专利名称：联合定量检测血清中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α在肝癌早期预警中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝癌早期病变预警诊断的新标记物和方法，还涉及用于肝癌早期预警诊断的试剂盒。
背景技术：
原发性肝癌是我国发生率最高的恶性肿瘤之一，每年死于肝癌人数约占全世界肝癌死亡人数的50%，给患者家庭及国家造成了沉重的经济负担。在我国，慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染是肝癌的主要病因，表现为血清HBV表面抗原持续阳性。根据2006年的流行病学调查结果显示，目前我国1-59岁居民中HBV表面抗原的阳性率高达7. 18%，约计有HBV 表面抗原携带者9300万人。肝癌进展较快，对化疗不敏感，且术后复发转移率高，导致肝癌患者死亡率居多种恶性肿瘤的首位。流行病学调查显示，在慢性HBV表面抗原携带者中，每年有的人群自然进展为肝癌，终身肝癌的发生率累计约有40%。因此，除通过接种疫苗的方式降低HBV感染率外，对于已经成为慢性HBV携带者的高危人群来说，通过早期的预警诊断，发现早期癌前病变特征，对于提高肝癌的早期预警诊断水平和生存率具有重要意义。目前，肝癌筛查的常用方法是对肝癌高危人群(男性，35岁以上，女性40岁以上， 慢性HBV表面抗原携带者，有肝癌家族史)定期进行血清甲胎蛋白(AFP)含量测定和B超检查。在肝癌早期，AFP的敏感性较差，而B超则较为依赖操作者的经验，且往往在肝癌发生之后才被发现。目前还有其他一些血清标志物如磷脂酰基醇蛋白聚糖_3(GPC3)，AFP异质体 (AFP-L3)等正在进行一些临床前研究以用于肝癌早期预警诊断。GPC3具有明确的细胞学诊断价值，但血清学检测灵敏性不高，AFP-L3的敏感性也不高。因此建立有效便捷的方法， 特别是血清学检测方法，用于对慢性HBV表面抗原携带者进行肝癌的早期预警诊断非常必要。慢性HBV感染进展为肝癌是一个漫长的过程，可长达40-50年，是机体与病毒长期相互作用的结果。目前尚缺乏HBV直接致癌机制的直接证据。肝脏的慢性炎症是肝癌发展过程中的重要阶段，尽管HBV的高复制与肝癌发生密切相关，但HBV本身并不能直接导致肝细胞损伤。然而，机体针对慢性HBV感染产生持续免疫应答，通过慢性炎症反应可导致肝细胞的损伤。近年来研究发现，炎性细胞因子在由慢性HBV感染进展为肝癌病程进展中发挥着重要作用。白细胞介素1 β (IL-Ιβ)与白细胞介素Ια (IL-Ia)属于同一家族，主要以前体蛋白的形式由活化的巨噬细胞产生，随后被半胱氨酸蛋白酶-I(Caspase-I)切割为有活性的形式。IL-I β是炎性反应的重要调节因子，参与细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞活动，最近的研究发现IL-I β可能参与促进调节性T细胞向产生IL-17的细胞方向转化 (Boraschi et al. ,1996 ；Zouand Restifo，2010)。白细胞介素6 (IL-6)在炎症反应和B细胞的成熟过程中发挥作用。IL_6通过与其受体的结合，激活NF-κ B等信号途径，在促生长和抗凋亡过程中发挥重要作用。此外IL-6
4还与多种肿瘤的发生与预后密切相关(KishimotO，2010)。白细胞介素IO(IL-IO)是一种公认的介导免疫抑制的细胞因子，以同源二聚体形式发挥效应，可抑制Thl细胞应答及其细胞因子合成，促进B细胞增殖分化及抗体产生。在免疫调节和炎症反应中具有多效性，参与调节NF- κ B和JAK-STAT信号途径，可能抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生。(Hedrich and Bream, 2010)白细胞介素17(IL-17)是由活化的TH17细胞所产生的重要促炎因子，可以调节 NF- κ B和MAPK信号途径的活化，并诱导IL-6和C0X-2的表达。高水平的IL-17与多种自身免疫性疾病相关。IL-17在肿瘤发生发展过程中发挥双刃剑的作用。一方面，IL-17可以通过促进血管生成和肿瘤细胞的迁移促进肿瘤的生长。另一方面，IL-17亦可促进细胞毒性T细胞的免疫应答抑制肿瘤的生长(Pappu et al.，2010 ；Qian et al.，2010)。白细胞介素23(IL-23)是由p40和pl9两个亚基组成的异源二聚体，主要由活化的巨噬细胞和树突状细胞产生，可促进T细胞的增殖，其受体广泛表达于活化T细胞、记忆性T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。IL-23作用于这些细胞，在炎症性疾病、自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用(Martin-Orozco and Dong, 2009 ；D' Elioset al. ,2010)。另外一种重要的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF- α )同样主要由巨噬细胞产生，通过与其受体结合参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程，在多种疾病包括自身免疫病和肿瘤中扮演重要角色(Sethi et al.，2008)。然而这些物质在肝癌发生中的作用，及其对于肝癌的诊断和预警的价值尚无文献报道。发明概述在一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少2种因子的水平，其中检测样品中因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述方法检测得自所述对象的生物学样品中IL-17和IL-23 的水平，其中检测样品中IL-17和IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述方法检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、IL-23以及选自IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α中的另一种因子的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述方法包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23以及选自IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α中的另两种因子的水平。在一个实施方案中，所述方法包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23以及选自IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α中的另三种因子的水平。在一个实施方案中，所述方法包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23.IL-1 β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品或其衍生物如血清或血浆。在一个实施方案中，所述方法检测所述样品中所述因子的蛋白水平。
