快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒，包括底板(5)，在底板(5)的板面上沿其长度方向顺次设置有喷涂有布鲁氏菌抗原的样品垫(1)、带有布鲁氏菌单克隆抗体的胶体金复合物垫(2)、硝酸纤维素膜(3)以及吸水垫(4)；所述硝酸纤维素膜(3)上设有检测带(10)和对照线(11)。本发明采用样本中的特异性布鲁氏菌抗体来阻断胶体金标记的布鲁氏菌单抗和抗原的结合，利用单克隆抗体的高特异性和均一性使得检测结果更加准确。
【专利说明】
快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明属于免疫胶体金层析分析领域，涉及一种检测试纸条及其试剂盒，尤其涉 及一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒，用于对动物全血或血清样本进行布 鲁氏菌病抗体的检测。
【背景技术】
[0002] 血清学检测通常用于了解动物的群体免疫水平和对疫苗免疫效果进行评价。常用 的方法有以下几种：（1)布鲁氏菌病凝集试验，（2)中和试验，（3)间接ELI SA试验，（4)胶体金 免疫检测等技术，其中，间接ELISA法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于临 床布鲁氏菌病血清/血浆抗体的定性和定量检测，为布鲁氏菌病免疫效果的监测提供参考。 但是，上述检测手段对布鲁氏菌病抗体的检测存在重复性不好，操作技术繁琐的问题。
[0003] 现有技术中，布鲁氏菌胶体金抗体检测主要采用间接法、竞争法、夹心法。
[0004] 间接法：用胶体金标记抗原(LPS或BP26蛋白）或二抗（鼠抗牛IgG八鼠抗羊IgG/兔抗 牛IgG/SPA/SPG等），检测线（T线）处包被对应的二抗（鼠抗牛IgGA鼠抗羊IgG/兔抗牛IgG/ SPA/SPG等)或者抗原(LPS或BP26蛋白）。间接法中不管采用以上哪种方式，都因为细菌菌体 拥有多种抗原成分，且完整的抗原会与多种其它细菌感染产生的抗体发生交叉反应，这两 种因素的影响，不可避免的都会造成检测结果的假阳性，使得特异性不佳。
[0005] 双抗原夹心法:采用双抗原夹心法，因为抗原本身存在的交叉反应，所以同样存在 与间接法相同的假阳性问题。
[0006] 竞争法:虽然此方法中也采用了 一个单克隆抗体金标复合物，但是，其模式是待检 抗体与单克隆抗体金标复合物同时竞争结合检测线(T线）的抗原。此模式的问题是待检抗 体、单克隆抗体金标复合物与检测线上的抗原结合是同等机会的，而因为生物个体的差异， 如果待检样本中的抗体含量较低，或者亲和力低，则竞争不过单克隆抗体金标复合物，从而 使得检测结果呈假阴性。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种采用样本中的特 异性布鲁氏菌抗体来阻断胶体金标记的布鲁氏菌单抗和抗原的结合，利用单克隆抗体的高 特异性和均一性使得检测结果更加准确的试纸条。
[0008] 本发明进一步要解决的技术问题在于，提供一种使用方便、检测快速准确的快速 检测布鲁氏囷病抗体的试剂盒。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试 纸条，包括底板，在底板的板面上沿其长度方向顺次设置有喷涂有布鲁氏菌抗原的样品垫、 带有布鲁氏菌单克隆抗体的胶体金复合物垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫;所述硝酸纤维素 膜上设有检测带和对照线。
[0010] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条中，优选所述硝酸纤维素膜设有一条由 布鲁氏菌多克隆抗体包被而成的检测带。
[0011] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条中，优选所述硝酸纤维素膜设有一条由 羊抗鼠抗体包被而成的对照线。
[0012] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条中，优选所述胶体金复合物垫是采用布 鲁氏菌单克隆抗体与胶体金颗粒标记后干燥于玻璃纤维制成。
