专利名称：一种检测接受基因治疗的受治者血清中有复制能力的病毒的方法
背景技术：
本发明涉及一种通过测定病人血清中是否存在抗体来检测基因治疗过程中是否存在有复制能力的病毒(RCV)的方法，该方法是利用逆转录病毒Gag或Env蛋白的特定抗原部分来实现的，基因治疗中所使用的病毒载体来源于该逆转录病毒。
基因治疗是一种医学干涉方法，通过将正常基因导入到病人细胞中，来治疗由基因突变或代谢紊乱引起的疾病。毫无疑问，生物和遗传工程技术在将来会继续快速发展，所以预计基因治疗会成为一种治疗目前不能治愈或难以治愈的疾病的最有效的方法。
基因治疗的最重要部分是载体系统，它用来将用于治疗的基因导入生物体。目前广泛使用的病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒。逆转录病毒载体是最常用的，目前用于约50％的临床试验中。大多数逆转录病毒载体来源于鼠白血病病毒(MLV)。
虽然病毒载体是基因治疗的具代表性的选择，但在它们的应用中有一定的安全性问题。治疗性的病毒载体通过遗传工程设计为复制缺陷型，但通过载体和病人中与病毒基因组类似的核苷酸序列之间的同源重组，可以产生有复制能力的病毒(RCV)。这在用病毒载体进行基因治疗中存在严重危险。因此，为确保基因治疗的安全性，已经发展了几种方法来检测RCV。美国食品和药品管理局(FDA)指南规定，不仅要在重组病毒的产生阶段筛查是否有具有复制能力的逆转录病毒(RCR)存在，而且需在对病人给药病毒载体后进行定期筛查。
应该在两个阶段检测RCR是否存在。第一个阶段是在病毒载体从生产者细胞系的产生阶段或在用逆转录病毒载体体外转导靶细胞之前。第二个阶段是在将进行遗传工程操作的细胞给药受治者后，其中细胞含有通过逆转录病毒导入的用于治疗的基因。典型的做法是10-20个受治者参与I期的临床试验，以一年三次的频率监测RCR是否存在。因此在该过程中耗费了大量的人力，时间和物力。
已经有几种方法用于RCR的检测，包括用Mus dunni细胞进行检测，逆转录酶检测和聚合酶链式反应(PCR)。
用Mus dunni细胞检测RCR如下所述。产病毒的细胞或含病毒的培养上清与含标记基因(如潮霉素，LacZ基因)的Mus dunni细胞共培养。从该共培养物中获得的上清用来感染适当的靶细胞，通过标记基因的表达监测病毒的存在(Forestell等，J Virol Methods 60171-178，1996)。该方法基于以下原理含有标记基因的RCR仅能通过具有包装序列而不含有其他病毒序列的逆转录病毒与不含有包装序列的Mus dunni细胞之间进行重组而产生。Mus dunni细胞也用于S+L-病灶(focus)检测(Haapala DK等J Virol.53827-833，1985)。RCR可通过Mus dunni细胞与产病毒细胞或从产病毒细胞获得的上清共培养后病灶的形成来进行检测。这些方法要花费多于一个月的时间，因为需要几轮上清或产病毒细胞与Mus dunni细胞的共培养以增加RCR的滴度。另外，S+L-检测本身也要另外花费5-7天。
逆转录酶检测方法需要根据以下假设进行，只有通过重组产生的RCR具有逆转录酶活性，而用于治疗的逆转录病毒没有。
PCR方法对RCR的检测是通过一对引物进行的，其中一个引物序列存在于逆转录病毒载体上，而另一个存在于原始病毒上，但不存在于逆转录病毒载体上。这是临床试验中最常用的一个方法，但其自身存在重现性低的问题(Long等，Human Gene Ther.91165-1172，1998；Otto等，Human Gene Ther.5567-575，1994)。上述方法都需要耗费大量的时间和劳力，而且受低重现性和灵敏度的问题的困扰。
因此，已经进行研究以发展更为经济的方法，使其需要更短的时间和更少的样品，但是仍能保持高的灵敏度。已报道的一种此类的研究是通过ELISA检测是否产生抗MLV的抗体来检测RCR(Martineau等，Human Gene Ther.81231-1241，1997)。然而，由于整个MLV病毒被作为一个抗原，该方法的特异性和灵敏度仍不能令人满意。因此，需要生产具有高特异性和灵敏度的抗原来解决基于抗原-抗体相互作用进行RCR测定中抗原的特异性，灵敏度及其导致的使用上受限的问题，为了克服原有RCR检测方法中的问题，本发明人开发了一种高通量的RCR检测方法，它可以在逆转录病毒基因治疗后，使用从MLV衍生的特异抗原与病人的血清反应，从而很容易的筛查抗体的产生。该方法基于以下发现Gag或Env蛋白的特定片段具有RCR检测所需的特异性和灵敏度水平。
本发明的进一步的目的是提供一种高灵敏度和经济的方法，可以高效地并用最少量的样品来检测受治者中RCR的产生。
本发明更进一步的目的是提供一种通过病人血清与从MLV的Gag或Env衍生的抗原反应来检测RCR的方法，该方法是通过检测受治者中抗RCR的免疫反应所产生的抗体是否存在来进行的。
