专利名称：肝炎病毒多项免疫标志一孔测定法的制作方法
技术领域：
本发明属于肝炎病毒免疫标志的酶免疫方法。
肝炎病毒的免疫标志主要有抗HAV(抗Hepatitis A virus，甲肝病毒抗体)、HBsAg(Hepatitis B surface Antigen，乙肝病毒表面抗原)、HBeAg(Hepatitis B e Antigen，乙肝病毒e抗原)、抗HBc(抗Hepatitis B core，乙肝病毒表面抗体)、抗HBe(抗Hepatitis B e，乙肝病毒e抗体)、抗HCV(抗Hepatitis C virus，丙肝病毒抗体)。这些病毒免疫标志经常采用酶联免疫吸附试验检查。但这种酶免疫方法要使用多孔的酶标反应板，每孔只能检查一个免疫标志，使用上很不方便。
本发明的目的在于提供一种在酶标反应板一孔中通过一次操作，即能同时显示两项或两项以上肝炎病毒免疫标志的快速简便的测定方法。
本发明的另一目的在于提供一种相应于上述肝炎病毒免疫标志测定方法的酶标反应板。
通常的酶免疫吸附试验法测定肝炎的免疫标志主要应用夹心法和竞争法两种，检查乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，乙肝病毒表面抗体(抗HBs)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)应用的是夹心法，存在免疫标志时显色;反之，不显色。乙肝病毒e抗体(抗HBe)和乙肝病毒核心抗体(抗HBc)采用的是竞争法，待检抗体阳性时不显色，否则显色。这种酶免疫法先要将抗原或抗体包被(即吸附)在酶标反应板孔中，待检血清中存在相对应的抗体或抗原时，就通过抗原、抗体间的反应结合到反应板上。然后同时加入的辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase简写为HRP)标记的抗原或抗体，通过待检血清中的抗体或抗原结合到酶标反应板上(夹心法)，或受血清中抗体的竞争不能结合到板上(竞争法)，再加酶的底物溶液后，酶催化底物而显色，从而确定待检血清中是否存在抗原或抗体。由于抗原与相应抗体会起反应，酶标HBsAg和酶标抗HBs不能处于同一溶液中。因此，反应板上的同一个孔中只能测定一个免疫标志，各种酶标物需要分隔存放。但经发明人研究证实，若将酶标板的每个孔分隔为2-5个小孔，各小孔中分别包被不同的抗原或抗体，则它们之间不会相互干扰影响，待检血清中的各种肝炎病毒免疫标志会分别与小孔中包被的抗原或抗体相结合。并且，同一溶液中的酶标记物抗HBs-HRP，抗HBe-HRP和抗HBc-HRP不会相互反应。这种酶标记物混合液加入大孔中，又可各自与小孔中的抗原、抗体相结合。因此，可以通过加一次血样和一次酶结合物，在一个大孔中能同时显示肝炎病毒的多项免疫标志。
本发明将酶标反应板设计成下述形状(如附
图1-7所示)，一般长度为110-140mm，宽度为45-70mm，厚度为10-15mm，可安排4×10个大孔。实际上其大小及大孔数不受限制。关键是对大孔的设计。大孔(1)直径一般为6-12mm，孔深10-14mm，将每个大孔分隔为2-5个小孔，每个小孔(2)底面积为5-15mm2，分隔层(3)高度为5-8mm，厚度为0.7-1.1mm。图1为酶标反应板的结构示意图。图2、图3为将大孔分隔为2个小孔的示意图。图4、图5为将大孔分隔为3个小孔的一种结构示意图。图6、图7为将大孔分隔为5个小孔的一种结构示意图。本发明提出的测定肝炎病毒免疫标志的步骤如下在每个大孔的2-5个分隔小孔中分别包被不同的肝炎病毒免疫标志，即分别包被不同的抗原或抗体，包被物浓度为0.5-20ug/ml，反应条件一般为39℃±3℃，2-5小时，或者在6℃±2℃，15-48小时。试验时，对每个大孔中分别加待检血清，一般为0.05-0.2ml即可，同时各大孔中加入相应于小孔中包被的抗原或抗体的酶标记物的混合液0.1-0.3ml，在39℃±3℃中反应30-60分钟。然后去除孔中液体。并用洗涤液洗去未结合物，加上四甲基联苯胺(TMB)底物系统。一般每小孔中45-55ul，10分钟左右后即在一个大孔中显示待检血清各项免疫标志的阴性或阳性结果。
在本发明提出的方法中，只要在酶标反应板的大孔的分隔小孔中任意选定包被物，并加入相对应的酶标记物的混合液，可以测定肝炎病毒免疫标志任意组合成的两项以上的免疫标志。下面是各种常用组合的举例如果在酶标反应板的一个大孔中的分隔小孔中分别包被抗HBs、抗HBe、HBcAg，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP、抗HBc-HRP酶标记物混合液，可以测定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎核心抗体(抗HBc)三个免疫标志。