[0013] -种快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒，包括胶体金试纸卡和样品稀释机构；
[0014] 其中，所述胶体金试纸卡包括封闭的盒体，在盒体内设置有上述的试纸条；
[0015] 所述样品稀释机构包括用于样品稀释的容器、磷酸盐缓冲溶液。
[0016] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒中，优选所述盒体上设有观察窗和加样 孔。
[0017] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒中，优选所述加样孔对应设置在所述样 品垫上方，所述观察窗对应设置在所述硝酸纤维素膜上方。
[0018] 本发明试纸条和试剂盒采用阻断法检测抗体，通过待检样本中的抗体阻断胶体金 标记的单克隆抗体与抗原的结合。因为单克隆抗体所具有的良好的亲和力、特异性和均一 性，使得这种模式建立的检测试剂具有更好的准确率和稳定性。
[0019] 试纸条或试剂盒在使用时，把待检样本加入到加样孔后，样品先溶解样品垫(现有 技术的样品垫中没有抗原）中的布鲁氏菌病抗原，并且一起沿着试纸条侧向流动，并在流经 胶体金垫时同样溶解胶体金垫中的胶体金标记的布鲁氏菌单抗(现有技术中为胶体金标记 的布鲁氏菌抗原或SPA蛋白，或者二抗），再一起沿着NC膜流动。当样品中没有布鲁氏菌病抗 体时，样品垫中的抗原先与胶体金标记的布鲁氏菌病单抗结合形成布鲁氏菌病抗原-布鲁 氏菌病单抗-胶体金的复合物，当此复合物流经检测带时，又被固定在NC膜上检测线(T线） 处的布鲁氏菌病抗体捕获，形成"布鲁氏菌病抗体-布鲁氏菌病抗原-胶体金标记的布鲁氏 菌病单抗"的复合物结构，因为胶体金颗粒的富集而显示红色线条。当样品中含有布鲁氏菌 病抗体时，样品中的抗体先与样品垫中的抗原相遇并结合，从而阻断了胶体金标记的布鲁 氏菌病单抗与抗原的结合，这样也就造成了无法在检测线(T线)处形成"布鲁氏菌病抗体-布鲁氏菌病抗原-胶体金标记的布鲁氏菌病单抗"的复合物结构，因而在检测线(T线)处就 不会有胶体金颗粒的富集，无红色条带形成。
[0020] 相比间接法和夹心法，本申请采用的阻断法胶体金抗体检测试纸条因为采用了单 克隆抗体标记胶体金作为示踪剂，且单克隆抗体具有良好的特异性，不存在间接法或夹心 法与其它菌体抗原的交叉反应或者抗原本身存在的交叉反应的问题，也不会有与正常血清 中IgM的F_c段的结合，所以保证了检测方法的高特异性。
[0021] 相比竞争法，本发明采用的阻断法的胶体金抗体检测试纸条是将样本中的待检抗 体先与样品垫中的抗原充分接触反应，待此反应完成后，再流经单克隆抗体金标复合物，待 检抗体有优先与抗原反应的机会，所以避免了竞争法的问题，从而使得检测结果更加准确。
【附图说明】
[0022] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0023] 图1是本发明实施例的试纸条侧面结构示意图；
[0024]图2是本发明实施例的试剂盒正面结构示意图；
[0025] 图3-6是本发明实施例的各种检测结果图示。
【具体实施方式】
[0026] 为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明 本发明的【具体实施方式】。
[0027] 如图1所示，一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条，包括底板5,在底板5的板面 上沿其长度方向顺次设置有喷涂有布鲁氏菌抗原的样品垫1、带有布鲁氏菌单克隆抗体的 胶体金复合物垫2、硝酸纤维素膜3以及吸水垫4;所述硝酸纤维素膜3上设有检测带10和对 照线11。
[0028] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条中，优选所述硝酸纤维素膜3设有一条 由布鲁氏菌多克隆抗体包被而成的检测带10。优选所述硝酸纤维素膜3设有一条由羊抗鼠 抗体包被而成的对照线11。
[0029] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条中，优选所述胶体金复合物垫2是采用 布鲁氏菌单克隆抗体与胶体金颗粒标记后干燥于玻璃纤维制成。
[0030] 如图1、2所示，一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒，包括胶体金试纸卡和样品 稀释机构；