图2表示重组质粒的构建的示意图，其中编码病毒蛋白的相应DNA片段插入到pMAL-c2载体中，以使MLV Gag的p30(CA)或Env的p15E(TM)可以作为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白而被表达。
图3表示重组质粒的构建的示意图，其中相应的编码DNA插入到pET-17b或pET-3a载体中，以使它们可以表达MLV Env的CA，TM或gp70(SU-1)用来作为T7标记的蛋白。
图4a为SDS-PAGE照片，所示的是IPTG诱导前后MLV Gag(CA)蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
泳道1对照(IPTG诱导的pMAL-c2)泳道2和3IPTG诱导前后的MBP-CA(70kDa)泳道4和5IPTG诱导前后的T7-CA(31kDa)
图4b为SDS-PAGE照片，所示的是IPTG诱导前后MLV Env(TM和SU-1)蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
泳道1对照(IPTG诱导的pMAL-c2)泳道2和3IPTG诱导前后的MBP-TM(57kDa)泳道4和5IPTG诱导前后的T7-TM(17kDa)泳道6和7IPTG诱导前后的T7-SU-1(24kDa)图5为凝胶照片，所示的为收获在大肠杆菌中产生的抗原蛋白后经柱层析的纯化结果(MBP融合蛋白用直链淀粉树脂柱，T7-标记的蛋白用Sepharose柱)。
泳道1CA，其中MBP部分用蛋白酶因子Xa除去泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5.T7-SU-1图6a所示的为显示Western印迹的结果的照片，其中从pMAL-c2，pET-17b或pET-3a中表达的重组蛋白CA，TM和SU-1与兔抗-CA血清反应。
泳道1CA泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5T7-SU-1图6b所示的为显示Western印迹的结果的照片，其中从pET-17b或pET-3a中表达的重组蛋白CA，TM和SU-1与小鼠抗-MLV血清反应。
泳道1T7-CA泳道2T7-TM 泳道3T7-SU-1图7a所示的为进行ELISA反应后T7-CA以S/CO(样品吸收值与临界值(cutoff value)的比)表示的特异性的图，其中兔抗-CA血清作为阳性样品，而正常兔血清作为阴性对照。
图7b所示的为进行ELISA反应后T7-SU-1以S/CO(样品吸收值与临界值的比)表示的特异性的图，其中小鼠抗-MLV血清作为阳性对照，而正常小鼠血清作为阴性对照。
图7c所示的为进行ELISA反应后T7-CA和T7-SU-1的特异性的照片，其中每个蛋白单独或者共同用作抗原，并且与小鼠抗-MLV血清反应。
图8所示的为特异性测验的结果，其中T7-CA，T7-TM和T7-SU-1制成蛋白芯片的形式，并且与兔抗-CA血清(a)，小鼠抗-MLV血清(b)和正常小鼠血清(c)进行反应。
发明详述本发明提供一种通过检测病人血清中是否存在抗体来检测基因治疗中是否存在有复制能力的病毒(RCV)的方法，该方法是利用逆转录病毒Gag或Env蛋白的一些抗原部分来实现的，基因治疗中所使用的病毒载体来源于该逆转录病毒。
本发明的RCV检测方法通过抗原-抗体反应检测病人血清中抗体是否存在。反应中所用的与病人血清反应的抗原蛋白的编码基因不存在于基因治疗中所用的病毒载体上，而存在于该载体所来源的病毒基因组中。
在基因治疗中所用的病毒载体通常不能进行复制，因为大部分的gag，pol和env从原始病毒基因组中除去了。要将它们包装到病毒颗粒中，需要转染到可以反式(in trans)提供Gag，Pol和Env的包装细胞的步骤。因此，Gag或Env的部分作为抗原蛋白是优选的，因为其编码基因不存在于基因治疗中所用的病毒载体上，而存在于该病毒载体所来源的病毒基因组中。因此，有可能消除病毒载体自身可能产生的假阳性信号，从而使本发明具有高度特异性。
本发明中的RCR检测方法可用于以逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒及慢病毒作为治疗所用的载体的各种情况。而且，本发明中的RCR检测方法也可用于使用逆转录病毒，特别是鼠白血病病毒(MLV)进行的基因治疗。
抗原是MLV的Gag或Env蛋白的部分是尤其优选的。而且，对于更高的特异性和灵敏度更为优选的是，MLV Gag蛋白的部分包括SEQID2所代表的氨基酸序列，以及MLV Env蛋白的部分包括SEQ ID6所代表的氨基酸序列。
上述抗原性蛋白可以融合蛋白形式生产-与麦芽糖结合蛋白或由11个氨基酸构成的T7标记进行融合-以便于纯化。
