专利名称：氧化铜纳米颗粒标记抗体的方法、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析和诊断技术领域。具体地，本发明涉及一种采用纳米颗粒标记抗体的方法及其应用。
背景技术：
在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将一些既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体分子上，通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或者抗体的性质和含量。目前常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等。但在实际应用中，这三大免疫标记技术都存在不同缺陷。例如在荧光素标记技术中，荧光素存在荧光寿命和荧光效率的问题，且标记到抗原或抗体上的方法复杂；酶标记技术中，酶容易失活，从而影响待测物的检出限；放射性核素标记技术中，核素具有放射性，存在强烈的环境污染和健康危害。此外，采用以上三种方法在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，在读出方式上需要借助各类仪器才能进行。其中，荧光素标记技术需要荧光显微镜，酶标技术需要酶标仪，放射性核素技术需要自动计数器等探测仪器，对仪器的依赖决定了很多检测不能在条件落后及不发达地区开展。因此，现在存在对操作简单、反应体系稳定、便于开展、对环境无污染以及对人体无危害的免疫标记和检测技术的需求。目前，纳米技术是当前的热门研究领域，其中金纳米粒子由于其表面等离子共振效应而显示独特的颜色，被广泛应用于可视化检测。Mirkin小组首次报道了用表面功能化的金纳米粒子通过比色的方法检测DNA (参考文献Mirkin，C. Α.，Letsinger，R. L.，Mucic， R. C.，Storhoff，J. J. Nature, 1996，382，607-609)。蒋兴宇小组报道了通过合成功能化金纳米粒子，利用click反应来检测溶液中的铜离子(参考文献Yang Zhou, Shixing Wang，Ke Zhang, XingyuJiang*. Angew. Chem. Int. Ed. 2008,47,7454-7456)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗体标记的方法，该方法采用氧化铜纳米颗粒对抗体进行标记，所标记的抗体无需借助于特殊和昂贵的仪器即可实现方便、快速的检测。本发明的另一个目的是提供所述方法的应用。本发明的又一个目的是提供一种用于标记抗体的试剂盒。本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的应用。用于实现上述目的的技术方案如下一方面，本发明提供一种抗体标记方法，该方法包括以下步骤1)将氧化铜纳米颗粒制成分散液；2)将待标记的抗体加入到步骤1)中制备的氧化铜纳米颗粒分散液中进行低速振荡标记，之后离心并去除上清；3)将步骤2)中获得的沉淀重新分散，离心，之后去除沉淀。采用上述方法即可获得氧化铜纳米颗粒标记的抗体。
优选地，所述抗体标记方法在PBS缓冲液中进行。优选地，用于标记抗体的氧化铜纳米颗粒与待标记抗体的质量比为5 1 100 1 ；进一步优选地，质量比为50 1。优选地，在步骤1)中，采用选自涡旋振荡和超声方法对氧化铜纳米颗粒进行分散，进一步优选地采用超声进行分散，超声时间为5 30分钟。更优选地，超声时间为10 20分钟。优选地，在步骤2)中，标记反应时间为2 4小时；进一步优选地，标记反应时间为3小时。优选地，在步骤2、中，离心速度为8000 lOOOOrpm。进一步优选地，离心速度为 9000rpm ；优选地，离心时间为5 15分钟。进一步优选地，离心时间为10分钟。优选地，在步骤3)中，在将步骤2)中获得的沉淀重新分散后，加入稳定剂进行稳定。优选地，加入的稳定剂选自BSA、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠，进一步优选为 BSA。优选地，加入的稳定剂在反应体系中的浓度为0. 5% 2%，稳定反应时间为20 60 分钟；进一步优选地，所述稳定剂在反应体系中的浓度1%，稳定反应时间为30分钟。优选地，在步骤幻中离心速度为5000 8000rpm。进一步优选地，离心速度为 6000rpm ；优选地，离心时间为5 15分钟。进一步优选地，离心时间为10分钟。另一方面，本发明提供所述方法在生物、生物医学、医学检验等领域的应用。优选地，本发明提供所述方法在免疫相关疾病的检测和诊断中的应用，进一步优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。优选地，本发明提供所述方法在制备用于疾病检测和诊断的试剂中的应用。进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。