一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用的制作方法

一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒及检测方法，选取鼠肝炎病毒主要亚型的共同特有的核酸恒定区而设计特异性核酸探针，选取6种鼠肝炎病毒的主要亚型(MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)的共同特有的结构蛋白S稳定区S2基因序列设计引物。采用一步法反转录聚合酶链式反应技术对鼠肝炎病毒的核酸进行检测；通过基因克隆和表达而生物合成鼠肝炎病毒的S2蛋白，并利用此特异性抗原筛选噬菌体抗体库，获得相应的单克隆抗体。在此基础上,利用酶联免疫吸附技术检测鼠肝炎病毒的抗原和鼠自身产生的抗体。本发明的复合型试剂盒及其检测方法，具有检测结果准确、灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便等特点。
【专利说明】一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测【技术领域】，特别涉及一种鼠肝炎病毒复合型检测试剂盒和检 测方法。

【背景技术】
[0002] 鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV，学术上又称为 Murinecoronavirus) 属冠状病毒科，是一种核糖核酸（RNA)正向病毒，核酸由单股RNA构成，其大小因动物来源 不同有些差别，一般直径约为80nm-16〇 nm，有很多毒株型。根据鼠肝炎病毒嗜组织特性的 不同，可将其分为呼吸株和嗜肠株两型。呼吸株病毒在易感动物的鼻腔上皮细胞内复制后， 可向多种靶器官扩散，常见型病毒包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM、MHV-S和MHV-A59等。嗜肠 株病毒选择性地感染小肠黏膜，极少扩散到其他组织，此型病毒包括MHV-Y、MHV-RI和DVM 等（殷震等，1997;六.￥_016(1]1；[116七31，2006;!1011^6找61?1?6七31，1997;]^〇；1：;[0!1;^&110 et al，20l3;Casebolt D B et al，1997)。鼠肝炎病毒包裹着由核衣壳蛋白N与单链基因 组RNA复合体组成的核衣壳，膜上结合着三种结构糖蛋白，分别为刺突蛋白S、膜蛋白Μ和小 分子外膜蛋白Ε。在嗜神经毒株MHV-JHM的被膜上还有血凝素酯酶HE。鼠肝炎病毒侵入宿 主后，可以刺激机体产生抗体。
[0003] 鼠肝炎病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发 现等特点。鼠肝炎病毒极易感染小鼠，严重鼠肝炎病毒感染可在数周之内摧毁小鼠群，并可 能需要数年才能恢复。据在1982年血清流行病学调查，我国小鼠群中鼠肝炎的感染率为 20% -100% (孙靖，2004)。
[0004] 鼠肝炎病毒可以通过空气和直接接触传播，已感染鼠肝炎病毒鼠的排泄物和其污 染的物品很容易感染健康鼠。鼠肝炎病毒也可垂直传播。小鼠一旦感染后，很难在种群中 根除，因此鼠肝炎病毒的检测非常重要。目前，小鼠肝炎病毒呈世界性分布，在中国的小鼠 群中广泛流行。通常情况下，鼠肝炎病毒感染小鼠后，多数带病毒小鼠呈隐性、亚临床或慢 性感染，不易察觉，为鼠肝炎病毒的检测增加了难度。
[0005] 由于鼠肝炎病毒侵入实验类鼠群后，会改变各种免疫应答参数，严重影响实验小 鼠的质量和科学研究的准确性，不利于科学研究的开展。并且鼠肝炎病毒具有传染性强、传 播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发现、危害严重等特点，因此快速、高效和 方便的鼠肝炎检测病毒发法尤其重要。
[0006]目前，检测鼠肝炎病毒感染的依赖于血清学测定法，病理组织学，电子显微镜以及 分子技术。目前市场上常用血清学检测方法有酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验等， 由于各株抗原的差异，虽实践中使用了多价抗原检测法，但依然对不同亚型的鼠肝炎病毒 不能统一检测，仍需用不同的检测试剂，这样不仅花费大、耗时长，而且严重影响科学研究 的正常进行。另外，近年来市场上使用的鼠肝炎病毒核酸检测盒，其主要方法是通过病毒 核酸的反转录聚合酶链式反应来检测病毒类型的存在，该类检测盒虽可以在样本量很少的 情况下进行鼠肝炎病毒检测，但因病毒核酸变异快，亚类型多，检测盒仅能检测部分病毒类 型，由于反转录聚合酶链式反应所需探针的序列、敏感性及热循环程度等不同导致结果不 同，导致检测阳性率低和假阳性的存在，所得结果仍需要相互确证。因此，有必要在本领域 中建立快速，有效和可靠的监测和检测鼠肝炎病毒的方法。不仅对提高实验动物质量具有 重要意义，同时对于新型冠状病毒的研究也会有一定的帮助。


【发明内容】

[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的缺陷，提供一种克服单一的聚 合酶链式反应（PCR)方法所存在的不能统一检测和假阳性率较高等问题，具有高度的特异 性、灵敏性与准确性，且技术操作简便的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂 盒，该试剂盒含有：