如果在酶标反应板的一个大孔的分隔小孔中分别包被HBsAg和HBeAg，则在酶标记物反应步骤中加入相应的HBsAg-HRP和抗HBe-HRP酶标记物混合液，可以测定乙型肝炎表面抗体(抗HBs)和乙型肝炎e抗体(抗HBe)两个肝炎免疫标志。
如果在酶标反应板的一个大孔的分隔小孔中分别包被抗HBs、HBsAg、抗HBe、HBeAg和HBcAg，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP酶标记物混合液，可以测定HBsAg、HBeAg、抗HBc、抗HBs和抗HBe五项免疫标志。
如果在酶标反应板的一个大孔的分隔小孔中分别包被抗HBs和HCV抗原，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP和抗人IgG-HRP(抗人免疫球蛋白G酶标物)或HCV-HRP(丙肝病毒抗原酶标物)酶标记物混合液，可以测定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)。
如果在酶标反应板的一个大孔的分隔小孔中分别包被抗HBs，抗HBe和HCV抗原，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗人IgG-HRP(或HCV-HRP)的酶标记物混合液，可以测定HBsAg、HBeAg和抗HCV。
如果在酶标反应板的一个大孔的分隔小孔中分别包被HBs，抗HBe和HAV抗原，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗u-HRP(抗人u链酶标物)酶标记物混合液，可以测定HBsAg、HBeAg及甲型肝炎病毒抗体(抗HAV)(IgM)。
本发明与通常的测定方法相比，工作效率提高2-4倍，血清用量也为减少。按通常方法，乙肝病毒的五项免疫标志的测定，每份血清需同时加5次，在5个孔中反应，一次血清用量为0.5ml，酶标记物也加5次，分别在各个孔中反应。本发明可以将5个免疫标志在1个(或2个)孔中测定，加血清和酶标记物各1次(或2次)可同时显示5个乙肝免疫标志的结果。对其它肝炎病毒免疫标志的混合检测，工作效率同样明显提高，血清用量相应减少。
图1为酶标反应板(条)的结构示意2为酶标反应板(条)上大孔分隔成2个小孔的结构侧视图。
图3为酶标反应板(条)上大孔分隔成2个小孔的结构俯视图。
图4为酶标反应板(条)上大孔分隔成3个小孔的结构侧视图。
图5为酶标反应板(条)上大孔分隔成3个小孔的结构俯视图。
图6为酶标反应板(条)上大孔分隔成5个小孔的结构侧视图。
图7为酶标反应板(条)上大孔分隔成5个小孔的结构俯视图。
实施例1在1孔3间隔小孔中同时包被抗HBe，抗HBs和HBcAg，加入含HBeAg、HBsAg和抗HBc同时阳性的血清0.2ml，同时加抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP混合液0.1ml，37℃温箱中反应1小时，加TMB底物液后孔中3间隔小孔中均呈现阳性结果。
实施例2在1孔2间隔小孔中，同时包被HBsAg和HBeAg，加入含抗HBs和抗HBe同时阳性的血清(或抗HBs阳性血清中加已知的抗HBe阳性血清)0.2ml，同时加HBsAg-HRP和抗HBe-HRP混合液0.1ml，37℃温箱中反应1小时，加TMB底物液后孔中2间隔区，测抗HBs的小孔显色，而测抗HBe的小孔为无色，即两个孔均显示阳性结果。
实施例3在酶标反应板各小孔中分别包被抗HBs，HBsAg，抗HBe，HBeAg和HBcAg加HBsAg，HBeAg，抗HBc阳性血清0.2ml，37℃中反应1小时，加TMB底物系统，结果上述各包被小孔中分别为显色、显色、显色、显色和无色，即检测结果为HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性，而抗HBs和抗HBe为阴性。在上述包被孔中加抗HBs和抗HBe阳性血清，同时加上述酶标记物混合液后，底物系统显色次序为无色、无色、无色、无色和显色，即检测结果为抗HBs和抗HBe阳性。
实施例4
在酶标反应板各小孔中分别包被抗HBs和HCV抗原，加HBsAg和抗HCV的阳性血清0.1-0.2ml。同时加抗HBs-HRP和HCV-HRP混合液0.1-0.2ml，37℃中反应1小时，加TMB底物后2个小孔中分别显色，即检测结果为HBsAg阳性和抗HCV阳性。
实施例5在酶标反应板各小孔中分别包被抗HBs和HAV抗原，加HBsAg和抗HAV阳性血清0.1-0.2ml，同时加抗HBs-HRP和抗人u-HRP混合液0.1-0.2ml，37℃反应1小时后加TMB底物液，2个小孔中均显色，示HBsAg和抗HAV均为阳性。