在一个实施方案中，所述方法通过使用所述因子的特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中所述因子的蛋白水平。在一个实施方案中，检测样品中所述因子水平升高是指检测样品中所述因子水平与对照样品例如未患肝癌的慢性乙肝感染者或者正常人样品中所述因子水平相比是升高的。在一个实施方案中，检测样品中所述因子水平升高是检测样品中所述因子蛋白水平分别高于如下各自的截断值IL-li3 :28pg/ml ；IL-6 :12pg/ml ；IL-IO :1.5pg/ml ； IL-17 :2.5pg/ml ； IL-23 :855pg/ml ；TNF- α :12.5pg/ml。在另一个方面，本发明提供了一种用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-Ιβ、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少两种因子的水平例如检测IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少两种因子的蛋白水平的物质。在另一个方面，本发明提供了检测IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, IL-23 和 TNF-α 中至少两种因子的物质在制备用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人发生肝癌倾向的组合物中的应用。在另一个方面，本发明提供了用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23禾口 TNF-α中至少两种因子的水平例如检测 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23和TNF-α中至少两种因子的蛋白水平的物质。附图简述
图1 人系列血样中人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)的含量。从纳入研究的人群中选取5例，分别取得每例病人获取自不同时间点且置于合适存储条件(-80摄氏度)下存储时间不同(每例病人的两份血清存储时间间隔为36-108个月)的两份血清，检测血清中于肝功能无关的人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)，从而评估在合适存储条件下所检测细胞因子的稳定性。图2 通过受试者操作特征曲线(ROC)分析评估最后一次随访时血清中IL-I β、 IL-6、IL-10、IL-17、11^-23或1顺-0含量对预测肝细胞癌(HCC)的作用。其曲线下面积分别为 IL-I β 0. 72(95% CI 0. 63-0. 81)、IL_60. 65(95% CI 0. 55-0. 75)、IL_100. 64(95% CI 0. 54-0. 72)、IL-170. 71 (95 % CIO. 61-0. 80)、IL-230. 65 (95 % CI 0. 56-0. 74), TNF- α 0. 69 (95 % CI 0. 60-0. 79)。发明详细描述除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的 Current Protocols in Immunology. Wiley & Sons,Hoboken,NJ所述。本文弓I用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部援引加入本文。本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法。
本发明人发现在采用现行临床常规方法诊断为肝癌1-7年之前，由慢性HBV感染进展为肝癌的患者血清中，其炎性细胞因子表达谱与保持慢性HBV感染者相比明显不同。 并且在肝癌病程进展的不同阶段，其炎性细胞因子表达谱存在着规律性的动态变化。在临床诊断为肝癌的7年或7年前，其血清中IL-23的含量显著升高，在进展为肝癌的1-6年前，除IL-23外，其血清中IL-li3、IL-6、IL-10、IL-17*TNF-a五种炎性细胞因子含量也显著升高。这5种细胞因子主要是由目前研究证实为Thl7的细胞所产生，而IL-23则是促进Thl7分化产生的主要因子，并且具有稳定Thl7的作用。因此，本发明人选择对IL-I β、 IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-a六种细胞因子进行联合检测，利用上述队列，进行了肝癌的早期预警诊断的分析。本发明人采用酶联免疫布阵法(ELISAArray)检测上述这六种细胞因子并采用不同的细胞因子组合通过对队列人群的系列样品进行分析。结果表明，它们可以作为肝癌发生的一个早期预警诊断指标，对慢性HBV感染者病程进展结局具有较好的指示作用。这六种细胞因子组合可作为由慢性HBV感染进展为原发性肝癌的癌前病变血清标志物。在一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少2种因子的水平，其中检测样品中因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。本文所述“肝炎病毒感染对象，，是指感染了任何类型肝炎病毒的个体。肝炎病毒包括甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等肝炎病毒。在本发明的一个实施方案中，所述肝炎病毒是乙型或丙型肝炎病毒。在进一步的实施方案中，所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒。本文所述“慢性乙型肝炎病毒感染对象”是指血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)持续阳性6个月以上即在间隔6个月以上的两次测定中HBsAg均保持阳性的患者。本文所述“肝癌”是指原发性肝细胞癌症。本文所用术语“癌症”通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡) 或细胞存活。本文所用术语“具有发生癌症倾向”是指任何处于癌前状态即正常细胞转化为肿瘤细胞过程中的中间状态的指征的细胞表型。换句话说，该术语是指发生癌症的风险的状态。最常见类型的肝癌是肝细胞癌(HCC)。本文所用术语“肝细胞癌”是指原发的肝脏恶性肿瘤。大多数HCC继发于慢性肝炎病毒感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。肝细胞癌与任何其它癌症一样，当存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的分子机制突变时而发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性感染通过导致机体自身免疫系统反复攻击自身肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而可助于肝细胞癌的发生。在本文上下文中，所述生物学样品是血液样品或其衍生物如血清或血浆。本发明中的生物学样品可以是人或非人类来源的。然而，本发明典型地用人类生物学样品进行。本文所述生物学样品是来自被测对象的任意生物学样品，尤其是包括核酸或者多肽的任意样品。有利地，可以包括下列样品血液，血清，血浆，血小板，唾液，痰，尿液等等，更一般来说包括核酸或者多肽的任意组织、器官或者有利地生物体液。另外，生物学样品可含有衍生自细胞例如肝细胞的细胞提取物或包括其的细胞群。在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，例如以保护核酸或蛋白质的方式收集。在一个实例中，所述样品是源自血液的样品，如血液、血清或者血浆的样品。可以通过任意已知技术如通过采血、通过非侵入性技术从样品采集点或者库等等获取样品。还可以预处理所述样品以增加靶分子的可接近性，如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶标记等等)。