[0009] ⑴一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)试剂，其中包括无核糖核酸酶去离子 水、焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、酶混合液、磷酸盐缓冲液（PBS)、阳性对照品、阴 性对照品、鼠肝炎病毒探针I、探针II、探针III ;
[0010] 鼠肝炎病毒探针I如序列表中的SEQ ID NO. 1所示： 5' -GAGGATTACCATACACTAAC-3'；
[0011] 鼠肝炎病毒探针II如序列表中的SEQ ID NO. 2所示： 5; -AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3'；
[0012] 鼠肝炎病毒探针III如序列表中的SEQ ID NO. 3所示： 5 / _TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3/ ;
[0013] 所述的探针是通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获得鼠肝炎病毒目前 流行的6种已知主要亚型（MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)共同特有的恒定区连续性 核酸序列为依据；探针I和探针II取自该6种亚型共同的膜蛋白基因序列，探针III取自该6 种亚型共同的核蛋白基因序列；由上海英骏生物技术有限公司合成；
[0014] 酶混合液，包含莫洛尼氏鼠白血病毒（M-MLV)反转录酶和脱氧核糖核酸（DNA)聚 合酶，两种酶混合的酶单位比例为1 :1. 5 ;
[0015] 磷酸盐缓冲液，成分为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、l〇mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二 氢钾，pH为7. 4;
[0016] 阳性对照品（RT-PCR-CK+)，为含有MHV核酸的样品稀释液；
[0017] 阴性对照品（RT-PCR-CK )，为不含MHV核酸的样品稀释液；
[0018] (2)应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用S2抗体检 测的阳性对照（KTJ-CK+)、应用S2抗体检测的阴性对照（KTJ-CK-)、S2抗体；
[0019] 应用S2抗体检测的阳性对照（KTJ-CK+)，为经试验检测含有MHV抗原S2的稀释 液；
[0020] 应用S2抗体检测的阴性对照（KTJ-CK-)，为经试验检测不含MHV抗原S2的稀释 液；
[0021] S2抗体为抗原蛋白S2通过噬菌体抗体库筛选后生产获得的单克隆抗体；
[0022] (3)应用抗原S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括酶联免 疫吸附试剂盒包括应用抗原S2检测的阳性对照（KYJ-CK+)、应用抗原S 2检测的阴性对照 (KYJ-CK-)、S2蛋白稀释液；
[0023] 应用抗原S2检测的阳性对照（KYJ-CK+),为经试验检测含有MHV的S2抗体的稀释 液；
[0024] 应用抗原S2检测的阴性对照（KYJ-CK-)为经试验检测不含MHV的S2抗体的稀释 液；
[0025] S2蛋白稀释液为通过基因工程技术获得的S2重组蛋白，由大肠杆菌BL21 (DE3)表 达后纯化获得；
[0026] (4)包被液，成分为137禮氯化钠、2.7raM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢 钾，pH 为 7.4 ;
[0027] (5)洗涤液，包括洗涤液I和洗涤液II ;所述洗涤液I成分为137mM氯化钠、2. 7mM 氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾，pH为7. 4 ;所述洗漆液II成分为137mM氯化钠、 2. 7raM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氧钾，加 0· 1% Tween-20，pH 为 7· 4,0· 45μηι 滤 膜过滤除菌；
[0028] (6)封闭液，为5g的脱脂奶粉溶于100ml包被液；
[0029] (7)辣根过氧化酶-蛋白A偶联物，为使用辣根过氧化酶标记的蛋白A ;
[0030] ⑶酶反应底物，包括酶反应底物A、酶反应底物B和酶反应底物C ;所述酶反应底 物A成分为5mg/ml乙二胺四乙酸二钠，其中溶剂为二甲基亚砜；所述酶反应底物B成分为 质量分数〇. 34%冰乙酸，0. 23M醋酸钠，pH为5. 0 ;所述酶反应底物C成分为质量分数30% 双氧水；酶反应底物A、酶反应底物B和酶反应底物C需要新鲜配置，配置时底物酶反应A和 酶反应B按照1 :50比例混合，然后加入质量分数1%。酶反应底物C混匀；
[0031] ⑶终止液，为2M硫酸；
[0032] (10)脱氧核糖核酸（DNA)酶I ;
[0033] (11)肝素。
[0034] 本发明实施例还提供利用所述的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒的检测方法，包括 下列步骤：
[0035] (1)采集样品以及对样品进行预处理：
[0036] 采集组织或待检测标本，取自鼠尾或鼠背部静脉血液、唾液、粪便、鼠笼架擦拭物 和鼠笼内饮用水等；