本发明的基于抗原-抗体反应的RCR检测方法可通过各种方法进行操作，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)，Western印迹，FLISA(荧光联免疫吸附测定)及其他可检测抗原-抗体结合的分析方法。虽然ELISA和FLISA是优选的方法，但偶连ELISA或FLISA的Western印迹和中和测定方法可提高分析的精确性。而且，本发明与已知的PCR方法偶连可用于得到同样的效果。
本发明中的抗原蛋白可以用自动微阵列布放系统(microarrayer)以蛋白芯片的形式进行制造，以用来进行分析。应用蛋白芯片可完成高通量的自动化的高效的反应，因为大量的样品可以用一个芯片在一个反应中进行分析。蛋白芯片是一个小规模的固相的矩阵，在其上排列数十个到几百个点，每个点包含1-100pg抗原，并被固定在小规模固相矩阵上。芯片可以用来大规模分析(mass-analysis)，因为它可以用自动化的微阵列布放系统产生。所用的产生上述蛋白芯片的基片可由各种材料制作。优选的材料包括玻璃和改性的硅氧烷，和常用的聚合物(例如四氟乙烯，聚苯乙烯和聚丙烯)和凝胶，但并不限于这些材料。虽然包被该微基片的优选的材料是氨基烷基硅烷，但也可以使用其他的材料，包括塑料，树脂，碳水化合物，硅石，硅石衍生物，碳，金属，无机玻璃，膜或者化学物质，以固定抗原蛋白。
包被了抗原的蛋白芯片可浸入浓度高于50％的醇中。基于用上述包被了抗原的蛋白芯片进行的RCV分析，如果病人的血清与使用微阵列布放系统的抗原反应，然后与作为第二抗体的结合了荧光染料的抗人IgG抗体反应，那么可进行大量-分析(mass-analysis)。结果可通过自动记录仪，如高速荧光扫描仪获得.
本发明也提供一种诊断试剂盒，可分析接受基因治疗的病人血清中RCV的产生。本发明的试剂盒包含抗原，其编码基因不存在于基因治疗所用的病毒载体上，而存在于该载体所来源的病毒基因组上。
作为上述过程中的抗原蛋白，MLV的Gag或Env蛋白的部分是优选的。特别是，当Gag蛋白的部分包括SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列或MLV Env蛋白的部分包括SEQ ID NO6的所代表的氨基酸序列时更为优选。上述的RCR诊断试剂盒可以以蛋白芯片的形式提供，其中的抗原蛋白固定在小规模的固相矩阵中。
上述的试剂盒包括附加的ELISA，FLISA或Western印迹通常所需的合适的试剂或者器材。
本发明的RCR检测方法中所用的抗原蛋白可通过构建表达质粒，该质粒包含来自用于产生治疗用重组病毒的病毒基因组的一些基因，以及在大肠杆菌中表达这些基因等来进行大规模生产。本发明提供一种包含SEQ ID NO1的核苷酸序列(编码SEQ ID NO2的抗原)的表达载体，和一种包含SEQ ID NO5的核苷酸序列(编码SEQID NO6的抗原)的表达载体，它们保藏在韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM-10173(1999年11月11日)和KCCM-10224(2000年11月10日)。
在本发明的优选的实例中，p30(衣壳蛋白CA，MLV Gag蛋白的部分)，p15E(TM)和gp70(包括脯氨酸-富集序列的上游区；SU-1)被选作抗原来检测抗MLV的抗体。已知衣壳蛋白p30在大部分逆转录病毒中高表达，其氨基酸序列在不同的亚型中高度保守。Env抗原被选作诊断试剂中的主要抗原。虽然Env的氨基酸序列没有衣壳蛋白的序列保守，但预期其免疫性却更高。而且Env蛋白的跨膜结构域(TM)和胞外结构域(SU-1)均被克隆，因为二结构域的抗原性显得不同。所选择的抗原(CA，TM和SU-1)在基因组中的位置如
图1所示。
根据MLV Gag和Env的氨基酸序列选择高度保守的区域。然后通过PCR得到编码CA，TM和SU-1的部分的基因，并插入到表达载体中。可形成MBP融合蛋白的pMAL-c2载体，pET17b和pET3a(表达T7标记的蛋白)被用来作为表达载体以利于蛋白的纯化。在大肠杆菌中的蛋白表达结果表明，蛋白质的表达水平和抗原性因序列而异。最明显的是，由263个氨基酸构成的CA和由197个氨基酸构成的SU-1表现出最高的表达水平和抗原性。另一方面，插入到pET17b中的SU-1蛋白的表达水平太低，不能用于进一步的实验。
在大肠杆菌中的蛋白表达，通过加入IPTG进行诱导，并在SDS-PAGE上进行检测，然后蛋白通过柱层析进行纯化。本发明中的抗原蛋白的表达水平在加入IPTG之前非常低，但加入IPTG后，增加到总蛋白的10-20％。在纯化后所检测到的抗原几乎为单一的条带，这表明其纯度很高(见图5)。