在一个实例中，所述生物学样品是全血样品，即还没有经过分离步骤的血液，其任选可以被稀释。在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中 IL-17和IL-23的水平，其中检测样品中IL-17和IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述样品中IL-17和IL-23的水平通过检测IL-17和 IL-23蛋白的水平来确定，例如使用分别针对IL-17和IL-23的特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中IL-17和IL-23蛋白的水平。人IL-17蛋白序列如SEQ ID NO 1所示，人IL-23蛋白由pl9和p40两个亚基组成，其中pl9(SEQ ID NO 2 )为特有亚基，而p40 (SEQ IDNO 3)为与同源物共享的亚基。因此，在一个实施方案中，所述检测IL-23蛋白的水平可以通过检测pl9亚基或其变体或同源物的水平来进行，其中检测样品中所述P19亚基或其变体或同源物的水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述检测IL-17蛋白的水平可以通过检测 IL-17变体或同源物的水平来进行，其中检测样品中所述IL-17变体或同源物的水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在另一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23 以及选自 IL-I β (SEQ ID NO :4)、IL-6 (SEQ ID NO :5)、IL-IO (SEQ ID NO :6)和 TNF-α (SEQ ID NO :7)中的至少另一种因子的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-I β。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-6。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-10。在一个实施方案中，所述另一种因子是TNF-α。在另一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23以及选自IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α中的至少另两种因子的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-I β和IL-6。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-I β和IL-10。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-I β和TNF-α。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-6和IL-10。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-6和TNF-α。在一个实施方案中，所述另两种因子是IL-10和TNF-a。在另一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、
8IL-23以及选自IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α中的至少另三种因子的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述另三种因子是IL-I β、IL-6和IL-IO0在一个实施方案中，所述另三种因子是IL-1 β、IL-10和 TNF-α。在一个实施方案中，所述另三种因子是IL-I β、IL-6和TNF-a。在一个实施方案中，所述另三种因子是IL-6、IL-10和TNF-a。在另一个方面，本发明提供了一种鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括检测得自所述对象的生物学样品中IL-17、 IL-23.IL-1 β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平，其中检测样品中所述因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。本文中，所述因子的水平可以通过检测该因子的变体或同源物的水平来进行，其中检测样品中所述因子的变体或同源物的水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
本文中，蛋白的变体或同源物是指包含与所示氨基酸序列具有至少50 %、60 %、 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或者更高的相同性的氨基酸序列的多肽。两个蛋白质序列的相同性对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算相同性百分比，该算法可在NCBI网站(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)获得。在本文中，所述变体或同源物优选是功能性变体或同源物，即其与所示氨基酸序列具有显著的相似性(例如在氨基酸水平大约50%序列相同性)并且具有相同或相似的功能。至少大约60%，至少大约70%，至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%序列相同性的功能性变体或同源物是优选的功能性变体或同源物。用于检测IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, IL-23或TNF-α蛋白或其变体或同源物的物质可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰 (RNAi)、反义RNA、重组蛋白质、抗体、或者其缀合物或融合蛋白。关于RNAi，可见Mi Ihavet 0, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003Dec ；55 (4) :629-48. Review.)，关于反义 RNA，可见 Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 20030ct 28 ；2003 (206) :pe47)。例如，为了确定对象中IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, 11^_23或1咿-0蛋白或其变体或同源物的水平，本发明的方法可以使用结合IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23或 TNF-α蛋白的物质测定来自所述对象的生物学样品中IL-I β、IL-6, IL-10, IL-17、IL-23 或TNF-α蛋白或其变体或同源物的水平(浓度或绝对量)，在对象的所述生物学样品中 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23或TNF-α蛋白或其变体或同源物水平升高指示所述对象存在肝癌患病风险。本文所述物质可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述物质是配体或抗体(或其抗原结合片段)。