[0037] 血液的采集及预处理，从鼠尾或鼠背部静脉收集5-10 μ 1血液到含有5-10单位肝 素（抗凝剂）和1单位/毫升DNA酶I的50 μ 1 PBS溶液内；
[0038] 唾液的采集及预处理，收集5-10 μ 1唾液并稀释到含有1单位/毫升DNA酶I的 50μ 1 PBS溶液中；
[0039]鼠便的采集及预处理，收集10mg鼠便，并溶解于5倍体积（W/V)含有1单位/毫 升DNA酶I的PBS中，在3000g下离心15分钟，然后收集上清液，并调节pH到7. 0-7. 4 ;
[0040] 鼠笼架表面擦拭物采集及预处理，用微湿棉签擦拭鼠笼架表面，然后将微湿棉浸 入含有1单位/毫升DNA酶I的500 μ 1 PBS的1. 5ml试管中并静置20分钟，在3000g下 离心15分钟，保留上清液；
[0041] 鼠饮用水的采集及预处理，收集500 μ 1鼠笼内饮用水，并溶于含有1单位/毫升 DNA酶I的500 μ 1 PBS的1. 5ml试管内，并静置20分钟，在3000g下离心10分钟，保留上 清液；
[0042] (2) -步法RT-PCR检测鼠肝炎病毒的核酸：
[0043] 将经过预处理样品加入核酸扩增反应管，5〇 μ 1反转录体系包括：混合经预处理 的待测样品5μ1和45μ1反应混合液，内含10Μ鼠肝炎病毒探针I 1μ1、10Μ鼠肝炎病 毒探针II 1μ 1、1〇μΜ鼠肝炎病毒探针ΙΙ?2μ l、10mM焦磷酸核苷酸混合物ιμ 1、酶混合液 1μ 1、五倍反应缓冲液5μ 1、无 RNA酶去离子水34μ 1。具体操作过程中，可将除5μ 1样品 外的其他PCR体系中其它反应物先配成混合液，然后再直接加入5 μ 1样品；反应条件：扩 增条件：58t； 30min，94°C 5min 预变性，然后 94°C 3〇sec，55°C 3〇sec，72°C lmin 3〇SeC，30 个循环，最后72°C 10min，4°C保温；
[0044] 以鼠肝炎病毒探针I作为正向引物和鼠肝炎病毒探针III作为反向引物进行PCR 得到的基因大小为400bp，以鼠肝炎病毒探针II作为正向引物和鼠肝炎病毒探针III作为反 向引物进行PCR得到的基因大小为240bp，经琼脂糖凝胶电泳检测观察是在400bp和270bp 处有明显条带，若同时有这两种条带，则判定为MHV阳性，若只有其中一种条带或两种条带 都没有，则判定为MHV阴性；
[0045] (3)快速间接酶联免疫吸附法检测检测鼠肝炎病毒的抗原：
[0046] a、编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照1孔、阳性对照1孔；
[0047] b、包被：分别在聚苯乙烯微孔板条的阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 (标准品）100 U 1，然后在待测样品孔依次加入包被液8〇 w 1，待测样品20 u 1，37 C温育2 小时；
[0048] c、用200 μ 1洗涤液I洗涤三次，每次3分钟，然后加入100 μ 1用洗涤液I按1 : 4000的S2单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时；
[0049] d、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤两次，每次3分钟，然 后加入100 μ 1用洗涤液I按1 :6000稀释的辣根过氧化酶-蛋白Α偶联物，室温缓缓摇动 1小时；
[0050] e、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤两次，每次3分钟，力口 入100μ 1酶反应底物，避光静置l〇_2〇min，显色后呈蓝色；
[0051] f、显色结束后加入100 μ 1终止液终止，用酶标仪在450M1波长下测定吸光度（0D 值）；
[0052] g、分析结果
[0053] 结果判定标准：
[0054] 试验有效性：阳性对照孔平均值> 〇. 8 ;阴性对照平均值彡0· 1 ;
[0055] 临界值：临界值=阴性对照孔平均值+〇· 1 ;
[0056] 阴性判定：样品0D值〈临界值者为MH阴性；
[0057] 阳性判定：样品0D值彡临界值者为MHV阳性；
[0058] (4)快速双抗体夹心酶联免疫吸附法检测检测鼠肝炎病毒的抗体：
[0059] a、编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照1孔、阳性对照1孔；
[0060] b、包被：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照（标准品）i〇〇yl。然 后在待测样品孔先加包被液8〇 μ 1，然后再加待测样品20 μ l，37°c温育2小时；
[0061] C、用200 μ 1洗涤液I洗涤三次，每次3分钟，然后加入100 μ 1用洗涤液I按1: 2000的S2抗原，室温缓缓摇动1小时；
[0062] d、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，每次3分钟，然后加入100 μ 1用洗涤液I按1 : 2000稀释的S2蛋白特异性单克隆抗体偶联物，室温缓缓摇动1小时；
[0063] e、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤两次，每次3分钟，然 后加入100 μ 1用洗涤液I按1 :6000稀释的辣根过氧化酶-蛋白Α偶联物，室温缓缓摇动 1小时；
