Ev71病毒 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一组肠道病毒71型（EV71)病毒VP1重组抗原及其单克隆抗体与应 用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Hand footmouthdisease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种全球性常 见的急性传染病。该病多发生于5岁以下儿童，主要表现为口痛、厌食、低热、手、足、口腔等 部位出现小疱瘆或小溃疡，少数患儿可引起心肌炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导 致死亡。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）。 目前国内爆发的手足口病以柯萨奇病毒A16型（CoxA16)和肠道病毒71型（EV71)引起 最为常见。CoxA16引起的手足口病一般症状较轻，容易自愈。感染EV71病症则相对较重， 20%患者可能出现重症炎症及伤害中枢系统造成后遗症。故早发现早诊断可有效降低该病 毒传播风险，并有助于患者得到及时治疗。因此，开发好研制有关EV71病毒检测试剂和方 法显得尤为重要。
[0003] 肠道病毒71型（EV71)于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴 儿粪便标本中分离出来。病毒基因组为单股正链RNA，全长约7. 5kb，编码含2194个氨基 酸的多聚蛋白。该蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3 3个前体蛋白；其中P1蛋白可分解为 VP1、VP2、VP3和VP4四个外壳蛋白。VP1、VP2、VP3暴露在病毒衣壳蛋白的表面，具有大量 抗原决定簇，而其中的VP1是最主要的衣壳蛋白，具有最多的特异性中和位点，因此，VP1蛋 白的编码基因序列与病毒血清具有较高的相关性，常被用于病毒的鉴定和进化分析。
[0004] 高相关的EV71病毒抗原和抗体是EV71病毒检测试剂制备的关键。近年来，基因 工程的发展为研制EV71病毒抗原和抗体提供了良好基础。故加强研制EV71病毒VP1特异 性抗原和其单克隆抗体，对开发更加有效的早期诊断EV71的方法和试剂盒具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一组EV71病毒VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用。
[0006] 本发明所述的EV71病毒VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQID No. 1~SEQIDNo. 11所示的11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中， 所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述11种氨基酸序列分别 与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
[0007] 进一步的，所述重组抗原有11种，其编号为EV71VP1 1号~EV71VP1 11号，其中 ￡￥71￥?11号~￡￥71￥?111号重组抗原的核苷酸序列由5￡〇10吣.12~5￡〇10吣.22 所示。
[0008] 基于对手足口病不同疫区的EV71病毒的研宄，本发明进一步综合分析了国内外 有关EV71的文献，确定了EV71的VP1蛋白作为抗原靶位的主要研宄对象。通过多种生物 信息学数据库及生物信息学软件对VP1基因及其编码蛋白序列对比分析，考虑氨基酸序列 亲水性，对VP1抗原表位预测，筛选得到上述EV71病毒11种潜在高交叉反应性的线性亲水 表位氨基酸序列，合成基因重组表达，并经过实验验证具有高交叉反应，其氨基酸序列具体 为：
[0009] VP1(10-20AA)SEQIDNOl :SSI⑶SVSRAL
[0010] VP1(25-40AA)SEQIDN02 ：PAPTGQNTQVSSHRLD
[0011] VP1(51-65AA)SEQIDN03 ：EIGASSNASDESMIE
[0012] VP1 (105-119AA)SEQIDN04 ：GYANWDIDITGYAQM
[0013] VP1(119-133AA)SEQIDN05 ：MRRKVELFTYMRFDA
[0014] VP1(137-150AA)SEQIDN06 ：FVACTPTGEVVPQL
[0015] VP1(161-180AA)SEQIDN07 ：PKPDSRESLAWQTATNPSVF
[0016] VP1(206-224AA)SEQIDN08：DGYPTFGEHKQEKDLEYGA
[0017] VP1(231-245AA)SEQIDN09：GTFSVRTVRDLQVQV
[0018] VP1(255-269AA)SEQIDN010：MKHVRAWIPRPMRNQ
[0019] VP1(270-284AA)SEQIDN011：NYLFKANPNYAGNSI
[0020] 利用基因重组方法，将上述各线性表位氨基酸序列分别加入柔性短肽并连接在一 起，可以获得具有高交叉反应的融合VP1重组抗原，即EV71病毒VP1重组抗原。
[0021] 本发明还提供了一组抗体，其特征在于：所述抗体是能与上述EV71病毒VP1重组 抗原特异性结合的单克隆抗体。
[0022] 将上述EV71病毒VP1重组抗原蛋白免疫小鼠（注射小鼠），经常规单克隆抗体制 备方法，纯化分离，即可制备出上述重组抗原特异性结合的单克隆抗体。
[0023] 本发明所述EV71病毒VP1重组抗原在制备EV71病毒抗原或抗体检测试剂盒中的 应用。
[0024] 本发明所述EV71病毒VP1特异性抗原和其单克隆抗体，可以用于开发体外检测样 品中是否存在抗EV71病毒抗体的试剂盒或作为其他EV71检测产品的重要原料。或者，可 以用于开发体外检测样品中是否存在EV71病毒抗原的试剂盒或作为其他EV71检测产品的 重要原料。对开发更加有效的早期诊断EV71的方法和试剂盒提供了基础。
[0025] 与现有技术比，本发明技术具有以下特点：
[0026] 1筛选得到的VP1抗原是线性亲水表位，易于与患者血清中抗EV71病毒抗体发生 特异性结合反应。运用本发明的特异性重组蛋白可用于免疫于兔、鼠等动物，制备单克隆抗 体。
[0027] 2本发明得到的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备 (如杂交瘤技术），亦可以通过小抗体技术制备Fab段。
[0028] 3本发明的重组抗原蛋白和抗体是高特异性、高灵敏度的优质生物原料，均可以直 接用于检测人血清中EV71病毒或抗EV71抗体，从而有利于EV71病毒感染早期筛查。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明范围。若未特别指明，实施例中 所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0030] 实施例1 :候选抗原表位的选择
[0031] 通过查找NCBI(美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， 对EV71 3种基因型的共70条EV71序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分筛选 出11条各基因型序列保守的线性表位抗原序列。其氨基酸序列分别如表1所示。
[0032] 表1本发明筛选出的11条EV71VP1线性抗原表位抗原序列
[0033]
【主权项】
1. 一组EV71病毒VPl重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 11所示的11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中，所述柔性短肽 氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨 基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
2. 如权利要求1所述EV71病毒VPl重组抗原，其特征在于：所述重组抗原有11种，其 编号为EV71 VPl 1号~EV71 VPl 11号，其中EV71 VPl 1号~EV71 VPl 11号重组抗原 的核苷酸序列由SEQ ID No. 12~SEQ ID No. 22所示。
3. -组抗体，其特征在于：所述抗体是能与权利要求2所述EV71病毒VPl重组抗原特 异性结合的单克隆抗体。
4. 权利要求1或2所述EV71病毒VPl重组抗原在制备EV71病毒抗原或抗体检测试剂 盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一组EV71病毒VP1重组抗原，是由SEQ ID No.1～SEQ ID No.11所示的11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得。本发明还公开了能与所述EV71病毒VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体，以及所述抗原在制备EV71病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。本发明提供的重组抗原和单克隆抗体具有高灵敏度、高特异性等特点，是可以作为研制EV71病毒检测试剂的关键原料。
【IPC分类】C07K14-085, G01N33-569, C07K16-10, G01N33-68
【公开号】CN104650195
【申请号】CN201510102558
【发明人】盖中涛
【申请人】盖中涛
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月9日