可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示或者分析样品中的IL-I β、IL-6、 IL-10、IL-17、IL-23或TNF-α蛋白或其变体或同源物，尤其是例如利用特异性配体，抗体或者片段或者抗体衍生物。优选所述物质是所述蛋白的特异性抗体或者这类抗体的片段 (如Fab，Fab'，⑶R等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体，ScFv)。通过检测靶和所述物质的复合物如利用标记的物质、利用第二种标记的检测物质等等可以检测样品中靶蛋白的存在或者量。可以使用公知的免疫技术包括ELISA，RIA等等。可以通过常规技术尤其是利用包括所述蛋白(或者其免疫原性片段)的免疫原免疫非人动物并回收抗体(多克隆)或者生成细胞(以产生单克隆抗体)产生靶蛋白的特异性抗体。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述Harlow et al. ,Antibodies :A Laboratory Manual,CSH Press, 1988 ； Ward et al.，Nature 341(1989)544 ；Bird et al.，Science 242(1988)423 ；W094/02602 ； US5, 223，409 ；US5, 877，293 ；W093/01288。本文所述“抗体”、“抗原结合片段”或“免疫原性部分”均具有本领域技术人员通常已知的含义。例如抗体的“抗原结合片段”是指通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生的，包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv和单链抗体(svFc)。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物。抗体标记可以是放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素基团标记。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow，Ε. and Lane, D. , Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1999。本领域已知许多针对IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23 (例如针对pl9亚基)或 TNF-α蛋白或其变体或同源物的特异性抗体，例如针对IL-I β的抗体Anti-Human IL-beta Monoclonal antibody, Clone B-A 15 (eBioscience)Anti-Human IL-beta Monoclonal antibody, Clone H 1B-27(Biolegend)Anti-Human IL-beta Monoclonal antibody, Clone H 1B-98 (Biolegend)针对IL-6的抗体Anti-Human IL_6Monoclonal antibody, Clone MQ2-13A5(eBioscience)Anti-Human IL_6Monoclonal antibody, Clone MQ2-39C3(eBioscience)Anti-Human IL-6Monoclonal antibody, Clone MQ2-39C3(Biolegend)针对IL-IO的抗体Anti-Human IL-10Monoclonal antibody, Clone JES3-9D7(eBioscience)Anti-Human IL-lOMonoclonal antibody, Clone BT-10(eBioscience)Anti-Human IL-10Monoclonal antibody, Clone JES3-12G8(Biolegend)针对IL-17的抗体Anti-Human IL-17A Monoclonal antibody, Clone eBio64CAP 17 (eBioscience)Anti-Human IL-17A Functional Grade Purified, eBio64CAP 17 (eBioscience)Anti-Human IL-17A Monoclonal antibody, Clone BL23 (Biolegend)针对IL-23特异亚基ρ 19抗体Anti-Human IL-23(pl9)Monoclonal antibody, Clone hlt2736 (Biolegend)Anti-Human IL_23pl9，Clone eBio473P 19 (eBioscience)Anti-Human IL_23pl9Functional Grade Purified, Clone HNU2319(eBioscience)针对TNF-α的抗体
Anti-Human TNF-α Monoclonal antibody, Clone TNF-D (eBioscience)Anti-Human TNF-α Monoclonal antibody, MAb 11 (Biolegend)Anti-Human TNF-α Monoclonal antibody, MAb I(Biolegend)0本领域已知很多测定本发明所述因子的方法，包括例如ELISA、布阵法等，还可以利用质谱分析等相关领域的技术人员已知的技术检测蛋白质表达和/或结构的变化，这类技术一般来说被分到蛋白质组分析名下，以便检测患者血液中的特异性特征序列。本领域提供了许多用于测定因子水平的可商购试剂盒，例如Quansys (Quansys Biosciences, Logan, Utah)的 Human9_plex 分析试剂盒和 R&D (R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN)的 MosaicTMELISA检测试剂盒。本文所述“水平升高”是指通过检测上述生物学样品获得的值与参照值例如在未患肝癌的肝炎病毒例如慢性HBV感染者或者正常人中观察到的中间值或者平均值、或者与基于实验证据和/或现有技术数据所得到的针对肝炎病毒例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的截断值相比是升高的。在一个实施方案中，所述检测样品中因子水平升高是检测样品中因子水平与对照样品中因子水平相比是升高的。本文所用术语“对照样品”典型地是指来自具有慢性乙型肝炎病毒感染但无肝癌病变特征的对象或者正常人的生物学样品。靶的水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Current Protocols in Immunology. Wiley & Sons,Hoboken,NJ ； Current Protocols in Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ)。石角定可以在蛋白质水平进行，例如使用酶联免疫分析或Western印迹方法进行蛋白水平检测。所获得的一或多种待测样品和一或多种对照样品的水平之间的差异可以归一化至进一步的对照蛋白例如管家基因蛋白的水平，管家基因蛋白的水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因蛋白包括肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl等。但是，代替在任何实验中确定一或多种对照样品的水平，也可以基于实验证据和/ 或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在本文中，截断值是指ROC曲线各点中约登指数(敏感性+特异性-1)最大的点。