[0064] f、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤两次，每次3分钟，力口 入100μ 1酶反应底物，避光静置10-30min,显色后呈蓝色；
[0065] g、显色结束后加入100 μ 1终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（0D 值）；
[0066] h、分析结果
[0067] 结果判定标准：
[0068] 试验有效性：阳性对照孔平均值彡0. 8 ;阴性对照平均值彡0· 1 ;
[0069] 临界值：临界值=阴性对照孔平均值+〇. 1 ;
[0070] 阴性判定：样品0D值〈临界值者为MHV阴性；
[0071] 阳性判定：样品0D值彡临界值者为MHV阳性。
[0072] (5)结果分析判断：
[0073] 当一步法RT-PCT检测结果为阳性时，若间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法 酶联免疫吸附检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阳性，样品属MHV感染前早期，体内MHV 量极少，且尚无 S2抗体产生；若间接法酶联免疫吸附检测结果为阳性且夹心法酶联免疫吸 附检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阳性，样品属于MHV感染初期，体内MHV有一定积 累，但暂无 S2抗体产生；若间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法酶联免疫吸附检测结果 均为阳性时，说明样品为MHV阳性，样品属于MHV感染中后期，体内有抗原蛋白S2,且产生了 S2抗体；当一步法RT-PCT检测结果、间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法酶联免疫吸附 检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阴性。
[0074] 本发明的有益效果是：本发明的复合型试剂盒利用一步法RT-PCR技术，快速间接 酶联免疫吸附技术和快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术，三种方法互相配合，分别针对鼠 肝炎病毒的核酸颗粒和其在侵染宿主过程中产生的抗原抗体标志物进行快速、准确和系统 检测。
[0075] 在上述技术方案的基础上，本发明还做了如下改进：
[0076] 根据小鼠肝炎病毒株的基因组恒定区域设计和合成的核酸探针，用探针通过检测 MHV核酸从而检测鼠体内和周围环境病毒颗粒的存在；
[0077] 根据小鼠肝炎病毒株外膜刺状蛋白S基因组保守区域设计并合成了病毒抗原蛋 白S2,用该抗原蛋白检测病毒感染鼠自身产生的抗体以检测感染鼠的免疫反应水平和可能 感染；
[0078] 用上述共同抗原蛋白S2蛋白通过筛选噬菌体抗体库筛选到特异性S2单克隆抗 体，并用该抗体检测鼠体内和周围环境中是否存在MHV颗粒；
[0079] 本发明进一步发展了直接应用粗提样本进行反转录聚合酶链式反应反应、S2蛋白 特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术和抗原蛋白S2检测实验 鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术。在酶联免疫吸附技术中使用了用辣根 过氧化酶标记的蛋白A(HRP-Pr〇teiriA)代替酶联免疫吸附试验中的酶标二抗，使病毒检测 试剂的应用更简单快捷、成本更低，易于大规模推广和应用。
[00S0]本发明所涉及的复合型试剂盒及检测方法也为其他类型的病毒的检测提供了思 路，因此如果将本发明所述的试剂盒及检测方法用于其他病毒的检测也属于本发明的保护 范围。
[0081] 本说明书中所涉及的溶液无特别说明溶剂成分时，溶剂均为水。

【专利附图】

【附图说明】
[0082]图1为利用本发明的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒的过程。编号1代表鼠肝炎病 毒MHV核酸；编号2代表鼠肝炎病毒MHV外膜s蛋白；编号3带表小鼠血液样本；编号a代 表一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测MHV核酸的过程；编号b代表应用S2抗体 的快速间接酶联免疫吸附技术检测MHV外膜蛋白S的过程；编号c代表应用抗原蛋白S2的 快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测小鼠血液的过程。