又一方面，本发明提供一种用于抗体标记的试剂盒，该试剂盒包括氧化铜纳米颗粒、缓冲液以及稳定剂。优选地，所述试剂盒中的稳定剂选自BSA、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠，进一步优选为BSA。再一方面，本发明提供所述试剂盒在生物、生物医学、医学检验等领域的应用。优选地，本发明提供所述试剂盒在疾病检测和诊断中的应用。进一步优选地，所述试剂盒应用于免疫相关疾病的检测和诊断中，更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。本发明的抗体标记方法的应用可具体在于当采用本发明的方法对抗体进行纳米氧化铜标记后，标记了纳米氧化铜颗粒的抗体可以与待检测样品中的检测目标(例如抗原或其它能够与被标记抗体相结合的蛋白质等)进行稳定、有效的结合，进而通过检测氧化铜纳米颗粒实现对待检测目标或反应的检测，并且这一检测结果可通过肉眼进行判断。对于标记在抗体上的纳米氧化铜颗粒的检测将在下文的发明详述部分进行具体描述。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点1、本发明提供的抗体标记的方法在读出方面不需要借助于任何仪器，直接用肉眼就可读取检测结果，摆脱了目前通常采用的三大免疫检测技术对测量仪器的依赖。2、在对本发明的标记抗体方法的检测中，除了目前现有技术中对铜离子进行检测的方法和产品外，还可以采用改进的功能化金纳米颗粒对其进行检测，使得纳米氧化铜颗粒的检出限更低，可达到ΙμΜ，并且在10分钟之内可以完成检测，因此检测更为迅速、方便。3、本发明提供的抗体标记技术可以克服现有抗体标记技术的缺点，标记方法简单，稳定性好，便于开展，对环境无污染并且对人体无危害。4、本发明的方法及试剂盒不需要昂贵仪器，操作流程简单，成本低，便于开展，有望改善非洲等落后不发达地区的检测条件。以下是本发明的详细描述本发明的目的是建立一种抗体标记的新方法，通过采用氧化铜纳米颗粒对抗体进行标记，提供标记有氧化铜纳米颗粒的抗体。基于氧化铜纳米颗粒可以迅速、方便地进行检测，为基于免疫反应的疾病检测和诊断提供了一种新工具。本发明采用的示例性的技术方案如下1)称取1 5mg市售氧化铜纳米颗粒(购于Sigma公司，粒径小于50nm)，加入 1 5mL PBS缓冲液中，超声分散10 20分钟；2)将浓度为0. 1 0. 4mg/mL的抗体稀释液50 500 μ L在3分钟内逐滴加入含有氧化铜纳米颗粒的溶液中，低速振荡2 4小时后，8000 IlOOOrpm离心5 15分钟， 去掉含有没有标记氧化铜纳米颗粒抗体的上清液；3)将离心管中的沉淀用1 5mL PBS缓冲液重新分散，并向溶液中加入20 200 μ L 10%的BSA溶液，BSA溶液在这里起到稳定剂的作用，搅拌30 60分钟，5000 SOOOrpm离心5 15分钟，去掉沉淀得到氧化铜纳米颗粒标记的抗体，4°C保存待用。这里抗体可以是一抗也可以是二抗。采用上述方法即可获得氧化铜纳米颗粒标记的抗体。该被标记的抗体可以与待检测样品中的检测目标(例如抗原或其它能够与被标记抗体相结合的蛋白质等)进行稳定、 有效的结合，然后采用现有技术中检测铜离子的检测试剂或检测体系即可实现对氧化铜纳米颗粒的检测，从而实现对待检测目标或抗原抗体结合反应的检测。这一检测结果直接通过肉眼即可获得，因此，本发明所提供的标记方法可以有效应用于涉及抗体标记的生物、生物医学、医学检验等领域的研究和实践的应用。此外，抗体上的氧化铜纳米颗粒还可以通过特殊的功能化金纳米颗粒检测体系进行检测，这一功能化金纳米颗粒检测体系在检测时，可以在很短的时间内发生颜色变化，可以直接通过肉眼进行判断，从而实现检测。本申请在此提供了这一功能化金纳米颗粒检测体系及其检测方法。来自实施例、示例性的被标记抗体的检测如下首先，使标记了纳米氧化铜颗粒的抗体与待检测抗原相结合。在96孔板中加入浓度为0.01 0. 05mg/mL的抗原100 μ L，4°C过夜，然后用200 μ LPBST洗液(含有0. 吐温的PBS缓冲液)洗板三次，每孔加入200 μ L5%的胎牛血清作为封闭剂进行封闭，37°C孵育1 2小时。然后用200 μ L PBST洗液洗板三次，每孔加入经过氧化铜纳米颗粒标记的抗体100 μ L，37°C孵育1 2小时。然后用200 μ L去离子水洗板三次，完成抗原抗体免疫反应。然后，在孔中加入20 μ L 0. 1 ImM的HCl溶液，通过酸碱中和反应将标记在抗体上氧化铜纳米颗粒中的Cu2+释放出来，反应10分钟后，加入表面功能化的金纳米粒子检测体系(其制备请见实施例1-13)，检测体系中的还原剂将Cu2+还原成Cu(I)，Cu(I)作为催化剂在常温常压下使金纳米粒子检测体系中的金纳米粒子末端炔基和叠氮基发生成环反应(图1)，从而使功能化的金纳米粒子发生反应而产生聚积和沉淀现象，进而通过肉眼观察金纳米粒子颜色和沉淀现象的变化即可实现对溶液中Cu2+的检测，间接的实现对抗体表面氧化铜纳米颗粒标记物的检测。