权利要求
1.一种肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在酶标反应板的每个大孔的2-5个分隔小孔中分别包被不同的肝炎病毒免疫标志，其浓度为0.5-20ug/ml，反应条件为在39±3℃，2-5小时，或者6±2℃，15-48小时，对每个大孔中分别加入待检血清0.05-0.2ml，同时在各大孔中加入相应于分隔小孔中包被的肝炎病毒免疫标志的酶标记物的混合液0.1-0.3ml，在39±3℃中反应30-60分钟，然后除去孔中液体，每小孔中加上四甲基联苯胺底物系统45-55ul，10分钟后即在一个大孔中显示待检血清各项免疫标志的阴性或阳性结果。
2.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板的大孔中的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为抗HBs、抗HBe、HBcAg，则在大孔中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP、抗HBc-HRP酶标记物混合液以测定HBsAg、HBeAg抗HBc三个肝炎免疫标志。
3.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板的大孔的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为HBsAg和HBeAg，则在大孔中加入相应的HBsAg-HRP和抗HBe-HRP酶标记物的混合液，以测定抗HBs和抗HBe两个肝炎免疫标志。
4.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板大孔的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为抗HBs、HBsAg、抗HBe、HBeAg和HBcAg，则在大孔中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP酶标记物混合液，以测定HBsAg、HBeAg、抗HBc、抗HBs和抗HBe五项肝炎病毒免疫标志。
5.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板大孔的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为抗HBs和HCV抗原，则在大孔中加入相应的抗HBs-HRP和抗人IgG酶标记物(或HCV-HRP)混合液，以测定HBsAg和抗HCV。
6.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板的大孔的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为抗HBs、抗HBe和HCV抗原，则在大孔中加入相应的抗HBs-HRP，抗HBe-HRP和抗人IgG-HRP(或HCV-HRP)酶标记物混合液，以测定HBsAg、HBeAg和抗HCV。
7.根据权利要求1所述的肝炎病毒免疫标志的测定方法，其特征在于，酶标反应板大孔的分隔小孔中分别包被的肝炎病毒标志为抗HBs、抗HBe和HAV抗原，则在大孔中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗u-HRP酶标记物混合液，以测定HBsAg、HBeAg及抗HAV(IgM)。
8.一种用于测定肝炎病毒免疫标志的酶标反应板，厚度为10-15mm，其上开有直径为6-12mm、孔深为10-14mm的大孔，其特征在于该大孔被分隔为2-5个小孔，小孔的底面积为5-15mm2，分隔层高度为5-8mm，厚度为0.7-1.1mm。
全文摘要
最常用的肝炎病毒免疫标志有HBsAg，抗HBs，HBeAg，抗HBe，抗HAV，抗HCV，实验方法为反应板孔的酶免疫法，现用的检测方法每孔只能显示离体的(抽取的)血清中的一个肝炎病毒免疫标志。本发明将反应板孔按实际需要分为2—5个小孔，分别包被有不同的抗原和抗体，在加待检血清后，同时加入相应的酶标记混合液，经37℃—43℃中反应1小时，用TBM底物系统显色，可以通过一次操作，在同一孔中同时测定两个以上肝炎病毒免疫标志，比常规操作方法功效提高1—4倍。
文档编号G01N33/576GK1098201SQ93112309
公开日1995年2月1日 申请日期1993年1月12日 优先权日1993年1月12日
发明者程振球 申请人:中国人民解放军海军医学研究所