[0083] 图2为本发明本发明一步法反转录聚合酶链式反应（RT-pCR)的电泳结果图：M 为Marker，购买于宝生物工程（大连）有限公司（Marker中的条带从上到下大小依次为 100(^口、70(?^、50(^口、40(^口、30(^口、20(^?和10(^口）；编号1-10为一步法1^-?0?检测鼠血 液样本的实验结果，其中编号1为阳性对照，编号2为阴性对照，编号3为实验组1中的1 只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，编号4和编号5分别为实验组1中的2只新感染的具有 正常免疫功能的鼠血液，编号6为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，编号7 和编号8分别为实验组2中的2只新感染的严重联合性免疫缺陷（SCID)鼠血液，编号9和 编号10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠血液；编号11-20为一步法RT-PCR检测 鼠唾液样本的实验结果，其中编号η为阳性对照，编号 12为阴性对照，编号13为实验组1 中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液，编号14和编号15分别为实验组1中的2只新感 染的具有正常免疫功能的鼠唾液，编号16为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾 液，编号17和编号I 8分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠唾液，编号19和编号20分 别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠唾液；编号21-30为一步法RT-PCR检测鼠便样本的 实验结果，其中编号21为阳性对照，编号22为阴性对照，编号23为实验组1中的1只慢性 MHV感染的ICR小鼠鼠便，编号24和编号25分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免 疫功能的鼠便，编号26为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠便，编号27和编号28 分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠鼠便，编号29和编号30分别为对照组中的2只 阴性无病毒感染鼠便；编号31-35为一步法RT-PCR检测鼠笼表面擦拭物的实验结果，其中 编号31为阳性对照，编号32为阴性对照，编号33为实验组1鼠笼表面擦拭物，编号34为 实验组2鼠笼表面擦拭物，编号35为对照组鼠笼表面擦拭物；编号36-40为一步法RT-PCR 检测鼠笼内饮用水样本的实验结果，其中36为阳性对照，编号37为阴性对照，编号38为实 验组1鼠笼内饮用水，编号39为实验组2鼠笼内饮用水，编号40为对照组鼠笼内饮用水。

【具体实施方式】
[0084]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0085] 本发明提供了一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，该试剂盒含有：一步法反转 录聚合酶链式反应（RT-PCR)试剂（包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、探针I、探 针II、探针III、无 RNA酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液、阳性对照品和阴性对照品）、应 用S2抗体的类似间接酶联免疫吸附技术检测试剂（包括阳性对照、阴性对照、S2抗体）、 应用抗原S2的夹心酶联免疫吸附技术检测试剂（包括阳性对照、阴性对照和S2蛋白稀释 液）、包被液、洗涤液（包括洗涤液I和洗涤液II )、封闭液、HRP-proteinA偶联物、酶反应 底物、终止液、DNA酶I和肝素。
[0086] 试剂盒的构造：
[0087] 1、试剂：
[0088] 本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程（大连）有限公司。
[0089] 2、一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)试剂的制备：
[0090] (1)探针的设计与合成：
[0091] 通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获得鼠肝炎病毒目前流行的6种己 知主要亚型（MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)共同特有的抗原蛋白的恒定区连续核酸 序列为依据的。本发明探针序列为：鼠肝炎病毒探针I -GAGGATTACCATACACTAAC-3'， SEQ ID NO. 1 所示；鼠肝炎病毒探针 II :5' -AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3'，SEQ ID N0. 2 所 示；鼠肝炎病毒探针111以-1'17/^^0^6〇]1^1'11^-3'，为5￡〇10肌3所示。鼠肝炎病 毒探针I和鼠肝炎病毒探针II取自该6种亚型共同的膜蛋白基因序列，鼠肝炎病毒探针III 取自该6种亚型共同的核蛋白基因序列。鼠肝炎病毒探针由上海英骏生物技术有限公司合 成。
[0092] 对待检测样品进行反转录聚合酶链式反应时分别以鼠肝炎病毒探针I作为正向 引物和鼠肝炎病毒探针ΠΙ作为反向引物及以鼠肝炎病毒探针II作为正向引物和鼠肝炎病 毒探针III作为反向引物进行复式扩增。以鼠肝炎病毒探针I作为正向引物和鼠肝炎病毒探 针III作为反向引物进行PCR得到的基因片段大小为400个核酸碱基对（base pail·，bp)，以 鼠肝炎病毒探针II作为正向引物和鼠肝炎病毒探针III作为反向引物进行PCR得到的基因 片段大小为270bp，经琼脂糖凝胶电泳检测即可判定结果。