在本发明的其他例子中，Western印迹和ELISA被用来检测抗原对抗MLV抗体的特异性和灵敏度。融合蛋白MBP-CA用蛋白酶因子Xa进行处理，以获得纯的CA蛋白。纯化的CA腹膜腔内注射到兔中，获得含抗CA抗体的兔血清。抗MLV抗体是通过将MLV(作为整个病毒)注射到小鼠尾静脉中，并从免疫的小鼠中收获阳性小鼠血清得到的。在该例子中使用兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清，因为MLV在人类中感染的病例很少，并且不可能获得阳性的人血清。Western印迹是通过本发明的抗原性蛋白与上述兔抗-CA血清或小鼠抗-MLV血清反应进行的。结果表明每个抗原与该抗体特异性地反应(见图6a和6b)。对Gag而言，CA和T7-CA都非常强烈地与1∶5000稀释度的兔血清反应。但Env蛋白的TM和SU-1没有反应。而且，只有T7-CA和T7-SU-1与小鼠抗MLV血清反应。在两个蛋白中，SU-1比CA表现出更强的反应性。T7-TM根本没有反应。
在本发明的其他例子中，通过抗原性蛋白与抗体的ELISA反应，来评估测定的灵敏度和特异性。ELISA的临界值(cutoff)为高于阴性对照的平均吸收值(正常兔血清或正常小鼠血清)0.3的值。结果表示为S/CO(样品OD/临界值)，当S/CO大于1时，被认为是阳性的。
CA和T7-Ca对兔抗CA血清的S/CO高于4，并且被认为是阳性的，但MBP-TM，T7-TM，和T7-SU-1对兔抗CA血清的S/CO低于1，并且被认为是阴性的。这些结果与前面实验中的Western印迹是一致的，而且表明本实验的CA抗原具有高特异性。CA，T7-CA和T7-SU-1对小鼠抗MLV血清的S/CO高于3，而MBP-TM和T7-TM的S/CO在1-2之间。这些结果表明这些蛋白的抗原性是不同的。
根据这些结果，用显示高抗原性的T7-CA和T7-SU-1评估ELISA的敏感性。
在ELISA中，这些抗原的灵敏度的评估是通过2倍系列稀释样品来进行的。ELISA反应用稀释到1∶640,000的兔血清和稀释到1∶2560的小鼠血清进行。最初的小鼠血清在人血清中进行10倍稀释，以模拟人暴露于MLV的状态。T7-CA的S/CO直到兔抗-CA血清稀释到1∶160,000时仍大于3(见图7a)，表明其具有高灵敏度。T7-SU-1的S/CO直到小鼠抗MLV血清稀释到1∶64时仍大于4(见图7b)。T7-CA和T7-SU-1的S/CO分别在直到小鼠抗MLV血清1∶64的稀释度和1∶256的稀释度时仍然大于3。当两个抗原混合时，S/CO在直到稀释到1∶256时仍大于2(见图7c)，上面的结果表明CA和SU-1抗原均有高灵敏度和高特异性，这证明它们可以在接受基因治疗的病人血清中通过检测MLV抗体，来检测通过同源重组产生的RCR。T7-SU-1的S/CO随血清稀释度的降低比T7-CA的慢。这表明即使T7-SU-1被用作单独的抗原，它也能作为一种有效的抗原来检测任何抗MLV的抗体。
本发明的其他例子中，其中T7-CA，T7-TM，和T7-SU-1抗原被固定在氨基烷基硅烷包被的玻片上的蛋白芯片被用来研究大规模分析的应用的可行性。T7-CA和T7-SU-1在蛋白芯片上的抗原-抗体反应中表现出高的灵敏度和特异性，因此已证实本发明的的抗原适于应用蛋白芯片进行RCR的大规模分析。
本发明在以下的实施例中进行详细描述。
显然，对本领域的普通技术人员来说，以下的实施例是为了举例说明本发明而非限定其范围。
pMLV(Shinnick等，《自然》293543-548，1981)被用来作为模板，合成的包含适当的限制酶位点的寡核苷酸被用来作为5’和3’引物扩增CA，TM和SU-1。在PCR中所用的引物序列根据目的基因和限制酶位点以SEQ ID NOs7-14表示并列于表1中。
表1
用MLV HIT456基因组作为模板进行PCR反应。反应包括30个循环，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒。反应包括每种引物1ul(10pmol/ul)和0.75mM高保真PCR系统(Roche，美国)。PCR产物连接到pCR Blunt(Invitrogen，The Nethelands)或pCR2.1(Invitrogen，The Nethelands)上。详细描述如下，CA基因片段通过序列为SEQ ID NOs7和9，或7和8的引物的组合进行扩增，TM基因片段通过序列为SEQ ID NOs10和12，或11和12的引物的组合进行扩增，并将它们插入到pCR Blunt载体上。同时，SU-1基因片段通过序列为SEQ ID NOs13和14的引物的组合进行扩增，并将它们插入到pCR2.1载体上。
上述基因克隆到pMAL-c2(New England Biolabs，美国)，pET-17b(Novagen，美国)，或pET-3a(Novagen，美国)上，以MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或T7-标记的(Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Glu-Glu-Met-Gly)蛋白质的形式进行抗原表达。表达载体的构建方案如图2和3所示。
