一种用于人脑疾病检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人脑疾病检测及诊断试剂盒。该试剂盒主要含有用于特异性检测人脑红蛋白的适配体；本试剂盒具有较高的灵敏度，可用于检测样品中脑红蛋白的含量，并可为老年性痴呆、脑梗塞、创伤性脑损伤等涉及到神经元损伤和变性死亡等疾病中的早期诊断及治疗过程中的病程跟踪提供有效的检测手段。
【专利说明】
-种用于人脑疾病检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明具体设及一种通过检测人脑红蛋白检测人脑疾病及诊断的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 脑红蛋白（Neuroglobin，NGB)是体内除了血红蛋白和肌红蛋白之外的第S类重要 的携氧蛋白，在神经系统中特异表达，广泛分布于脑组织内。和肌红蛋白一样，脑红蛋白能 可逆地结合氧，且与氧有很高的亲和力。肌红蛋白在正常人血清内含量极微，当屯、肌和骨骼 肌损伤时，肌红蛋白可从受损细胞释放，快速入血，导致血清肌红蛋白升高。肌红蛋白已成 为临床上一些重要疾病如屯、肌梗塞、肾功能衰竭等敏感而又特异的生化诊断指标。脑红蛋 白和肌红蛋白在功能和性质上具有严格的相似性:脑红蛋白有151个氨基酸，分子量为17千 道尔顿，而肌红蛋白则有154个氨基酸，分子量也为17千道尔顿。鉴于脑红蛋白与肌红蛋白 在功能上具有严格的相似性，即肌红蛋白负责屯、肌和骨骼肌的氧供应，脑红蛋白则负责脑 的氧供应，两者均能从损伤细胞中释放入血，因此，脑红蛋白在老年性痴呆、脑梗塞、创伤性 脑损伤等设及到神经元损伤和变性死亡等疾病的早期诊断中具有潜在的诊断价值，同时对 上述疾病治疗过程中的病程跟踪也具有重要的参考价值。因此，检测血液中脑红蛋白的含 量具有重要的意义。
[0003] 系统进化指数富集技术(SELEX技术)是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合 化学技术，其运用大容量的随机寡核巧酸文库，结合体外PCR扩增技术，W指数富集与祀分 子特异结合的寡核巧酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核巧酸适配子 (aptamers)。该技术己成功运用于许多祀分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白 质、氨基酸W及各种细胞因子等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是通过系统进化指数富集技术(SELEX技术)筛选脑红蛋白的寡核巧 酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏度、高特异性的脑红蛋白早期检测及分离 纯化方法。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] 本发明中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文库及引物，由美国 111乂1*'〇旨611公司合成，两端为固定序列，中间为41个碱基的随机序列：5'- TGGACCATTACGATCAACTA(M1)TAACCCGATACGATTATCCA-3'，库容量为1014W上；
[0007] 引物 1:5 ' - TGGACCATTACGATCAACTA-3 ' ；
[000引 引物2:5 ' -TGGATAATCGTATCGGGTTA-3 '。
[0009] 人脑红蛋白根据(吴永红等，"重组人源脑红蛋白的高效表达、纯化及鉴定"，中国 生物工程杂志，2009，29 (9): 1~6)的方法制备获得；
[0010] GelRed核酸染料购于Bioti皿公司；
[0011] 硝酸纤维素滤膜购于美国密理博(Milli化re)公司；
[0012] 寡聚核巧酸的纯化试剂购于北京天为时代公司；
[0013] PCR试剂盒和T载体购于美国普洛麦格(ftOmega)公司。
[0014] -种亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于核巧酸序列为:SEQ ID N0:l-17任 一所示的DNA分子。
[0015] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于：具有相同功能的寡核巧酸适 配子同源序列占60%W上。
[0016] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于:衍生的RNA序列具有相同的功 能。
[0017] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于:为能与DNA序列进行杂交的寡 核巧酸序列。
[0018] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于:在核酸适配子的任何位置删 除或增加部分寡核巧酸残基所得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0019] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进 行核巧酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0020] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进 行憐酸化、甲基化、氨基、琉基、同位素、生物素、地高辛、巧光物质、纳米发光材料或酶标记 修饰后，得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0021 ] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子，其特征在于：用于人脑红蛋白的检测和分 离纯化，从而用于脑疾病的检测。
[0022] -种上述亲和人脑红蛋白核酸适配子的制备方法，按W下步骤进行：1)单链DNA随 机寡核巧酸文库的合成;2)利用系统进化指数富集方法对寡核巧酸文库进行筛选;3)扩增 与人白蛋白特异结合的寡核巧酸;4)进行下一轮筛选，经过12轮W上筛选后获得目的寡核 巧酸序列；5)克隆测序。
[0023] 本发明的优点是:具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤库、抗 体库和隧菌体表面展示文库相比，从寡核巧酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本身 是寡核巧酸，分子量较小，可W化学合成，节约成本;2)具有比抗体更高的亲和性和特异性； 3)便于标记且可W在不同部位有选择性的标记;4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高 溫和剧烈条件不敏感。因此，系统进化指数富集技术具有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1人脑红蛋白的制备
[0025] 根据(吴永红等，"重组人源脑红蛋白的高效表达、纯化及鉴定"，中国生物工程杂 志，2009，29 (9): 1~6)的方法制备获得人脑红蛋白，蛋白浓度为1 OOmg/mL。
[0026] 实施例2合成随机单链DNA文库和引物
[0027] 随机单链 DNA(ssDNA)文库：5'-TGGAccATTACGATCAACTA(N4 Dtaacccgata CGATTATCCA-3'，构建了长度为Slnt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为41个碱 基的随机序列，库容量为I014W上；引物l:5'-TGGACCATTACGATCAACTA-3' ；引物2:5'- TGGATAATCGTATCGGGTTA-3' ；将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100皿ol/L 胆存液_20°C胆存备用。