[0093] (2)RT-PCR混合液配制：混合经预处理的待检样品5 μ μ 1和45 μ μ 1反应混合 物，内含ΙΟμΜ鼠肝炎病毒探针探针I 1μ 1、1〇μΜ鼠肝炎病毒探针探针II b 1、1〇μΜ鼠 肝炎病毒探针探针ΠΙ 2 μ 1、10mM焦磷酸核苷酸混合物1 μ 1、酶混合液1 μ 1、五倍反应缓冲 液和无 RNA酶去离子水34 μ 1。
[0094] 3、抗原蛋白S2的制备：
[0095] (1)设计抗原蛋白构建方案：
[0096] 本发明所使用的抗原蛋白是我们通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获 得鼠肝炎病毒目前流行的 6种主要亚型（MHV-1、MHV-2、MHV_3、JHM、Α59和S)共同特有 的结构蛋白S(gi|298199 7〇7)的稳定区S2区域。S2抗原蛋白序列为序列表中的 SEQ ID NO. 4所示，蛋白理论大小为50. 4kDa。S2抗原蛋白序列所对应的核酸序列为序列表中的 SEQIDN0.5所示，基因大小为 1383bp。根据抗原蛋白S2的核酸序列设计引物，上游引物 S2-f含有Ncol限制性内切酶位点，序列为SEQ ID N0. 6所示,5' -CATGCCATGGCATGGATGGC AGCGCAAGGG-3';下游引物S2-r含有Xhol限制性内切酶位点，序列为SEQ ID NO. 7所示， 5' -CCGCTCGAGATCCTCATGGGAGGA-3, 〇 [0097] (2)S2基因的克隆与蛋白表达：
[0098] 以S2-f和S2-r为引物，以MHV核酸为模板，在5〇μ 1 DNA扩增反应体系中加入上 下游引物各 1 μ 1，核酸模板 1 μ 1，dNTP(2. 5ηιΜ)4μ 1，10ΧΕΧ buffer5y 1，ddH20 36. 5μ 1， EXtaq 0. 5 μ 1。扩增所用的原料购头于宝生物工程（大连）有限公司，扩增条件：94°c 5min 预变性，然后94<€3〇86(：，55<€3〇86 (;，72°€：11^113〇86(：，3〇个循环，最后72。〇1〇1^11。获 得S2基因片段后，Nco I和Xho I酶双切S2基因片段，将其连接至同样限制性内切酶 酶切的pET_28b上，构建PET_ 28b-S2表达质粒，测序成功后，将表达质粒转入表达宿主菌 BL21(DE3)中进行表达，表达条件为：〇_5mM IPTG，37°C诱导4个小时。经SDS-PAGE跑胶鉴 定该融合蛋白可溶性太低，因此进行亲和变性纯化，然后再进行生物活性复性处理，以恢复 蛋白原有结构。
[0099] 4、S2单克隆抗体制备：
[0100] 我们已经把人B淋巴细胞中的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片断，通过 反转录和聚合酶链式反应技术进行克隆和扩增，并随机组合插入表达载体噬菌粒中，并进 一步通过抗体核酸的链式反应突变，形成抗体结构更多形性，从而构建了含有7 X 1011个单 链片段的通用性噬菌体基因抗体库，抗体为scFv片段，结构呈V形，并已进一步完善了噬菌 体抗体筛选技术和高亲和力及高产量的原核细胞表达性生产。S2蛋白单克隆抗体的筛选过 程如下：
[0101] (1)筛选S2蛋白对应的噬菌体抗体库：
[0102] 辅助噬菌体感染：将含有抗体库TG1菌在2TY培养基中培养至0D = 1. 5左右，然 后用辅助噬菌体感染后，加入含有质量分数0. 1 %葡萄糖、100 μ g/ml氨苄青霉素和50 μ g/ ml卡那霉素的2TY培养基，25°C生长16-20小时。然后离心取上清，加入PEG沉淀噬菌体， 再用PBS悬浮噬菌体沉淀，离心取上清，获得噬菌体抗体库。
[0103] 筛选：将S2抗原蛋白包被于聚苯乙烯96孔免疫反应板中，4°C过夜后用洗涤液洗 涤，然后37°C下封闭2小时后再次洗涤，然后加入噬菌体抗体库溶液，37°C静止孵育2小时 后，用洗涤液充分洗涤,洗涤后，加入胰蛋白酶溶液室温缓缓搅拌1小时后收集噬菌体，然 后感染0D = 0. 5的TG1细菌，最后涂抹于含有氨苄青霉素1〇〇 μ g/ml，质量分数4%葡萄糖 的TYE平板上，37?培养过夜，然后用玻璃涂棒刮板收集含噬菌体的TG1细胞。然后反复二 轮同样的噬菌体筛选过程，最终获得S2蛋白对应含有特异性的噬菌体。
[0104] (2)酶联免疫吸附反应（ELISA)筛选单克隆：
[0105] 挑取单克隆并诱导表达抗体：经过三轮辅助噬菌体筛选，再感染TG1，进行菌液梯 度稀释，以获得TG1单菌落。挑取单菌落于含有200 μ 1含有100 μ g/ml氨苄青霉素，质量 分数4%葡萄糖的2TY培养基的96深圆孔底培养平板上，37°C过夜培养。第二天，从每孔中 取5 μ 1过夜培养液接种至一个新的每孔含有1〇〇 μ g/ml氨苄青霉素、质量分数4%葡萄糖 的2TY培养基的96深孔圆底培养平板上，37°C培养3小时。然后离心弃上清，加入含有氨 苄青霉素100 μ g/ml和ImM IPTG的200 μ 1 2TY培养基重悬菌体，25 °C培养过夜。第二天， 离心后将上清液（含可溶性抗体片段）移至新的96孔培养板中，4°C储存。
[0106] ELISA筛选可溶性抗体片段：将S2抗原包被于聚苯乙烯96孔免疫反应板中，4°C 过夜后用洗涤液洗涤，然后37°C下封闭2小时后再次洗涤后加入溶于质量分数3%牛血清 白蛋白的可溶性抗体片段，室温下孵育1小时，经洗涤液充分洗涤后加入辣根过氧化酶与 蛋白A偶联物溶液，室温下轻轻摇动孵育1小时，经洗涤液充分洗涤后加入四甲基联苯胺 (TMB)溶液，室温避光显色l〇min-30min后，记录阳性反应孔并拍照，最后加入终止液终止 反应，颜色由蓝色变为黄色。分析结果，显色最强的孔所加的可溶性抗体片段即为S2蛋白 对应的单克隆抗体。