首先，将用一对引物SEQ ID NOs7和9扩增的CA PCR产物(768bp)插入到pMAL-c2的EcoRI/SalI位点，得到MBP-CA。将用一对引物SEQ ID NOs8和9扩增的CA PCR产物(734bp)插入到pET-17b的BamHI/XhoI位点，得到T7-CA。将用一对引物SEQ IDNOs10和12扩增的TM PCR产物(396bp)插入到pMAL-c2的EcoRI/SalI位点，得到MBP-TM。将用一对引物SEQ ID NOs11和12扩增的TM PCR产物(369bp)插入到pET-17b的BamHI/XhoI位点，得到T7-TM。
将用一对引物SEQ ID NOs13和14扩增的SU-1 PCR产物(591bp)插入到pET-3a的BamHI位点，得到T7-SU-1。来源于pET-17b和pET-3a的表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。
用T7-CA转化的大肠杆菌菌株(BL21-T7-p30)和用T7-TM转化的大肠杆菌菌株(BL21-T7-p15E)在1999年11月11日保藏在韩国微生物保藏中心(保藏号KCCM-10173，KCCM-10174)。用T7-SU-1转化的大肠杆菌菌株(BL21-T7-gp70)在2000年11月10日保藏在同一中心(保藏号KCCM-10224)。实施例2在大肠杆菌中表达和纯化MLV抗原用实施例1中制备的MLV Gag或Env表达质粒所转化的大肠杆菌在1升LA肉汤(2％细菌用胰蛋白胨，1％酵母抽提物，2％氯化钠，1x氨苄青霉素)中，37℃培养至OD600为0.5。加入异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoid)(IPTG)至终浓度1mM以诱导Gag的CA，Env的TM和SU-1的表达。4℃，5000rpm离心10分钟收获细胞。然后将细胞沉淀重新悬浮到裂解缓冲液(20mMTris，2mM EDTA，1mM苯基-甲基磺酰化氟，pH8.0)中，冰上放置20分钟。超声5分钟使细胞裂解，离心得到上清和沉淀。
用SDS-PAGE来鉴定目的抗原是否存在于上清或沉淀中。上清中的抗原不需要进一步的纯化，但是在沉淀中的抗原根据表达载体用两种方法进行纯化。
对从pET-17b中表达的抗原，将其沉淀溶解在8M尿素溶液中，调节pH到5.6，上样到用平衡缓冲液(醋酸钠中的8M尿素，pH5.6)平衡的Q Sehparose Fastflow柱(Amersham Pharmacia，瑞典)中。上样后，用多于3倍床体积的平衡缓冲液洗柱。监测洗脱液的光密度后，用梯度从50mM到500mM的氯化钠纯化目的蛋白。从pET-3a中表达的SU-1抗原用同样的方案进行纯化，除了溶液的pH调到pH9.6，用含8M尿素的碳酸盐缓冲液(碳酸钠含8M尿素，pH9.6)作为平衡缓冲液，及使用SP Sehparose Fastflow柱(AmershamPharmacia，瑞典)进行纯化。
对于从pMAL-c2载体中表达的抗原，将其沉淀溶解在直链淀粉树脂平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，2mM NaCl，1mM EDTA，10mM巯基乙醇，pH7.4)中，并加样到用平衡缓冲液平衡的直链淀粉柱(NewEngland Biolabs，美国)中。上样后，用多于10倍床体积的平衡缓冲液洗柱。用洗脱缓冲液(在平衡缓冲液中含10mM麦芽糖)纯化目的抗原，并在280nm监测洗脱液的光密度。用因子Xa除去MBP标记，并且该产物用于以后的实验中。
通过上述过程得到的抗原纯度用SDS-PAGE进行鉴定。在加入IPTG前表达的抗原很少，而加入IPTG后表达水平增加到总蛋白的10-20％(见图4a和4b)。使用柱层析对收集的包涵体进行纯化后，检测到的抗原几乎为单一条带，表明其具有高纯度(见图5)。每个抗原蛋白的表达水平列于表2中。
表2
插入到pET-17b上的，通过一对序列为SEQ ID NOs13和14的引物扩增的SU-1片段(591bp)不用于以后的实验中，因为其表达水平太低，如上表所示。实施例3用MLV抗原进行动物免疫从用MLV转染的细胞中获得的病毒上清和通过除去MBP标记来源于MBP-CA的CA抗原被用来作为动物免疫中的免疫原。用DO-A2-CAT质粒通过3质粒转染方法(Yuco等，《核酸研究》，23-24，1995)转染人胚胎肾细胞系(293T细胞)，并且在转染48小时后，用0.45um的滤膜过滤培养液，制备包含病毒的上清。对20只小鼠(5周龄)的尾静脉用100uL病毒上清在两周内注射4次。