因此，在一个实施方案中，所述检测样品中IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23或 TNF-α水平升高是检测样品中IL-I β、IL-6, IL-10, IL-17, IL-23或TNF-α蛋白水平高于截断值。在本发明一个的实施方案中，各个因子水平的截断值分别为IL-I β :28pg/ml ； IL-6 :12pg/ml ； IL-IO :1.5pg/ml ； IL-17 :2.5pg/ml ； IL-23 :855pg/ml ；TNF- α :12.5pg/ml。在本发明中，术语“鉴定具有发生肝细胞癌症的倾向，，也包括预测和可能性分析 (“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性或预防性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病或者具有患有该疾病的风险。在另一个方面，本发明提供了一种用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-13、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23*TNF-a中至少两种因子的水平例如检测IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α蛋白中至少两种蛋白的水平的物质。在一个实施方案中，所述至少两种因子是IL-17和IL-23。在一个实施方案中， 所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和 TNF-α中至少3、4或5种因子的水平的物质。在一个实施方案中，所述组合物包含检测 IL-17、IL-23以及选自IL-I β、IL_6、IL-10和TNF-α中的至少另一种因子的水平的物质。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-I β。在一个实施方案中，所述另一种因子是 IL-6。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-10。在一个实施方案中，所述另一种因子是 TNF- α。在一个实施方案中，所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、 IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α的水平的物质。在一个实施方案中，所述物质是针对 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23或TNF-α蛋白的特异性配体或特异性抗体，例如单克隆或多克隆抗体。在另一个方面，本发明提供了用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23和TNF- α水平中至少2、3、4或5种因子例如检测IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23和TNF- α蛋白中至少2、3、4或5种蛋白的水平的物质。在一个实施方案中，所述试剂盒包括用于检测IL-17和IL-23的水平的物质。在一个实施方案中，所述试剂盒包含检测IL-17、IL-23以及选自IL-Ιβ、IL-6、IL-10和TNF-α 中的至少另一种因子的水平的物质。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-I β。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-6。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-10。在一个实施方案中，所述另一种因子是TNF-α。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、 IL-6、IL-10、IL-17、IL-23 和 TNF- α 的水平的物质。在一个实施方案中，所述物质是IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, 11^_23或1顺-0蛋白的特异性配体或特异性抗体例如单克隆或多克隆抗体。在本文中，所述配体可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实施方案中，所述物质是抗体(或其抗原结合片段)例如受体特异性抗体。在一个实施方案中，所述对象是人。在所述物质是抗体的实例中，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物，或者所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv和单链抗体(svFc) ο在另一个方面，本发明提供了检测IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, IL-23 和 TNF-α 中至少两种因子的物质在制备用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人发生肝癌倾向的组合物中的应用。在一个实施方案中，所述物质是针对所述因子的特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述鉴定是通过测定对象的生物学样品中所述至少两种因子的水平来进行的，其中检测样品中被检测的因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述至少2种因子是IL-17和IL-23。在一个实施方案中，本发明提供了检测IL-17、IL-23以及选自IL-I β、IL_6、 IL-10和TNF-α中的至少另一种因子的物质例如特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定对象发生肝癌倾向的组合物中的应用。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-I β。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-6。在一个实施方案中，所述另一种因子是IL-10。在一个实施方案中，所述另一种因子是TNF-α。在一个实施方案中，本发明提供了检测IL-I β、IL-6、IL-10, IL-17, IL-23和 TNF-α蛋白的物质例如特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人发生肝癌倾向的组合物中的应用，其中检测样品中被检测的因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品或其衍生物如血清或血浆。在一个实施方案中，所述方法检测所述生物学样品中所述因子的蛋白水平。在一个实施方案中，通过使用针对所述因子的特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段检测所述因子的蛋白水平。在一个实施方案中，检测样品中所述因子水平升高是检测样品中所述因子水平与未患肝癌的慢性乙肝感染者或者正常人样品中所述因子水平相比是升高的。在另一个实施方案中，检测样品中所述因子水平升高是检测样品中所述因子蛋白水平分别高于如下各自的截断值IL_li3 :28pg/ml ；IL-6 :12pg/ml ；IL-10 :1.5pg/ml ； IL-17 :2.5pg/ml ；IL-23 :855pg/ml ；TNF-α :12.5pg/ml。本发明所述方法、组合物和试剂盒可以高灵敏性和特异性，大规模、便捷、快速及便宜地筛查肝炎病毒感染人群中具有发生肝癌倾向的对象，从而为防治肝癌提供及时有效的有用信息。