[0031] 其中，所述胶体金试纸卡包括封闭的盒体6,在盒体6内设置有上述的试纸条100; 所述样品稀释机构包括用于样品稀释的容器、磷酸盐缓冲溶液。样品稀释的容器可以采用 盛装液体的5毫升滴瓶，磷酸盐缓冲溶液采用0.01MPBS。
[0032] 所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒中，优选所述盒体6上设有观察窗8和加 样孔9。观察窗8和加样孔9的具体结构不作限定，根据实际使用情况确定。优选所述加样孔9 对应设置在所述样品垫1上方，通过加样孔9加入样品，所述观察窗8对应设置在所述硝酸纤 维素膜3上方，用于观察检测带10是否形成红色条带。
[0033]试纸条的制备 [0034] 一、胶体金制备
[0035] 1)将制备专用烧瓶用重铬酸钾洗液浸泡过夜，用自来水冲洗干净，去离子水润洗 后再用0 ? 22um过滤去离子水润洗三次，备用。其它玻璃器皿也都需清洁干净后再用0 ? 22um 过滤去离子水润洗；
[0036] 2)取一定量去离子水加入1 %体积的1 %氯金酸（用前0.22um过滤)溶液到专用烧 瓶中；装上搅拌器和冷凝管；
[0037] 3)打开冷凝水和油浴加热套，同时缓慢搅拌，加热至90摄氏度；
[0038] 4)5min后按照1%柠檬酸钠：1/万氯金酸= 1.8:100的比例，一次性迅速加入相应 量的1%柠檬酸钠溶液，同时加快搅拌速度至300rpm，30秒后降低搅拌数度至lOOrpm，再保 持20min后关闭加热装置，水浴冷却。
[0039] 5)分别在520謹、525謹、53011111测定其00值，最大吸收峰应为52511111，且00应在 1.00 - 0.95之间。否则，弃用。
[0040] 二、单抗标记
[0041 ] 1)用0.邡1(2〇)3调节胶体金溶液的?11至7.2 ;
[0042] 2)按照10ug/ml浓度，计算标记所需抗原量，然后将抗原用D. I稀释至0.5mg/ml，搅 拌下缓慢滴加入空白胶体金，室温保持搅拌20min;
[0043] 3)搅拌下同样缓慢滴加入10 %的BSA，使其BSA终浓度为1 %，保持搅拌20min后再 室温静置1小时；
[0044] 4)4°C下，12000rpm离心45min，去上清液。沉淀用0.01M PH7.2PB复溶至原1/40体 积；
[0045] 5)4°C下，1500rpm离心10min，去沉淀后完成标记。
[0046] 三、胶体金垫制备
[0047] 1)用0.01M PH7.溶液将胶体金复合物稀释到批生产指定浓度;加入50 %海藻 糖（用前〇.2211111过滤），使其终浓度达到25%;
[0048] 2)将所用玻纤用5mM PH7.2PB溶液(含0.2%酪蛋白和0.3%Tween-20)浸泡2小时， 后自然凉干备用；
[0049] 3)将金标液加入BIODIT相应样品瓶;打开BIODOT仪和氮气瓶阀门，将玻璃纤维平 铺于膜板上，开始喷涂；
[0050] 4)喷涂完毕玻纤在相对湿度40%以下，室温凉干(8小时以上）；用专用裁刀裁去胶 体金垫边缘至指定规格后完成制备。
[0051] 四、喷膜
[0052]用0.01M pH7.2PBS溶液将布鲁氏菌病抗体和羊抗鼠二抗稀释至所需浓度， lOOOOrpm离心5min，去沉淀，同时加入1/万叠氮钠;将合格NC膜裁切成300mm长，正面朝上平 铺与膜板上，用磁条压定，开始画膜;在NC膜的相应位置进行标注，正面朝上，相对湿度35 % 以下室温干燥2小时后于干燥器中密封保存。
[0053] 五、样品垫制备
[0054] 将布鲁氏菌抗原用0.01MPBS溶液稀释至lug/ml，将玻纤浸泡其中30min后，捞出晾 干，并裁切成1 ? 5cm*30cm备用。
[0055] 六、纸条组装
[0056]首先揭去PVC板上NC膜粘贴位置的封胶纸，使其胶面暴露出来，将NC膜正面向上， 端正、平整的贴于PVC板的标定位置;揭去PVC板上胶体金复合物垫粘贴位置的封胶纸，将裁 切好的胶体金复合物垫一端对齐PVC板，贴于标定位置，用手轻压，使其粘和完全;将裁切好 的样品垫贴于PVC板的标定位置，用手轻压，使其粘和完全;揭去PVC板上吸水垫粘贴位置的 封胶纸，将吸水垫裁切为2cm宽，贴于PVC板的标定位置，用手轻压，使其粘和完全，完成装 裱。然后将PVC板正面朝上送入切条机裁切成4mm宽纸条后装入塑料卡盒内密封干燥保存。 [0057] 检测步骤：