对CA抗原，通过用因子Xa处理在实施例3中纯化的MBP-CA获得CA部分。将它按照1∶1的比例与弗氏完全佐剂(GIbcoBTL，美国)混合，以100ug/ml的浓度对两只兔(8周龄)在4周内腹膜腔内注射3次。
免疫后从动物心脏采血，以获得抗MLV的血清，并且血清与纯化的抗体一起用于Western印迹与ELISA中。实施例4Western印迹用CA，TM和SU-1抗原与实施例3中获得的抗CA或MLV的抗体通过Western印迹分析抗原抗体的相互作用，以检测在实施例2中产生的MLV抗原是否能有效地与MLV抗体反应。在实验中使用的是兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清，因为在人类中MLV感染的病例非常稀少。
纯化的抗原用小型凝胶设备(#SE280，Hoefer Pharmacia Biotech，美国)进行SDS-PAGE分离，然后转到硝酸纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液(5％脱脂乳，0.1％Tween 20，Tris缓冲盐)中缓慢振荡温育1小时，然后与1∶5000稀释度的兔抗CA血清或1∶500稀释度的小鼠抗MLV血清在室温下温育1小时。用TBST洗膜3次，然后与1∶10000稀释度(在封闭缓冲液中)的连接辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗兔或抗小鼠IgG抗体温育30分钟。接着，用TBST洗膜3次。然后，加入1ml ECL溶液(鲁米诺/增强剂及稳定的过氧化物溶液，Amersham)。然后，将它在室温下温育1分钟，在暗室中曝光底片，然后用显影液显示条带。
Western印迹的结果表明纯化的抗原与抗体特异性地发生相互作用。对Gag而言，CA和T7-CA都能与1∶5000稀释度的兔血清强烈地相互作用。TM和SU-1都不能与兔血清作用(见图6a)。T7-CA和T7-SU-1都能与小鼠抗MLV血清相互作用。SU-1比CA表现出更强的反应性。T7-TM没有任何相互作用(见图6b)。实施例5ELISA病毒感染性的诊断通常是通过ELISA进行的。用ELISA来确定是否本发明中的抗原具有RCR检测的ELISA所需的特异性和灵敏度。将实施例2中纯化的抗原在50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中稀释到终浓度5ug/ml，然后将100ul稀释的抗原加入到96孔板的每个孔中，室温下放置18小时。然后，在每个孔中加入100ul含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(Ph7.2)。室温下温育1小时后，将血清样品加入到板中。兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清作为阳性对照，正常兔或小鼠血清作为阴性对照。100ul 1∶1000和1∶10稀释度的每种血清(封闭缓冲液中含0.25％Tween 20)加入到每个孔中，在37℃温箱里温育1小时。温育后，用PBST(在PBS中含0.05％的Tween 20)洗板5次，然后在每个孔中加入100ul 1∶10000稀释度的HRP-连接的羊抗兔或抗小鼠IgG抗体。板在37℃温箱里温育30分钟，用PBST(在PBS中含0.05％的Tween 20)洗板5次。然后加入100ul四甲氧基联苯胺(tetramethoxybensidine)(TMB)，室温下温育30分钟。加入100ul 0.5N的硫酸终止反应。在450nm测定吸收值。
本实验中的ELISA临界值为高于阴性对照的平均值0.3的值。结果以S/CO(样品OD/临界值)的形式给出，并且当S/CO大于1时，该样品被认为是阳性(表3)。
表3
CA和T7-CA对兔抗CA血清的S/CO高于4，并且被认为是阳性的。但是，MBP-TM，T7-TM和T7-SU-1的S/CO低于1，并且被认为是阴性的。这些结果与Western印迹的结果是一致的，而且表明本发明所用的CA抗原具有很高的特异性。该实验中所用蛋白的抗原性是不同的，因为CA，T7-CA和T7-SU-1对小鼠抗-MLV血清的S/CO高于3，而MBP-TM和T7-TM的S/CO在1-2之间。根据这些结果，用显示高抗原性的T7-CA和T7-SU-1对ELISA的灵敏度进行了评价。实施例6CA和SU-1的ELISA灵敏度实施例5的结果表明，T7-CA和T7-SU-1对兔抗-CA和小鼠抗-MLV血清具有很高的特异性。由于灵敏度是大量分析中一个很重要的因素，所以用ELISA评估抗原的灵敏度。将2倍系列稀释的血清样品加到包被了T7-CA和T7-SU-1的孔板中，这些蛋白在前面的实验中表现出良好的反应性，并且ELISA如实施例5所述进行操作。兔血清稀释到1∶640000的最终稀释度，而小鼠血清稀释到1∶2560的最终稀释度。最初的小鼠血清在人血清中进行10倍稀释，以模拟人暴露于MLV的情况。