实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实施例1:自1996年至1999年在江苏省启东市招募在2年内至少2次测试为HBV表面抗原阳性的慢性HBV感染的患者建立慢性HBV感染者随访队列，入组时的平均年龄为44岁， 丙型肝炎(HCV)病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染以及患有其他伴随性慢性肝病的患者被排除于本研究外，入组时B超检测有肝硬化或者肝细胞癌存在者也被排除在本研究分析中，队列人群未接受过正规的抗病毒治疗。研究方案获得中国医学科学院和启东肝癌防治研究所癌症研究所/医院伦理委员会(Ethics Committee of Cancer Institute/ Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Qidong Liver Cancer Institute) 批准(批准号#09-59/354)。
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进展为肝癌的所有患者根据2001年《中国抗癌协会肝癌专业委员会》所制定的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”进行了确诊，具有至少一个下列标准(a) AFP ^ 400 μ g/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并能触及肿大、坚硬及有大结节状肿块的肝脏或影像学检查有肝癌特征的占位性病变者；(b)AFP < 400 μ g/L能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(DCP、GGT II、AFU及CA19-9等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者。(c)有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。队列人群每隔12个月左右进行一次随访。每次随访期间，进行肝功能、AFP、HBV 表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)检测，同时进行B超检测，以期及早发现早期肝癌。 随访过程中保存的血清样品用于我们的进一步分析。截至到2009年6月，队列中共发现了 47例符合分析条件，具有系列血清样本保存的肝癌患者。按照年龄和性别相匹配的原则，以 1 3的比例从同一队列中选择仍然保持慢性HBV感染的对照141例，进行巢式病例对照研究，从入组开始到随访结束，每位病人选取3-4份血样，分别为入组时，随访进程中，和临床诊断为肝癌前，进行了细胞因子表达水平的测定。由于患者入组后在不同时间进展为肝癌， 因此，在随访进程中我们选择了 1-2份血样进行了分析，间隔期为2-3年。患者在获得疑似肝癌提示后，即B超发现肝脏中有可疑的占位性病变，通常到更高一级的医院进行确诊，为此，我们选择了确诊前最后一次血清进行了分析。实施例2 实验及统计方法使用 Quansys (Quansys Biosciences, Logan, Utah)的 Human 9-plex 分析试剂盒检测患者血清中炎性细胞因子水平，所述试剂盒含有下述9种细胞因子IL-lci、IL-I β、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-23、IFNy和TNFa。实验步骤根据生产商手册的指导进行， 该分析的检测范围如下IL-I a :0. 87_450pg/ml ；IL-I β :3. 24-1400pg/ml ；IL-6 :3. 81-475pg/ml ；IL-8 :0. 21-125pg/ml ；IL-10 :0. 22-190pg/ml ；IL-17 :1. 63-450pg/ml ；IL-23 :18.64_8000pg/ml ；TNFa :0. 73_350pg/ml ;IFNy :0. 25-100pg/ml。超出所述检测范围的细胞因子浓度由软件推测得到。每个样品重复检测两次，使用平均值进行数据分析。为了评估储存时间对细胞因子稳定性的影响，在同一人的系列血样中检测了与肝功能无关的人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)的含量(图1)。根据图1中所示结果，合适存储条件下，存储时间的长短对于ECP含量无显著影响(p = 0. 780)，因此所测定炎性细胞因子在合适存储条件下是稳定的。同时本领域文献报道，11^10、11^6、11^10 和TNF-α在合适的储存条件下是稳定的，而IL-17和IL-23则未见长时间储存条件下不稳定的报道，因此认为本实验所检测的炎性细胞因子在合适的储存条件(_80°C)下是稳定的。为了确定本方法的准确性，我们还采用了 eBioscience公司生产的单细胞因子(IL-23) 检测试剂盒进行了确认，两者之间的检测数值高度一致(表1)。所有统计学测试均采用SPSS 15. 0进行，非正态分布的连续变量以中位数和四分位数间距表示，Mann-Whitney U检验用于计算病例组和对照组之间连续变量差异的显著性，而Fisher确切概率法则用于比较分类变量之间的显著性差异。受试者特性曲线用于分析能够有效区分肝癌患者和对照患者的细胞因子截断值(曲线上约登指数最大的点)， 且其曲线下面积用于评估不同细胞因子的组合在肝癌预警诊断中的价值。所有P值均为双尾。当ρ <0.05时认为具有统计学显著性。实施例3:实验结果截至2009年6月，有47例符合上述分析条件的慢性HBV感染者进展为肝癌，按照 1 3的比例，在同一研究队列中，选择141例年龄和性别与之相匹配的，未被诊断为肝癌者作为对照，进行巢式病例对照研究分析。由慢性HBV感染发展为肝癌的患者，随访时间(以中位数(25% -75%分位数)表示)为108(84-132)个月，未被诊断为肝癌的慢性HBV感染组为144(132-144)个月(ρ < 0. 001)。肝癌组(由慢性HBV感染进展为肝癌的患者)和对照组(未被诊断为肝癌的保持慢性乙肝病毒感染状态的患者)之间的一些特征如下(表 2)。肝癌组和对照组入组时的中位年龄为均为44岁(ρ = 0. 828)。由于男性比女性更容易罹患肝癌，因此，在本研究中仅有3例女性患者。肝癌组中有四例(61.7%)患者具有饮酒习惯，而对照组中有83例(58. 9% )患者饮酒，他们具有相似的酒精摄入量(ρ = 0. 800)。 此外，两组之间吸烟状况和家族病史也无显著差异(表2)。经过初步筛查后，我们定量检测了血清中9种炎性细胞因子的含量，肝癌组和对照组细胞因子表达谱见表3。在入组基线(baseline)处，肝癌组患者外周血清中IL-23含量显著高于对照组，受试者特性曲线(R0C曲线)结果表明，基线处IL-23可作为一个肝癌发生的预警诊断指标，基于ROC曲线，选取曲线上约登指数最大的点(855pg/ml)作为截断值(cut off value)，患者出现高(等)于此截断值的情况表明其罹患肝癌的风险增加。随着病程的进展，包括IL-23在内的六种细胞因子在肝癌组患者血清中出现显著升高IL-I β (ρ < 0.001)，IL-6 (ρ < 0.001)，IL-10 (ρ = 0.006)，IL_17(p < 0.001)，IL-23 (ρ = 0. 001)和TNF α (ρ < 0.001)。在最后一次随访时，肝癌组中这六种细胞因子浓度分别为 IL-I β 29. 3(0. 9-38. 9)pg/ml，IL-62. 9(0. 0-19. 8)pg/ml， IL-103. 6(2. 0-12. 4)pg/ml, IL-174. 