检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及制备方法，属于生物【技术领域】。试剂盒采用犬瘟热病毒F蛋白作为包被抗原，依据间接ELISA原理检测犬血清中类犬瘟热病毒IgG类型抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为F蛋白，其具有良好的抗原性。本发明提供的酶联免疫试剂盒包括已包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧化酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体、浓缩洗涤液、血清稀释液、TMB底物、终止液。本发明试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。
【专利说明】 检测犬瘟热病毒I gG抗体的ELISA试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明为检测犬瘟热病毒IgG抗体的检测试剂盒，属于生物【技术领域】。具体而言，本发明涉及犬瘟热传染性疾病中检测抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]犬瘟热病毒(canine distemper virus，Q)V)为副黏病毒科，麻瘆病毒属，是一种单链RNA病毒。CDV感染犬是一种最古老的、临床意义最大的病毒。CDV的最初感染开始于病毒侵袭上呼吸道上皮细胞，病毒很快扩散至局部淋巴组织、扁桃腺和支气管淋巴结。
[0003]感染CDV表现症状多种多样，与病毒毒力、环境条件、宿主的年龄及免疫状态有关，实验室常采用ELISA方法测定血清中抗体滴度来评价保护性。F蛋白为犬瘟热病毒的结构蛋白之一，具有较好的抗原性。
【发明内容】
[0004]本发明公开了检测犬瘟热病毒IgG抗体的基于间接ELISA方法的试剂盒及其制备方法，可用于瘟热IgG抗体的大量筛查。
[0005]本发明还提供了一种F基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。
[0006]本发明还提供了一种兔抗犬IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。
[0007]本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测犬瘟热病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种用于检测犬瘟热病毒I gG抗体的间接ELI SA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗犬I gG多克隆抗体。
[0009]还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照、阴性对照。
[0010]上述用于检测犬瘟热病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒包括:
[0011 ] 所述ELISA板条:每个试剂盒装有I块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的F蛋白，规格为8孔X 12条；
[0012]所述血清稀释液和浓缩洗涤液:血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；
[0013]所述底物显色液:即用型TMB显色液，1mL ；
[0014]所述终止液:2mol/L的H2SO4溶液，1mL ；
[0015]所述酶标多克隆抗体:所述辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
[0016]阳性对照为:经高温灭活的经疫苗免疫后犬血清稀释液。
[0017]阴性对照为:经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
[0018]所述的间接ELISA试剂盒在检测犬瘟热病毒IgG抗体中的应用。
【具体实施方式】
[0019]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明:
[0020]本发明的技术方案如下:
[0021]一、抗原制备
[0022]1.犬瘟热病毒F蛋白的表达
[0023]根据GenBank中瘟热病毒F基因序列，设计合成了 I对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出F基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-F，测序验证后转化入表达宿主菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达。
[0024]2.犬瘟热病毒F蛋白的纯化
[0025]诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声ls，间隔ls，共1min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镲离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，纯化后F蛋白的OD值为2.25，与标准品比较后，其浓度为1700 μ g/ml。
[0026]二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG的制备
[0027]1.纯化犬IgG的制备
[0028]取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
[0029]取I份预处理过的血清加2份0.06mol/L ρΗ5.0醋酸缓冲液，用lmol/L HCl调pH至4.8 ;按每毫升稀释血清加Ilul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时，取出12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用lmol/L NaOH调pH至7.2 ;在4°C下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，轻轻混匀30min，静置I小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4°C过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
[0030]2.兔抗犬IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记
[0031]上述制备的纯化犬IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬IgG多克隆抗体。
[0032]纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下:
[0033]称取5mg HRP溶解于Iml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M Na104溶液，室温避光搅拌20分钟；对ImM pH4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4°C过夜；向其中再加入20 μ I0.2Μ ρΗ9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.0lM碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg(10mg/ml)，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混匀，4°C放置2小时；所得产物对0.1M pH7.4 PBS中4°C透析过夜。