[0107] (3)S2蛋白单克隆抗体的生产及检测：
[0108] 确定免疫反应板上最强反应孔所对应的96孔TG1细菌板上的孔位，取适量接种 于5ml含有氨苄青霉素1〇〇 μ g/ml，质量分数4%葡萄糖到2TY培养基中,37Γ培养过夜；取 2· 5ml到100ml含有100 l·1 g/rnl热卞η每素的2TY培养基中，37 C培养3小时。加入lmM IPTG，25°C培养过夜；离心，将上清保存于新的容器中，然后用蛋白A柱进行亲和纯化，保存 抗体；将获得的S2蛋白单克隆抗体用ELISA和免疫印迹法进行检测。
[0109] 5、辣根过氧化物酶-蛋白A偶联：
[0110] 溶解2mg辣根过氧化物酶在500 μ 1去离子水中，加入1〇〇 μ 1新鲜制备的〇.说高 碘酸钠，室温下避光搅拌20min，溶液颜色由橙色到变为淡绿；在1升1. OmM醋酸钠缓冲液 中在4°C隔夜透析修饰后的酶化合物；溶解2毫克蛋白A在500 μ 1 l〇mM碳酸钠缓冲液（PH 为9· 5);通过加入250 μ 1 0· 2M的碳酸钠缓冲液（pH为9. 5)调整透析后酶溶液到PH为 9. 0-9. 5,并立即添加辣根过氧化物酶溶液，在室温下搅拌该混合物3小时；加入50 μ 1新鲜 配制的硼氢化钠溶液（4mg/ml)，混匀后，4°C搅拌2小时；在1L PBS中透析6-16小时候后， 更换新的PBS透析液继续透析6_16小时，加入牛血清白蛋白到5mg/ ml的终浓度，并分装储 存偶联物在-2〇°C。 tom] 实施例
[0112] 本发明涉及了一种检测鼠肝炎病毒的复合型试剂盒，包含鼠肝炎病毒核酸检测试 剂、病毒表面共同性抗原检测试剂以及使用同样抗原筛选鼠自身体内产生的病毒特异性抗 体检测试剂的组合。其中，鼠病毒核酸检测试剂和病毒表面共同性抗原试剂检测鼠体内和 周围环境中存在的病毒颗粒，而病毒特异性抗体检测试剂测定鼠自身体内产生的病毒特 异性抗体·这些病毒核酸试剂\病毒抗原和抗体试剂特异性针对目前已知全部MHV亚病毒 株。在这个复合型试剂盒中，每单个检测试剂可单独也可组合使用，针对某个标本样品进 行多方面的MHV快速检测。
[0113] 小鼠在接触鼠肝炎病毒后15天开始产生微量抗体，并大概在21天抗体效价增加， 在大多数情况下，鼠肝炎病毒具有较高的突变频率和慢性感染的感染鼠可以再次感染先前 已免疫或其他实验鼠。本发明的复合型检测试剂盒使用了病毒恒定区核酸和病毒表面共同 抗原及其产生的抗体来检测病毒感染的状态，因而避免了病毒核酸和抗原突变或而引起的 假阴性反应。当确定实验鼠感染病毒后，迅速清离鼠肝炎病毒污染区和污染物以及清除所 有已感染病毒的小鼠，可以避免大规模鼠肝炎病毒扩散。
[0114] 在本发明中，设立2个实验组，1个对照组。每个组内的鼠生活在一个鼠笼内并分 别隔离在单独房间内。实验组1包括一只慢性鼠肝炎病毒（MHV)的ICR小鼠和二只正常免 疫功能幼鼠；实验组2包括一只慢性鼠肝炎病毒感染的ICR小鼠和二只严重联合免疫缺陷 型病（SCID)鼠；对照组3为2只阴性无病毒感染鼠。培养15天后收集样本进行检测。分 别采集上述样品采取图1所示的方法进行检测。
[0115] 实施例1 :利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠血液中的鼠肝炎病毒
[0116] 使用鼠血液作为待测样品，用一步法RT-PCR、快速间接酶联免疫吸附试验和快速 双抗体夹心酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在情况和该病毒刺激实验鼠体内产 生的抗体情况。血液标本来源分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新 感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的 SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。
[0117] (1)样本处理：分别从上述各小鼠鼠尾或鼠背部静脉收集5-10μ 1血液到含有 5-10单位肝素（抗凝剂）和1单位/ml DNA酶I的50 μ 1 PBS溶液内。
[0118] (2) -步法RT-PCR检测鼠血液样本：
[0119] 试剂包括100 μ Μ四种焦磷酸核苷酸混合物（dNTP)、五倍反应缓冲液（5xBuffer)、 3个鼠肝炎病毒探针（鼠肝炎病毒探针I、鼠肝炎病毒探针II和鼠肝炎病毒探针III)、无 RNA 酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液（pH为7. 4)、阳性对照品和阴性对照品。
[0120] a、样品编号：阳性对照（编号1)、阴性对照（编号2)、实验组1中慢性MHV感染的 ICR小鼠血液（编号3)和2只新感染的具有正常免疫功能的小鼠血液（编号4、5)、实验组 2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液（编号6)和2只新感染的SCID鼠血液（编号7、8)、 对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液（编号9、10)。