抗原的灵敏度以S/CO值的形式如图7所示；T7-CA对兔抗CA的S/CO见图7a，T7-SU-1对小鼠抗MLV的S/CO见图7b，T7-CA和T7-SU-1对小鼠抗MLV的S/CO见图7c。
如图7a所示，T7-CA表现出高灵敏度，其与高到1∶640000稀释度的兔抗CA血清的S/CO仍大于3，而与正常兔血清的S/CO小于1(图7a)。T7-SU-1对正常小鼠血清是阴性的，但对小鼠抗MLV血清为阳性的，并且与高到1∶64稀释度的S/CO仍大于4(图7b)。T7-CA和T7-SU-1与高达1∶64稀释度和1∶256稀释度的小鼠抗MLV血清的S/CO分别大于3。当两种抗原混合时，与高达1∶256稀释度的S/CO仍大于2(图7c)。这些结果表明，CA和SU-1抗原具有足够水平的灵敏度和特异性，可以被用来通过检测接受基因治疗的病人血清中MLV抗体，来检测通过同源重组产生的RCR。
T7-SU-1的S/CO随稀释度的降低的速率比T7-CA慢。因此，即使T7-SU-1作为单独抗原，其也可以作为有效的抗原来检测抗MLV抗体的存在。实施例7应用蛋白芯片进行FLISA在应用本发明的抗原进行RCR检测时，如使用由自动微阵列布放系统产生的蛋白芯片，则可在短时间内对大量的样品进行分析。为了考察用这种蛋白芯片进行RCR检测的可行性，本发明人用GMS 417ArrayerTM(Genetic MicroSystems，美国)将纯化的抗原固定在载玻片上制成蛋白芯片，并通过FLISA评估其反应性。
T7-CA，T7-TM和T7-SU-1以浓度100微克/毫升加到96孔板上，将板放在微阵列布放系统中。将10皮升的每种抗原点到一个2.5×7.5厘米的显微镜栽玻片(Sigma，美国)上，包括4组，每组由400个点组成。用4个针孔和环以一种排列模式进行点样，所用的玻片用氨基烷基硅烷进行包被。
将包含样点的栽玻片在室温下放置40分钟，然后将栽玻片浸入到100％的乙醇中对包被的抗原进行固定。通过乙醇处理，抗原通过其氨基基团与包被在栽玻片上氨基烷基硅烷的烷基基团结合而被固定，然后将栽玻片进行彻底干燥。
用实施例5所述的每种抗原制得的蛋白芯片进行ELISA。在实验中使用了兔抗CA血清，小鼠抗MLV血清和正常小鼠血清。单独的抗体与每个芯片进行反应，并且点在封口膜(parafilm)上的抗体紧密附着在该栽玻片的表面，以一致性地应用抗体。抗原-抗体反应后，用高速荧光扫描仪GMS 418 Array Scanner(Genetic MicroSystems，GM200)检测荧光，该荧光是由荧光相连的抗-兔或抗-小鼠IgG抗体产生的。栽玻片的表面用飞点显微镜在532nm进行读数，得到的数据用ImageneTM(Genetic MicroSystems，2.0版本)分析该表达的数据的软件进行分析(见图8)。
图8a所示的为使用兔抗CA血清的结果，而图8b和c为使用小鼠抗MLV血清和正常血清的结果。T7-CA与兔抗-CA血清和小鼠-抗MLV均强烈反应。另一方面，T7-TM不与兔抗CA血清反应，而与小鼠抗MLV血清反应。但T7-TM与兔血清的反应性低于T7-CA的。T7-SU-1与兔抗CA血清显示阴性反应，而与小鼠抗MLV血清有强烈的阳性反应。这些结果与实施例5和实施例6中的ELISA结果是一致的。T7-CA，T7-TM和T7-SU-1不与正常的小鼠血清反应。以上结果清楚地表明本发明的CA和SU-1抗原既具有高灵敏度，也具有高度的特异性。
序列表<110>金善荣<120>一种检测接受基因治疗的受治者血清中有复制能力的病毒的方法<130>OPF0068/PCT<150>KR99-50510<151>1999-11-15<160>14<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>768<212>DNA<213>鼠白血病病毒<220><221>CDS<222>(1)..(768)<223>编码部分的Gag蛋白的DNA，p30(CA)<400>1gga aac gga cag ctt caa tac tgg ccg ttc tcc tct tct gac ctt tac 48Gly Asn Gly Gln Leu Gln Tyr Trp Pro Phe Ser Ser Ser Asp Leu Tyr15 1015aac tgg aaa aat aat aac cct tct ttt tct gaa gat cca ggt aaa ctg 96Asn Trp Lys Asn Asn Asn Pro Ser Phe Ser Glu Asp Pro Gly Lys Leu2025 30aca gct ctg atc gag