专利名称：一种用于糖蛋白检测的磁性弛豫开关的制作方法
技术领域：
本发明核磁共振技术领域，具体涉及一种用于糖蛋白检测的磁性弛豫开关。
背景技术：
糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质，两者以共价键相连。其中，寡糖链由共转译 或后转译修饰过程中的糖基化(glycosylation)作用而连结到蛋白质上。糖蛋白在细胞 内部，细胞膜和细胞外均有发现，免疫系统中几乎所有关键分子都是糖蛋白。蛋白质糖基 化的多样性与细胞周期，分化和发展状态有关。蛋白中某些位点的糖基化与信号转导有密 切关系，而糖基化程度及糖链结构的异常变化则往往是癌症及其他疾病的标志。一些肿瘤 的标志物及治疗的靶标如前列腺癌标志物PSA、乳腺癌中的Her2/neU、卵巢癌中的CA125等 都是糖蛋白。糖蛋白常用的分析方法有放射性标记法、分子荧光标记法、凝集素标记法、抗 体标记法、电泳法以及化学酵素法等。近年来，发展了包括高效液相色谱、毛细管电泳、生物 质谱、表面等离子共振光谱、拉曼光谱、电化学检测等在内的多种新方法对糖蛋白进行了检 测。另外，应用具有优良光学性质的金属纳米粒子(如金和银的纳米粒子)和具有磁性的 纳米粒子(如氧化铁纳米粒子)在糖蛋白检测方面具有较大的应用前景。磁性弛豫开关(Magnetic Relaxation Switches)是一种基于磁性粒子的生 物传感器，其工作原理基于磁性粒子在分散及团聚状态下其横向弛豫时间(Transverse Relaxation Time)T2的变化来进行检测，通过对磁性粒子表面进行功能化修饰，可以对寡 核苷酸，脱氧核糖核酸，蛋白质，酶，病毒，细菌，抗体等生物活性分子进行检测。与传统的光 学检测方法如紫外可见光谱，荧光光谱相比，该检测方法具有相当高的灵敏度及特异性，其 优点在于磁性粒子团聚后对周围水质子的弛豫率(1/T2)的改变，而不依赖于光学性质的 检测，因此特别适合于复杂的实际样品的检测。在磁性弛豫开关的检测，经常出现一种叫前 区效应(Prozone Effect)的现象，其本质是已经形成的磁性粒子团聚物在过量目标物的存 在下重新分散，导致T2的重新上升。T2的反复变化会影响检测的准确性。为了解决以上问 题，本发明设计一种基于磁性弛豫开关并适用于糖蛋白检测的新方法，通过合理设计避免 前区效应的出现从而提高检测的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于糖蛋白检测，且检测准确性高的磁性弛豫开关，并 提供用该磁性弛豫开关进行糖蛋白检测的方法。本发明提出的磁性弛豫开关，探针采用一种超顺磁性纳米粒子，该超顺磁性纳米 粒子以四氧化三铁纳米粒子为核，核尺寸小于10纳米，外部以葡聚糖为壳，整个粒子的平 均粒径不超过60纳米。该超顺磁性纳米粒子是水溶性粒子。本发明中，所述超顺磁性纳米粒子中，四氧化三铁重量含量为48—52%，饱和磁化 强度为32. 29emu/g，其纵向和横向弛豫度分别为18. SlmM^S"1和269. ？福-、—1。本发明提供的功能化超顺磁性纳米粒子的制备方法，包括以下两个步骤(1)超顺磁性纳米粒子的合成；(2)超顺磁性纳米粒子的纯化。本发明的基于所述磁性弛豫开关进行糖蛋白检测的方法，不需要任何标记手段， 操作简单，仅包括两个混合步骤及一个检测步骤。所述的混合步骤，包括凝集素的混合以及目标物的混合。所述的凝集素为伴刀豆 球蛋白。本发明提供的检测方法，其目标物为ai-酸性糖蛋白，其检测线性浓度范围为0 7. Onmol/L，检测限为 0. 40nmol/L。发明利用超顺磁性纳米粒子在分散与团聚状态下其横向弛豫时间T2的改变，通 过对磁性纳米粒子表面的葡聚糖与凝集素伴刀豆球蛋白之间特异性的互相作用，形成稳定 团聚物，同时使其T2下降，然后加入目标物ai酸性糖蛋白，由于具有较高的糖含量和与伴 刀豆球蛋白间的作用力，^酸性糖蛋白与超顺磁性纳米粒子产生竞争机制，使已经形成的 团聚物在一定程度上分散，使T2上升，从而对特定目标分子进行检测。通过该设计，在对目 标物的检测中，T2的变化趋于一致，不会发生反复变化从而避免了磁性弛豫开关检测中前 区效应的出现，提高检测的准确性。结果显示，该方法对酸性糖蛋白检测的线性浓度范 围为0 7. Onmol/L，检测限达到0. 40nmol/L，远低于血浆中AGP的正常浓度。