5(0. 0-6. 7)pg/ml, IL-23241. 8 (0. 0-1557. 0)pg/ml 和TNFa 13.9(5. 0-30. 2)pg/ml。均显著高于对照组。同样，采用受试者特性曲线(R0C曲线)对这六种细胞因子在最后一次随访时作为肝癌预警诊断指标的效用进行了分析，分析结果显示在最后一次随访时，六种细胞因子中的任何一个单独均可作为肝癌发生的预警诊断指标(图2)，ROC曲线下面积(AUC)用于衡量其作为预警诊断指标的价值，IL-IiiAUC =0. 720 (95 % CI 0. 629-0. 810p < 0.001)，IL-6AUC = 0. 649 (95 % CI 0. 550-0. 747p = 0. 001)，IL-10AUC = 0. 635 (95% CI 0. 544-0. 727p = 0. 006)，IL-17AUC = 0. 707 (95% CI 0. 611-0. 804p < 0. 001)，IL-23AUC = 0. 650(95% CI 0. 556-0. 744p = 0. 002)，TNF-a AUC =0. 692(95% CI 0.598-0. 785p < 0.001)，对除IL-23外的五种细胞因子，同样根据选取 ROC曲线上约登指数最大的点作为截断值用于预警诊断，分别为IL-Ιβ :28pg/ml, IL-6 12pg/ml, IL-10 :1.5pg/ml, IL-17 :2.5pg/ml,TNF-a :12.5pg/ml。
为了分析这些细胞因子在肝癌进展中的预警诊断价值，按照血清收集时间距随访结束(临床诊断为肝癌)的间隔，将肝癌组和对照组患者多份血样分为三个时间段临床肝癌诊断前1-3年(12-36月)、临床肝癌诊断前4-6年(37-72月)和临床肝癌诊断前7年及以上(73-156月)，对不同时间段，各炎性细胞因子基于所选择截断值在肝癌预警诊断中的价值进行了分析(表4)，从表4中可以得知，肝癌发生73-156月前，血清中IL-23含量的升高可作为肝癌进展的预警诊断指标，在所选择截断值处其ROC曲线下面积达到了 0. 76(95% CI 0. 66-0. 859p < 0. 001)。随着病程的进展，IL-1 β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23 和 TNF-α 六种细胞因子均呈现出一定的预警诊断价值，IL-17在所选择截断值处具有较高预警诊断价值，在临床肝癌诊断37-72月前其曲线下面积达到0. 65(95% CI 0. 55-0. 75ρ < 0. 001)； 在临床肝癌诊断12-36月前，其曲线下面积达到0. 70(95% CIO. 61-0. 80ρ < 0. 001)，针对敏感性和特异性的分析结果也显示，在临床诊断为肝癌的不同阶段，IL-17和IL-23可以获得较好的敏感性和特异性。为了在大规模的人群筛查中获得更好的敏感性，尽可能早的发现慢性HBV感染者中的早期肝癌患者，有必要联合检测其中的两个或者多个指标以获得更好的效果。基于之前单因子的分析结果，在临床诊断为肝癌之前的不同阶段，IL-23和IL-17具有较其他因子较好的预警诊断价值，同时由于IL-23/IL-17信号在调控机体免疫反应中的重要作用，选择将IL-23和IL-17作为核心，在此基础上增加其他细胞因子，分析所选择细胞因子组合在慢性HBV感染者进展为肝癌病程中的预警诊断价值。在将IL-23和IL-17作为核心进行分析时，根据前述ROC曲线所确定的截断值， 将两者进行并联，即具有慢性HBV感染的患者血清中出现IL-23或IL-17高于截断值时， 即认为该患者进展为肝癌的风险较高。在临床诊断为肝癌前的不同阶段，对两者并联后对慢性HBV感染者进展为肝癌的预警诊断价值及敏感性和特异性进行了分析，如表5所示， 将IL-23与IL-17并联后，与单独应用前述六个细胞因子中的任意一个相比，其敏感性显著升高，在距临床诊断为肝癌前73-156月，37-72月和12-36月分别达到76. 31 %、68. 29% 和73. 91%，且特异性仍然保持在较高水平，距临床诊断前73-156月，37-72月和12-36月分别为56. 80%,75. 38%和63. 83%。ROC曲线下面积在三个时间段分别为0. 67(95% CI 0. 57-0. 76)、0· 72(95% CI0. 63-0. 81)和 0. 69(95% CI 0. 60-0. 78)，三个时间段之间并无显著性差异，以上统计结果显示联合应用IL-23和IL-17能够有效的对慢性HBV感染者罹患肝癌的风险进行预警诊断。在联合应用IL-23和IL-17的基础上，对以IL-23和IL-17为核心，同时联合应用其他一种或多种炎性细胞因子的组合在慢性HBV感染者进展为肝癌病程中的预警诊断作用进行了研究。在以IL-23和IL-17为核心，同时联合应用另一种炎性细胞因子的情况下(表 6)，临床诊断为肝癌前12-36月，作为核心的IL-23和IL-17与IL-I β、IL_6、IL-10或 TNF- α联合应用后，敏感性得到进一步提高，分别为78. 26%,69. 64%,95. 65%,86. 96%, ROC 曲线下面积分别为 0. 68(95% CI 0. 59-0. 77)、0· 72(95% CI 0. 63-0. 80)、0· 66(95% CI 0. 57-0. 75),0. 70(95% CI 0. 61-0. 79)，在有效提高敏感性的同时，保持了较高的预警诊断价值，尤其是与IL-10联合后，敏感性达到了 95. 65 %。临床诊断为肝癌前37-72月， 作为核心的IL-23和IL-17与IL-I β、IL-6, IL-10或TNF-α联合应用后，敏感性分别为
1670. 73%,78. 05%,95. 12%和 75. 61%, ROC 曲线下面积分别为 0. 70(95% CI 0. 61-0. 80)、 0. 74(95% CI 0. 65-0. 82),0.71(95% CI 0. 64-0. 79) ,0. 69(95% CI 0. 60-0· 78)，同临床诊断为肝癌前12-36月相同，在IL-23和IL-17为核心的基础上，联合检测其余四个细胞因子中的任何一个，都在有效提高敏感性的同时，保持了较高的预警诊断价值。临床诊断为肝癌前73-156月，联合检测IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α的敏感性达到76. 31 %、84. 21 %、 97. 37%,81. 58%，但是ROC 曲线下面积较低，分别为 0. 61(95% CI 0. 52-0. 71) ,0. 65(95% CI0. 56-0. 74)、0· 55 (95% CI 0. 45-0. 65)、0· 60 (95% CI 0. 50-0. 69)。在以IL-23和IL-17为核心，同时联合应用其他两种炎性细胞因子的情况下 (表7)，临床诊断为肝癌前12-36月，作为核心的IL-23和IL-17与其余四种炎性细胞因子中的任意两种联合应用，均可对慢性HBV感染向肝癌的进展作出有效的预警诊断，其中与IL-I β +IL-10或IL-6+IL-10的联合应用可以达到最大的敏感性97. 83%，同时保持良好的诊断价值(R0C曲线下面积均为0.67(95% CI 0. 58-0. 76))，而与IL-I β+TNF-α或 IL-6+TNF- α的组合联合时，可以获得更好的诊断价值(R0C曲线下面积均为0. 71 (95 % CIO. 63-0. 80))；临床诊断为肝癌前37-72月，IL-23和IL-17为核心，同时联合检测其余四种细胞因子中的任意两种同样可以有效对慢性HBV感染向肝癌的进展作出预警诊断，其中与IL-I β +IL-10和IL-6+IL-10的联合应用可以达到最大的敏感性95. 12%，同时保持良好的诊断价值(R0C曲线下面积均为0. 71 (95% CI 0. 62-0. 