[00%]将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；W回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。7化g RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug人脑红蛋白蛋白，37°C解育30min， 反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素， 0.55mol/L醋酸锭，1.5mmol/L EDTA,0.15%SDS)中煮沸5min，离屯、，取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20iilDEPC水中；WRNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用 于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，W该双链DNA为模板体外转录出 RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 17个适配子，其序列分别为SEQ ID NO: 1-17所示。具 体序列如下所示：
[00 巧]NGB-I:TGGACCATTACGATCAACTATTCTCAACAACTCCAACTTGTCCCTACCAAATTCGTACTTTTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0030] NGB-2:TGGACCATTACGATCAACTAACAATATTCAAATTCTCTAAAACATCTTCCAATTCTCAATATA ACCCGATACGATTATCCA；
[0031] NGB-3:TGGACCATTACGATCAACTATTACACACAATCCTACCTATTTATCCCTACACATTCCCTCATA ACCCGATACGATTATCCA；
[0032] NGB-4:TGGACCATTACGATCAACTAACACACCAACCACTCCCTCTTCGCTTATTATCTCTACATATTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0033] NGB-5:TGGACCATTACGATCAACTAACGCTTTATTATCATAAATATACATAACACCCAACACCTCCTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0034] NGB-6:TGGACCATTACGATCAACTAATCGCTCAATACTCTGACCTATAATATAACGCTTACCTCCTTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0035] NGB-7:TGGACCATTACGATCAACTACTAATACAATTCGCTCTCCCATACACCGCCTAAATTCATAATA ACCCGATACGATTATCCA；
[0036] NGB-8:TGGACCATTACGATCAACTAACTCGCTATATCCTGATATCCCTAACCGTTATACCTATAACTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0037] NGB-9:TGGACCATTACGATCAACTATCATTTAATCAATACACATAGTATATATTCCGCCTACATTCTA ACCCGATACGATTATCCA；
[0038] NGB-IO:TGGACCATTACGATCAACTACATCGCTAATTAACATCCCATCTGCCCAAAATAATCTTATTT AACCCGATACGATTATCCA；
[OOW] NGB-。：TGGACCATTACGATCAACTATAGACATTGATCATCAGAATAACCCCAACTCCTCCCAATCTT AACCCGATACGATTATCCA；
[0040] NGB-I2:TGGACCATTACGATCAACTATAACACTAATTAATTAAATATACACACTCCTATACCAATATT AACCCGATACGATTATCCA；
[0041 ] NGB-13:TGGACCATTACGATCAACTAACATCAGCAATCTCTCGCATATCTTTCATCCCTTCATCATTT AACCCGATACGATTATCCA；
[0042] NGB-I4:TGGACCATTACGATCAACTAAATTCTATCCCAACGCTTACGCTTCCAAGAACATCTCCCTAT AACCCGATACGATTATCCA；
[0043] NGB-I5:TGGACCATTACGATCAACTACTATTGAACATATTAGATCCGCACAATCTTTGTACATATACT AACCCGATACGATTATCCA；
[0044] NGB-I6:TGGACCATTACGATCAACTAAAGATTATCCATAATGTTATAGTAACTCTGTAAACACTTTAT AACCCGATACGATTATCCA；
[0045] NGB-I7:TGGACCATTACGATCAACTAATAGATCATCCGCTTTAACCCCGATAACTCTAAACGACTAAT AACCCGATACGATTATCCA；
[0046] 实施例3蛋白结合适配子的性能测定
[0047] 将适配子分别取2.化g，用牛小肠碱性憐酸酶(CIP)37°C消化比，纯化回收去憐酸 化的RNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫 -32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。10皿〇1放射性 标记的适配子分别与不同浓度（l-200nM)的人脑红蛋白37°C解育30min，各组反应液经硝酸 纤维素膜滤过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行 做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
[0050] 实施例4所述适配子特异性分析W及稳定性分析[0051] 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，脑红蛋
[004引
[0049] 白，与17条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，运些适配子都不与运些蛋白相结 合，而只与人蛋白结合保持较高的特异性。
[0052] 将所述的适配子，取0.化g，分别置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通过RT- PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0053] 实施例5所述适配子疾病的诊断
[0054] 取8个老年性痴呆和脑梗塞患者和4个正常人的血液，使用生理盐水稀释，获得目 标样本。
[0055] 将17个偶联有标记的适配子分别与8个患者W及4个正常人的样本混合40min，通 过生物素分离，定量分析其中的人脑红蛋白的含量，通过分析发现，8个患者中脑红蛋白的 含量显著增加，超过了规定的阔值。达到了相应脑病的诊断标准。由此可见，其诊断效果较 好。
[0056] W上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于人脑疾病检测的试剂盒，其含有能特异性与人脑红蛋白结合的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQ ID No:6所述。
【文档编号】C12N15/115GK106018843SQ201610674175
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年11月29日
【发明人】卢美珍
【申请人】卢美珍