tct gtt ctc atc acc cat cag ccc acc tgg gac 144Thr Ala Leu Ile Glu Ser Val Leu Ile Thr His Gln Pro Thr Trp Asp3540 45gac tgt cag cag ctg ttg ggg act ctg ctg acc gga gaa gaa aaa caa 192Asp Cys Gln Gln Leu Leu Gly Thr Leu Leu Thr Gly Glu Glu Lys Gln505560cgg gtg ctc tta gag gct aga aag gcg gtg cgg ggc gat gat ggg cgc 240Arg Val Leu Leu Glu Ala Arg Lys Ala Val Arg Gly Asp Asp Gly Arg65 70 7580ccc act caa ctg ccc aat gaa gtc gat gcc gct ttt ccc ctc gag cgc 288Pro Thr Gln Leu Pro Asn Glu Val Asp Ala 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1.一种检测接受使用病毒载体的基因治疗的受治者中有复制能力的病毒的方法，该方法包括受治者的血清与一种抗原蛋白进行反应，该蛋白是由不存在于病毒载体上，而存在于该病毒载体所来源的病毒基因组中的基因所编码的；并在受治者的血清中检测抗体蛋白。
2.权利要求1的方法，其中的病毒载体来源于逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒或慢病毒。
3.权利要求2的方法，其中的逆转录病毒是鼠白血病病毒。
4.权利要求1的方法，其中的抗原蛋白是鼠白血病病毒的Gag或Env蛋白的部分。
5.权利要求4的方法，其中的鼠白血病病毒的Gag蛋白的部分具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.权利要求4的方法，其中的鼠白血病病毒的Env蛋白的部分具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
7.权利要求1的方法，其中的抗原蛋白呈与麦芽糖结合蛋白或由11个氨基酸残基构成的T7标记的融合蛋白形式。
8.权利要求1的方法，其中的抗原检测步骤是由选自酶联免疫吸附测定，Western印迹和荧光联免疫吸附的方法进行的。
9.权利要求1的方法，在反应步骤前进一步包括用自动微阵列布放系统将抗原固定在蛋白芯片上。
10.一种用来检测接受使用病毒载体的基因治疗的受治者中有复制能力的病毒的诊断试剂盒，它包括一种抗原蛋白，该蛋白是由不存在于病毒载体上，而存在于该病毒载体所来源的病毒的基因组中的基因所编码的。
11.权利要求10的诊断试剂盒，其中的病毒载体来源于逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒或慢病毒。
12.权利要求10的诊断试剂盒，其中的抗原蛋白是鼠白血病病毒的Gag或Env蛋白的部分。
13.权利要求12的诊断试剂盒，其中的鼠白血病病毒的Gag蛋白的部分具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.权利要求12的诊断试剂盒，其中的鼠白血病病毒的Env蛋白的部分具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
15.权利要求10的诊断试剂盒，其中的抗原蛋白固定在蛋白芯片的微基片上。
16.一种表达载体，该载体包含编码用于检测有复制能力的病毒的抗原蛋白的SEQ ID NO1的核苷酸序列(KCCM-10173)。
17.一种表达载体，该载体包含编码用于检测有复制能力的病毒的抗原蛋白的SEQ ID NO5的核苷酸序列(KCCM-10224)。
全文摘要
本发明提供一种检测接受基因治疗的受治者血清中是否存在有复制能力的病毒的方法，该方法包括用特异性抗原检测血清中的抗逆转录病毒的抗体的步骤。该抗原的基因不存在于用于基因治疗的病毒载体中，而仅存在于该病毒载体来源的病毒基因组中，并且该抗原优选地选自鼠白血病病毒的部分的Gag和部分的Env蛋白。同时还提供了其氨基酸序列包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO6的序列的抗原，由于其特异性和灵敏度，它们在基于免疫反应的RCR检测中用处很大。
文档编号G01N33/53GK1411513SQ00817358
公开日2003年4月16日 申请日期2000年11月15日 优先权日1999年11月15日
发明者金善荣, 朴银珍, 罗英顺, 柳承信 申请人:迪吉株式会社