一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯 片试剂盒。
【背景技术】
[0002] 急性肾脏损伤（Acute Ki化ey Injury, AKI), W前称为急性肾衰竭（acute renal 化ilure，ARF)简称急肾衰，属临床危重症。该病是一种由多种病因引起的急性肾损害，可 在数小时至数天内使肾单位调节功能急剧减退，W致不能维持体液电解质平衡和排泄代谢 产物，而导致高血钟、代谢性酸中毒及急性尿毒症综合征，此综合征临床称为急性肾功能衰 竭。它的主要病理改变是肾小管坏死；而急性肾小管坏死的具体发病过程尚未完全阐明。
[0003] 虽然近几十年来，关于ARF病理生理及发病机制的研究取得了长足的进步，但ARF 的死亡率仍居高下，几乎高达60%。迄今ARF的防治形势依然十分严峻。多数学者认为目 前对于ARF的早期诊断、干预及重视不够。近年来，大量临床研究显示肾功能轻度损伤即可 导致发病率及病死率的增加。故目前国际肾脏病和急救医学界趋向将急性肾衰竭改称为急 性肾损伤（acute ki化巧injury，AKI)。期望尽量在ARF的早期，在肾小球的滤过率佑FR) 开始下降、甚至肾脏有损伤(组织学、生物标志物改变）而GFR尚正常的阶段将之识别，W便 及早干预。
[0004] 缺乏早期诊断指标致使诊断及治疗延迟是急性肾损害至今死亡率仍高的一个重 要原因。早期诊断指标应力求敏感、特异、简便，目前仍在努力寻找中。ADQI关于AKI诊断 的建议指出，血肌酢和尿量是目前唯一可靠的检测指标，该两个指标也是目前AKI分期的 依据。但是，血肌酢并非一个敏感的指标，而且从血肌酢代谢与分布的生理学来看，血肌酢 不仅反映GFR，还受到其分布及排泄等综合作用的影响。已有的研究证实血肌酢的升高明显 落后于肾脏本身的损伤。尿量更容易受到容量状态、药物等非肾脏因素影响。所W，寻找 一种新的诊断AKI的蛋白质标记物W来代替传统的血肌酢和尿量的检测是降低AKI病人死 亡率的关键；W求快速、早期诊断AKI，避免AKI转向晚期不可逆转的损伤阶段。
[0005] 目前，包括NGAL，KIM-1，切statin C，L-FABP，MCP-1等20种蛋白在血和/或尿中 的表达的增加或含量的增高被认为与AKI的早期损伤有关。如NGAL在ICU的AKI病人的血 和尿中显著的升高，其诊断的特异性和敏感性均超过90%。在肾缺血后2?6小时NGAL血浓 度及尿排泄量即增加，是敏感、特异的急性肾损害早期诊断指标。肾脏损伤分子-UKLM-1): 它能在上皮细胞黏附，生长及分化上起重要作用，急性肾损害致肾小管上皮细胞损伤后12 小时内尿中KLM-1既增加，早于血肌酢的增加。
[0006] 由于急性肾功能损伤的复杂性和多样性，单独检测一种生物标志物对其早期诊断 和预测不太理想。因此，急需研制一种能够通过多指标检测进行准确的急性肾功能损伤早 期诊断的方法和产品。
[0007] 定量抗体芯片是基于夹也法化ISA技术，能让研究者准确、及时确定多种生物标 志物的浓度，兼具化ISA方法的高灵敏度、特异性和芯片的高通量检测的优点。该技术是利 用一对能与标志物特异性结合的抗体来进行检测，捕获抗体(一抗）先固定在玻片上，加入 临床样本后进行赔育，目标标志物被捕获。加入生物素标记的二抗，它可W区分出目标标志 物的不同类型。加入链霉亲和素标记的切3等效染料后，利用激光扫描可视化，可W检测标 志物-抗体-生物素复合物。与传统的化ISA不同，采用的定量抗体芯片试剂通过在玻璃 表面排列各种特异性标志物捕获抗体，可W在一个实验中检测多种生物标志物。该高通量 高密度的抗体芯片技术，能用极其微量的标本，同时检测出成千上万个蛋白质。该种技术优 越于其它能同时检测多个蛋白质的技术，具有灵敏度高，高效高速，需求标本量极低，成本 低且能在普通实验室使用的优点。
【发明内容】
[0008] 针对现有的需求，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高通量、高灵敏度、高 特异性和低成本的用于早期诊断急性肾损伤的抗体试剂盒。本发明所述的试剂盒能够检测 20种特异的急性肾损伤早期诊断指标，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低 等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等 优点。本发明在临床诊断上的应用有助于确定在AKI早期诊断中最具有临床应用价值的蛋 白或组合，并建立基于中国人群的域值，有利于更快更准确的诊断急性肾损伤。因此，寻求 一种比单纯W血中肌酢的升高来判断肾功能损伤更为早期和合理临床诊断方法，有助于肾 功能损伤的早期发现并采取预防措施，阻止肾脏进入不可逆的损伤阶段。同时，该发明可应 用于肾脏药物毒性、也脏毒性的监测，临床药物的开发和肾脏移值排斥反应的监测。由此可 见，本发明必将产生重大的临床和社会价值。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供的一种用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体 芯片试剂盒，包括：抗体芯片，包括标准组织玻片和在标准组织玻片表面上固定的20种急 性肾损伤标志物的特异性抗体、H种阳性对照；急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20 种急性肾损伤标志物标准品按照一定的量混合在一起的冻干混合物；生物素标记的急性肾 损伤标志物检测抗体混合物；英光素切3标记的链霉亲和素。
[0010] 在实际操作中，将冻干的急性肾损伤标志物标准品混合物复溶后经梯度稀释制备 成系列不同急性肾损伤标志物浓度的混合液，用来制作多重夹也化ISA方法急性肾损伤标 志物的标准曲线。
[0011] 根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述抗体芯片的基片是由活 性环氧基团包被的标准组织玻片，用2X8孔可拆卸型框架把玻片分割成16个互不干扰的 点样小区；所述20种急性肾损伤标志物的特异性抗体是采用非接触性点样方式固定在每 个点样小区内，每种特异性抗体、阳性对照均重复点样四次，W致在每个点样小区内形成 8X9矩阵的微阵列。
[0012] 根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述的抗体芯片是将100 -lOOOpl的含0. 02-20ng特异性抗体的PBS缓冲液(含有0. Ol-lOg/lOOml牛白蛋白）点样于 所述玻片上，控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%，将点样好的玻片放于室温条件下静 置过夜，第二天真空抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割 成16个互不干扰的小区。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于 2C到8C保存备用。
[001引将lOO-lOOOpl的含0.02-2ng的特异性的抗体的PBS缓冲液冷有 O.Ol-lOg/lOOml牛白蛋白）用全自动点样仪点样于玻片上。生物素标记的牛IgG作为阳性 对照。每种抗体和H种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。每张玻片上有 16个相同的芯片点阵。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干 燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。 用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装后于2C到8C保存备用。
[0014] 根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，种不同浓度的生物素标 记的小牛IgG作为阳性对照和作为不同微阵列间的标准化参照系。
[0015] 根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述特异性抗体为选自针对 如下20种急性肾损伤标志物的抗体：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、H叶因子3、目2-微 球蛋白、丛生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白B、肝脂肪酸结合蛋白、单核 细胞趋化蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、巧结合蛋白-1、Y干扰素诱导蛋白10、脫抑 素C、肝细胞生长因子、巨瞻细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质 金属酶组织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
[0016] 本发明所述的抗体芯片试剂盒通过类似于夹