[0034]透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C I小时。3000r/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.1M pH 7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
[0035]三、试剂盒的建立
[0036]1.本发明试剂盒的检测原理
[0037]采用间接ELISA法，将重组的瘟热蛋白F包被于微孔板中，然后用1% BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热IgG抗体能与酶标板中包被的F抗原反应，加入酶标兔抗犬IgG多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的F抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬瘟热IgG抗体的含量成正比。
[0038]2.本发明试剂盒的组成
[0039]a)酶标板的最佳制备方法
[0040]用pH9.6 0.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组F蛋白稀释后，按10ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的F蛋白含量为0.2ugo 4°C包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入I % BSA的封闭液，37°C静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
[0041]b)工作试剂的配置
[0042]洗涤液(pH7.4,0.15M PBS):KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H20 2.9g，NaCl 8.0g, KCl0.2g，Tween-20 (0.05% )0.5ml，加蒸馏水至100ml0浓缩成25倍作为存储液。
[0043]血清稀释液:牛血清白蛋白0.lg，加洗涤缓冲液至10ml
[0044]底物缓冲液(pH5.0 磷酸柠檬酸):0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M 柠檬酸 24.3ml，加蒸馏水50ml
[0045]TMB (四甲基联苯胺)使用液:TMB (10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75% H2O2 32ul
[0046]终止液(2M H2SO4):蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98% )21.7ml
[0047]c)检测犬瘟热IgG抗体的间接ELISA试剂盒的组建
[0048]组建检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，包含以下组分:
[0049]F重组蛋白包被的96孔酶标板
[0050]辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体
[0051]标准阳性对照
[0052]标准阴性对照
[0053]浓缩洗涤液
[0054]血清稀释液
[0055]TMB 底物
[0056]终止液
[0057]产品说明书
[0058]四、样品中犬瘟热IgG抗体的检测
[0059]1.用上述制备的试剂盒进行检测
[0060]I)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100 μ I加入酶标板，37°C孵育I小时。洗涤液清洗3-5次。
[0061]2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬IgG多克隆抗体100 μ 1，37°C孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
[0062]3)每孔加入TMB底物液100 μ 1，室温避光反应10-15分钟。
[0063]4)每孔加入100 μ I 2Μ H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
[0064]2.检测结果分析
[0065]I)检测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
[0066]PC-NC ^ 0.4
[0067]Cut Off = NC+0.05
[0068]其中NC =阴性对照血清OD值
[0069]PC =阳性对照血清OD值
[0070]2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
[0071]当血清样本的OD值低于Cut Off值时，该样本为犬瘟热病毒IgG抗体阴性。
[0072]当血清样本的OD值高于Cut Off值是，该样本为犬瘟热病毒IgG抗体阳性。
[0073]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【权利要求】
1.检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述ELISA检测试剂盒以重组的瘟热F蛋白为包被抗原，封闭后加入样本及标准阳性对照、阴性对照，以酶标兔抗犬IgG多克隆抗体为标记抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ELISA法检测犬瘟热病毒IgG类型抗体，然后加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，测定各孔吸光度值。
2.根据权利要求1所述检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照、阴性对照。
3.根据权利要求2所述的检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于: 所述ELISA板条:每个试剂盒装有I块96孔ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被F蛋白的ELISA微孔板，规格为8孔X 12条； 所述血清稀释液为即用型的牛血清白蛋白溶液； 所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸盐缓冲液，使用前稀释； 所述底物显色液:即用型TMB显色液，1mL ； 所述终止液:2mol/L的H2SO4溶液，1mL ； 所述酶标单克隆抗体:所述辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释； 所述阳性对照为:经高温灭活的经疫苗免疫后犬血清稀释液。 所述阴性对照为:经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
4.制备权利要求1所述的检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体的方法，采用辛酸-硫酸铵法纯化犬血清IgG，制备纯化的犬IgG，并用此纯化IgG免疫家兔，制备兔抗犬IgG多克隆抗体；采用过碘酸钠法对上述多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记。
5.制备权利要求1所述的检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述瘟热病毒F蛋白的是采用基因重组技术，体外诱导表达、纯化蛋白的方式获得。
6.权利要求1所述的检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒在检测犬瘟热病毒IgG类型抗体中的应用。
【文档编号】G01N33/569GK104502588SQ201410758118
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】王涛, 王天娇, 白璐 申请人:天津拓瑞医药科技有限公司