[0058] 1.采血0.5-lmL，3000转/分，离心3-5分钟分离血清。也可4°C静置过夜，使血清自 然析出得到检测样品，或采用全血直接检测。
[0059] 2.取出本发明试纸条或试剂盒中的检测卡(若冷藏保存，需恢复至室温再打开包 装），开封后平放于桌面上。
[0060] 3.取5ul(毛细管黑色刻度处)血清或全血作为样品加入加样孔，然后立刻用装有 缓冲稀释液的滴瓶滴加一滴缓冲稀释液。
[0061 ] 4.请等待5分钟。
[0062] 5.再滴加两滴缓冲稀释液。
[0063] 6.这时会看见有酒红色的液体流过观察窗。等待10-15分钟判断结果，15分钟后的 结果无效。
[0064]结果判定：
[0065] 1.阴性:如图3所示，检测线(T线)和对照线(C线)都显示酒红色的反应。
[0066] 2.阳性：如图4所示，检测线（T线）上没有颜色反应，只是在对照线（C线）上显示酒 红色的反应。
[0067] 3.失效:如图5、6所示，在观察孔内，对照线区（C)和检测线区（T)都不出现色线;或 仅检测线区(T)出现色线。
[0068] 对比试验：
[0069] 1、本发明与国家标准检测方法(虎红平板凝集试验和试管凝集实验）的符合性比 对：
[0070] 实验方法：用本发明的试纸条检测虎红平板凝集和试管凝集双阳性血清98份，双 阴性血清104份，对比检测结果。
[0071] 对比实验图表：
[0073] 结论：
[0074] 敏感性：100%;98/98
[0075] 特异性：99 %; 103/104
[0076] 总符合率:99.5%; 201/202
[0077] 本发明的试纸条检测结果符合国标要求。
[0078] 2、本发明检测灵敏度与国标方法(虎红平板凝集试验)的比较：
[0079] 实验方法：将中国兽医药品监察所标准阳性血清倍比稀释后分别检测各稀释倍 数，对比呈现阳性结果的最大稀释倍数。
[0081]结论:可见虎红平板凝集试验检测被比稀释的标准阳性血清呈阳性的最大稀释倍 数是1:8,而同时本发明阻断法胶体金试纸条是1:16,灵敏度高于国标方法。
【主权项】
1. 一种快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条，其特征在于，包括底板(5)，在底板(5)的板 面上沿其长度方向顺次设置有喷涂布鲁氏菌抗原的样品垫（1)、带有布鲁氏菌单克隆抗体 的胶体金复合物垫(2)、硝酸纤维素膜(3)以及吸水垫(4);所述硝酸纤维素膜(3)上设有检 测带（10)和对照线（11)。2. 根据权利要求1所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤 维素膜(3)设有一条由布鲁氏菌多克隆抗体包被而成的检测带（10)。3. 根据权利要求1所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤 维素膜(3)设有一条由羊抗鼠抗体包被而成的对照线（11)。4. 根据权利要求1所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条，其特征在于，所述胶体金 复合物垫(2)是采用布鲁氏菌单克隆抗体与胶体金颗粒标记后干燥于玻璃纤维制成。5. -种快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒，其特征在于，包括胶体金试纸卡和样品稀 释机构； 其中，所述胶体金试纸卡包括封闭的盒体(6)，在盒体(6)内设置有权利要求1-4所述的 试纸条(100); 所述样品稀释机构包括用于样品稀释的容器、磷酸盐缓冲溶液。6. 根据权利要求5所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒，其特征在于，所述盒体 (6)上设有观察窗(8)和加样孔(9)。7. 根据权利要求6所述的快速检测布鲁氏菌病抗体的试剂盒，其特征在于，所述加样孔 (9)对应设置在所述样品垫（1)上方，所述观察窗（8)对应设置在所述硝酸纤维素膜(3)上 方。
【文档编号】G01N33/558GK105929154SQ201610259519
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】饶乐
【申请人】深圳真瑞生物科技有限公司