本发明的有益效果在于1、与同类标记方法相比，本发明的抗体标记方法简单，只需将氧化铜纳米颗粒与待标记抗体震荡搅拌3小时即可，不需要进行化学反应，操作简便。2、与同类标记的检测方法相比，本发明的抗体标记方法不需要借助精密仪器实施检测，仅凭肉眼即可完成对抗原抗体标记的定性检测。3、与同位素标记方法相比，本发明采用非放射性标记法，可以避免放射性物质对人体、环境的伤害；避免使用有毒或者对人体有害、对环境有污染的试剂。本发明方法是一种新的抗体标记方法，可以应用于基于免疫反应的重大疾病的诊断和检测，例如HBV，AIDS等，同时可以被制成试剂盒，实现商品化，因为整个标记反应的成本低，有望改善非洲等落后不发达地区的诊断条件。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中图1 在Cu (I)催化下，功能化金纳米粒子上的末端炔基和叠氮基发生成环反应的示意图。图2 化合物6的质谱(图2A)和红外图谱(图2B)。图3 化合物9的质谱(图3A)和红外图谱(图:3B)。图4 在对本发明的氧化铜纳米颗粒标记的抗体进行检测时，检测体系发生颜色变化的紫外吸收光谱。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本发明所使用的主要试剂或原料的商购途径如下表所示
权利要求
1.一种抗体标记方法，所述方法包括以下步骤1)将氧化铜纳米颗粒制成分散液；2)将待标记的抗体加入到步骤1)中制备的氧化铜纳米颗粒分散液中进行低速振荡标记，之后离心并去除上清；3)将步骤2)中获得的沉淀重新分散，离心，之后去除沉淀。
2.如权利要求1的方法，其特征为，所述抗体标记方法在PBS缓冲液中进行。
3.如权利要求1或2中任一项的方法，其特征为，所述用于标记抗体的氧化铜纳米颗粒与待标记抗体的质量比为5 1 100 1 ；进一步优选地，质量比为50 1。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其特征为，步骤1)采用涡旋振荡和超声方法对氧化铜纳米颗粒进行分散，进一步优选地采用超声进行分散，超声时间为5 30分钟。更优选地，超声时间为10 20分钟。
5.如权利要求1-4中任一项的方法，其特征为，步骤2)标记反应时间为2 4小时； 进一步优选地，标记反应时间为3小时；优选地，步骤2、中离心速度为8000 lOOOOrpm，进一步优选地，离心速度为9000rpm ； 优选地，离心时间为5 15分钟。进一步优选地，离心时间为10分钟。
6.如权利要求1-5中任一项的方法，其特征为，步骤幻中，在将步骤幻中获得的沉淀重新分散后，加入稳定剂进行稳定；优选地，加入的稳定剂选自BSA、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠，进一步优选为BSA ；优选地，加入的稳定剂在反应体系中的浓度为0. 5% 2%，稳定反应时间为20 60 分钟；进一步优选地，所述稳定剂在反应体系中的浓度1%，稳定反应时间为30分钟。
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其特征为，步骤3)中离心速度为5000 8000rpm， 进一步优选地，离心速度为6000rpm ；优选地，离心时间为5 15分钟。进一步优选地，离心时间为10分钟。
8.如权利要求1-7中任一项的方法在生物、生物医学、医学检验等领域中的应用；优选地，所述方法在免疫相关疾病的检测和诊断中的应用；进一步优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病；优选地，所述方法在制备用于疾病检测和诊断的试剂中的应用，进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。
9.一种用于抗体标记的试剂盒，所述试剂盒包括氧化铜纳米颗粒、缓冲液以及稳定剂；优选地，所述试剂盒中的稳定剂选自BSA、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠，进一步优选为BSA。
10.如权利要求9的试剂盒在生物、生物医学、医学检验等领域的应用；优选地，所述试剂盒在疾病检测和诊断中的应用；进一步优选地，所述试剂盒应用于免疫相关疾病的检测和诊断中；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。
全文摘要
本发明涉及一种抗体标记的方法，特别是通过简单的物理吸附将氧化铜纳米颗粒标记在抗体上的方法。本发明涉及的抗体标记方法具有很好的普适性，其检测在读出方式上不需要借助任何仪器，通过肉眼即可完成，适合野外作业。本发明还提供该抗体标记方法的应用。本发明进一步提供用于抗体标记的试剂盒及其应用。
文档编号G01N33/569GK102269760SQ20101019156
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者刘颖昳, 曲伟思, 王卓, 蒋兴宇 申请人:国家纳米科学中心