80))，而与IL-1 β +IL-6的组合联合应用时可以获得最好的诊断价值，(R0C曲线下面积为0.73(95% CI 0. 64-0. 82))；临床诊断为肝癌前 73-156 月，IL-23 和 IL-17 与 IL-1 β +IL_6、IL_1 β +TNF_a、IL-6+TNF-a 的组合联合应用时，均可对慢性HBV感染向肝癌的进展作出有效预警诊断。在以IL-23和IL-17为核心，同时联合应用其他三种炎性细胞因子的情况下(表 8)，临床诊断为肝癌前12-36月，作为核心的IL-23和IL-17与其余四种炎性细胞因子中的任意三种联合应用，在有效对慢性HBV感染向肝癌进展进行预警诊断的同时，敏感性根据细胞因子组合的不同可以达到91. 30%和100%，其中与IL-I β+IL-6+TNF-α三细胞因子的组合联合应用在达到91. 30%的敏感性时，仍然保持较好的诊断价值(R0C曲线下面积为0.71(95% CI 0. 63-0. 80))；临床诊断为肝癌前37-72月，作为核心的IL-23和IL-17 与其余四种炎性细胞因子中的任意三种组合联合应用都可以获得较好的诊断价值(R0C曲线下面积保持在0. 70以上)，而且敏感性根据细胞因子组合的不同可以达到80. 49%和 95. 12% ；在临床诊断为肝癌前73-156月，将IL-23和IL-17作为核心，与其余四种炎性细胞因子中的任意三种联合应用时，敏感性得以提升。在联合检测包括IL-23和IL-17为核心的六种炎性细胞因子的情况下，分析结果显示，在临床诊断为肝癌前12-36月和37-72月，六种细胞因子的联合检测可以对慢性HBV感染向肝癌的进展作出有效预警诊断，其敏感性分别达到100%和95. 12%，同时保持较好的诊断价值(R0C曲线下面积分别为0. 68(95% CI 0. 59-0. 76)和0. 70(95% CI 0. 62-0. 78))，在临床诊断为肝癌前73-156月，仅检测IL-23和IL-17即可有效预警诊断慢性HBV感染者的病程结局。对照组中血清IL-23和IL-17含量高于截断值的22例慢性HBV感染者中有3例在最近的随访中被诊断为肝癌，证实了所选择预警诊断指标的价值。综合以上分析和随访结果，在慢性HBV感染进展为肝癌的病程中，联合检测IL-23和IL-17在临床诊断为肝癌之前不同时间段均具有良好的预警诊断价值，而在此基础上， 以IL-23和IL-17为核心，同时联合检测IL-I β、IL-6、IL-10和TNF-α四种细胞因子中的一种或多种，也可以在慢性HBV感染进展为肝癌的病程的不同时间段发挥预警诊断作用。表1、免疫布阵法进行细胞因子定量的血清学检测方法的准确性比较
权利要求
1.检测1卜10、1卜6、11^-10、11^-17、11^-23和1咿-0中至少两种因子的物质在制备用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人发生肝癌倾向的组合物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述物质是针对所述因子的特异性配体或抗体或其抗原结合片段。
3.权利要求1或2的应用，其中所述鉴定是通过测定对象的生物学样品中所述至少两种因子的水平来进行的，其中检测样品中被检测的因子水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中所述至少两种因子是IL-17和IL-23。
5.权利要求1-3任一项的应用，其中所述因子是IL-17、IL-23以及选自IL-13、IL-6、 IL-10和TNF-中的至少一种因子。
6.权利要求1-3任一项的应用，其中所述因子是IL-17、IL-23、IL-li3、IL-6、IL-10和 TNF- α 0
7.权利要求3-6任一项的应用，其中所述生物学样品是血液样品或其衍生物如血清或血浆。
8.权利要求3-7任一项的应用，其中检测所述生物学样品中所述因子的蛋白水平。
9.权利要求8的应用，其中通过使用针对所述因子的特异性抗体或其抗原结合片段或配体检测所述因子的蛋白水平。
10.权利要求3-9任一项的应用，其中检测样品中所述因子水平升高是检测样品中所述因子水平与未患肝癌的慢性乙肝感染者或者正常人样品中所述因子水平相比是升高的。
11.权利要求8或9的应用，其中检测样品中所述因子水平升高是检测样品中所述因子蛋白水平分别高于如下各自的截断值IL-I β :28pg/ml ；IL-6 :12pg/ml ；IL-10 :1.5pg/ml ；IL-17 :2.5pg/ml ；IL-23 :855pg/ml ；TNF-α :12.5pg/mL·
12.一种用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-Ιβ、IL-6、 IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少两种因子的水平例如检测IL-I β、IL_6、IL-10、 IL-17、IL-23和TNF-α中至少两种因子的蛋白水平的物质。
13.权利要求12的组合物，其中所述至少两种因子是IL-17和IL-23。
14.权利要求12的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23 和 TNF- α 的水平的物质。
15.权利要求12-14任一项的组合物，其中所述生物学样品是血液样品或其衍生物例如血清或血浆。
16.权利要求12-15任一项的组合物，其中所述物质是IL-Iβ、IL-6、IL-10、IL-17、 IL-23或TNF-α蛋白的特异性配体或特异性抗体例如单克隆或多克隆抗体。
17.用于鉴定肝炎病毒感染对象例如慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中IL-I β、IL-6、IL-10、 IL-17、IL-23*TNF-a 中至少两种因子的水平例如检测 IL-I β、IL_6、IL-10、IL-17、IL-23 和TNF-a中至少两种因子的蛋白水平的物质。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述至少两种因子是IL-17和IL-23。
19.权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中 IL-I β、IL-6、IL-10、IL-17, IL-23 和 TNF-α 的蛋白水平的物质。
20.权利要求17-19任一项的试剂盒，其中所述生物学样品是血液样品或其衍生物例如血清或血浆。
21.权利要求17-20任一项的试剂盒，其中所述物质是IL-Iβ、IL-6、IL-10、IL-17、 IL-23或TNF-蛋白的特异性配体或特异性抗体例如单克隆或多克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定肝炎病毒感染对象具有发生肝癌倾向的方法，包括在所述对象的生物学样品中检测IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少2种因子的水平，其中所述水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。本发明还涉及了检测IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TNF-α中至少2种的物质在制备用于鉴定对象具有发生肝癌倾向的组合物中的应用以及用于所述鉴定的试剂盒。
文档编号G01N33/577GK102175868SQ201110002839
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者曲春枫, 杜君, 王金兵, 陈陶阳 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所