图1为本发明检测方法的示意图。图2为本发明超顺磁性纳米粒子的透射电镜图。图3为本发明超顺磁性纳米粒子的X射线衍射图。图4为本发明超顺磁性纳米粒子的红外光谱图。图5为本发明超顺磁性纳米粒子的热重分析图。图6为本发明超顺磁性纳米粒子的弛豫率线性拟合图。图7为本发明超顺磁性纳米粒子的T2随Con A浓度及检测时间的变化图。图8为本发明超顺磁性纳米粒子的粒径随Con A浓度的变化图。图9为本发明超顺磁性纳米粒子的T2在0 10 ii g/mL Con A的线性拟合图。图10为本发明超顺磁性纳米粒子与Con A的团聚物在0 0. 3 y g/mL AGP的线 性拟合图。
具体实施例方式1、超顺磁性纳米粒子的合成与纯化采用共沉淀法合成超顺磁性纳米粒子，具体方法如下，324. 4mg六水三氯化铁， 119. 3mg四水氯化亚铁和4. 5g葡聚糖(Dextran)(分子量=10T)溶解在10mL去离子水中， 冷却到2 4°C，在强烈机械搅拌和氮气保护下加入450 ii L 2 4°C氨水(25 28% )，反 应混合物在一个小时内均勻加热到75 85°C后在该温度维持75分钟。反应液自然冷却到 室温后通过透析(截留分子量=300KD)除去杂质与多余的葡聚糖，最后通过超滤(300KD) 浓缩溶液。2、横向弛豫时间的检测1000 iiL的超顺磁性纳米粒子溶液(25iiM Fe3+)与不同浓度的伴刀豆球蛋白(Concanavalin A, Con A)在管径15mm的样品管中混合并定容至2000 y L，并分别在25°C 和38 °C的水浴中恒温，随后在磁感应强度为0. 47T的匪I20-Analyst(Niumag Corp.， Shanghai，P. R. China)磁共振成像分析仪上以CPMG序列进行T2检测。在糖蛋白的检测中， 以 a 丨-酸性糖蛋白(a「Acid Glycoprotein，AGP)，牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)和前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)分别作为目标物进行检测。 1000 u L的超顺磁性纳米粒子溶液先与50 ii L的ConA(100 u g/mL)溶液混合均勻，静置反 应20分钟，随后分别加入不同浓度的AGP，BSA或PSA并以去离子水定容至2000 u L，分别 在25°C和38°C的水浴中恒温30分钟，随后进行T2检测。
权利要求
一种用于糖蛋白检测的磁性弛豫开关，其特征在于该磁性弛豫开关的探针采用一种超顺磁性纳米粒子，该超顺磁性纳米粒子以四氧化三铁纳米粒子为核，核尺寸小于10纳米，外部以葡聚糖为壳，整个粒子的平均粒径不超过60纳米。
2.根据权利要求1所述的用于糖蛋白检测的磁性弛豫开关，其特征在于四氧化 三铁重量含量为48-52%，饱和磁化强度为32. 29emu/g，其纵向和横向弛豫度分别为 18. Slmr'S-1 和 269. 2mM_1S_10
3.一种基于权利要求1所述磁性弛豫开关进行糖蛋白的检测方法，其特征在于包括 两步的混合步骤和一步检测步骤；所述的混合步骤为凝集素的混合步骤和目标物的混合步 马聚o
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的凝集素为伴刀豆球蛋白。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的目标物为al_酸性糖蛋白。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的目标物，其检测的线性浓度范 围为 0 7. Onmol/L，检测限为 0. 40nmol/L。
全文摘要
本发明属于核磁共振技术领域，具体为一种用于糖蛋白检测的磁性弛豫开关。该磁性弛豫开关的探针采用一种以四氧化三铁纳米粒子为核，以葡聚糖为壳，平均粒径不超过60纳米的超顺磁性纳米粒子。利用磁性弛豫开关进行糖蛋白的检测方法，包括两步混合步骤和一步检测步骤；混合步骤为凝集素的混合和目标物的混合，凝集素为伴刀豆球蛋白，目标物为a1-酸性糖蛋白。其检测的线性浓度范围为0～7.0nmol/L，检测限为0.40nmol/L，远低于血浆中AGP的正常浓度。
文档编号G01R33/465GK101858964SQ20101019162
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者孔继烈, 蔡少瑜 申请人:复旦大学