病毒表达体系解决了这一难题，所重组的β2-糖蛋白I与抗磷脂综合症患者的抗心磷脂抗体发生了特异性免疫反应，表明利用这一方法获得的β2-糖蛋白I具有生物学活性。(Clin，Exp.Immunol；93，19，1993)具体实施例实施例1β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体的ELISA测定心磷脂(CL)浓度为50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(DynexTechnologies Inc.，Chantilly)ELISA培养板中，物理干燥吸附后，1％BSA封闭，随后依次加入β2-GPI(15μg/ml，50μl/well)和抗β2-GPI抗体(Cof-22和WB-CAL-I)，室温下共同孵育1小时，最后与辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体孵育1小时，显色后490nm的吸光度测定。在上述各步骤之间，酶标板用0.05％Tween 20的PBS充分洗净。
抗β2-GPI-7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate复合物抗体的ELISA测定化学合成的oxLDL衍生物(Syn-oxLig-1)浓度为50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(Dynex Technologies Inc.，Chantilly)ELISA培养板中，物理干燥吸附后，随后的步骤等同于“β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体的ELISA测定”上述实验结果表明，以β2-GPI-配体7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate为底物的抗β2-GPI-7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate复合物抗体与β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体具有几乎相同的抗体效价。
实施例2系统性红斑狼疮(SLE和抗磷脂综合症(APS)患者抗β2-GPI-配体复合物抗体和抗心磷脂抗体的测定比较心磷脂(CL)或化学合成的oxLDL衍生物(Syn-oxLig-1)浓度为50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(Dynex TechnologiesInc.，Chantilly)ELISA培养板中，物理干燥吸附后，1％BSA封闭，随后依次加入β2-GPI(15μg/ml，50μl/well)和SLE、APS患者血清样品(用0.3％的PBS以1∶100稀释，50μl/well)，室温下共同孵育1小时，最后与辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体孵育1小时，显色后490nm的吸光度测定。在上述各步骤之间，酶标板用0.05％Tween 20的PBS充分洗净。
上述实验结果表明，与系统性红斑狼疮阴性患者(SLE-)和抗磷脂综合症阴性患者(APS-)相比，抗β2-GPI-配体复合物抗体和抗心磷脂抗体在SLE阳性患者和APS患者血清中都显示了同样高水平的抗体效价。
权利要求
1.一种检测血清β2-糖蛋白I及其自身抗体的试剂，是能与血清β2-糖蛋白I特异性结合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物，其特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一种结构为7-酮胆固醇酯衍生物，用于检测β2-糖蛋白I及其与之相关的疾病。
2.如权利要求1所述试剂，其特征在于用于检测与血清β2-糖蛋白I相关的动脉硬化和血栓形成发生危险性升高或降低有关的抗体。
3.如权利要求1或2所述试剂，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物来源于Cu2+氧化的低密度脂蛋白的脂成分。
4.如权利要求3所述试剂，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物其主要活性成分来源于oxLDL脂中胆固醇亚油酸的氧化产物。
5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于7-酮胆固醇酯功能衍生物为氧化形式。
6.如权利要求4所述的试剂，其特征在于7-酮胆固醇酯功能衍生物为化学合成形式。
7.如权利要求1或2或4或5或6所述的试剂，其特征在于β2-糖蛋白I及其抗体的测定方法为一种免疫检测方法。
8.如权利要求7所述的试剂，其特征在于免疫检测方法为ELISA方法。
9.如权利要求1所述的试剂，其特征在于抗体检测是一种特异性识别“β2-糖蛋白I-衍生物复合物”的抗体。
10.如权利要求1所述的试剂，其特征在于与抗体相关的疾病为抗磷脂综合征或血栓症。
全文摘要
本发明涉及与血清β2－糖蛋白I(β2－GPI)特异性结合的一种氧化低密度脂蛋白衍生化合物7－ketocholesteryl－9－carboxynonanoate的分离或化学合成；以及以本衍生物为底物用于检测和分离纯化β2－糖蛋白I；用以确定与β2－糖蛋白I相关的动脉硬化和血栓形成发生危险性升高或降低有关的抗体检测试剂。
文档编号C12Q1/00GK1869696SQ20051004652
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者刘庆平, 刘华 申请人:大连大学