[0121] b、将5μ 1样品液分别直接加入到含有45μ 1的RT-PCR反应混合液的反应管中。
[0122] c、将反应管放入PCR仪中，扩增条件：58°C 30min，94°C 5min预变性，然后 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin 30sec，30 个循环，最后 72°C 10min，4°C保温。
[0123] d、PCR反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0124] (3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检 测血液样本：
[0125] ELISA试剂盒包括聚苯乙烯微孔板条、应用S2抗体检测阳性对照（KTJ-CK+)、应用 S2抗体检测阴性对照（KTJ-CK-)、S2蛋白单克隆抗体、包被液、洗涤液I、洗涤液II、脱脂奶 粉、HRP-proteinA偶联物、酶反应底物、终止液。
[0126] a、样品编号：阳性对照（编号A1)、阴性对照（编号A2)、实验组1中1只慢性MHV 感染的ICR小鼠血液（编号A3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液（编号A4、 A5)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液（编号A6)和2只新感染的严重联合性 免疫缺陷病（SCID)鼠血液（编号A 7、A8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液（编号A9、 A10)。
[0127] b、包被：分别在阳性、阴性对照孔中加入阴性对照（KTJ-CK+)、阳性对照 (KTJ-CK-)100μ 1。然后在待测样品孔先加包被液8〇μ 1，然后再加待测样品20μ 1，37°C温 育2小时。
[0128] c、用200 μ 1洗涤液I洗涤三次，每次3分钟，然后加入100 μ 1用洗涤液I按1 : 4000的S2单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时。
[0129] d、用200 μ 1洗洚液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤二次，每次3分钟，然 后加入100 μ 1用洗涤液1按1 :6〇〇〇稀释的HRP-proteinA偶联物，室温缓缓摇动1小时。
[0130] e、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用2〇〇 μ 1洗涤液I洗涤二次，每次3分钟，力口 入ΙΟΟμ 1酶反应底物，避光静置l〇_3〇niin，显色后呈蓝色。
[0131] f、显色结束后加入1〇〇μ 1终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（0D 值）。实验结果见表1。
[0132] g、分析结果。
[0133] 结果判定标准：
[0134] 试验有效性：阳性对照孔平均值彡〇· 8 ;阴性对照平均值彡0· 1 ;
[0135] 临界值：临界值=阴性对照孔平均值+〇. 1 ;
[0136] 阴性判定：样品0D值〈临界值者为MHV阴性；
[0137] 阳性判定：样品0D值彡临界值者为MHV阳性。
[0138] (4)应用抗原蛋白S2检测实验鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技 术检测血液样本：
[0139] ELISA试剂盒包括聚苯乙烯微孔板条、应用抗原S2检测阳性对照（KYJ-CK+)、应用 抗原S2检测阴性对照（KYJ-CK-)、S2蛋白稀释液、包被液、洗涤液I，洗涤液II、脱脂奶粉、 HRP-proteinA偶联物、酶反应底物、终止液。
[0140] a、样品编号：阳性对照（编号2A1)、阴性对照（编号2A2)、实验组1中1只慢性 MHV感染鼠血液（编号2A3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液（编号2A4、2A5)、 实验组2中1只慢性MHV感染鼠血液（编号2A6)和2只新感染的SCID鼠血液（编号2A7、 2A8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液（编号2A9、2A10)。
[0141] b、包被：分别在阳、阴性对照孔中加入阳性对照（KYJ-CK+)、阴性对照 (KYJ-CK-) ΙΟΟμ 1。然后在待测样品孔先加样品包被液80μ 1，然后再加待测样品2011 1， 37°C温育2小时。
[0142] c、用200 μ 1洗涤液I洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μ 1用洗涤液I按1 : 2000的S2抗原，室温缓缓摇动1小时。
[0143] d、用200 μ 1洗涤液I洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μ 1用洗涤液I按1 : 2000稀释的S2蛋白特异性单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时。
[0144] e、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤二次，每次3分钟，然 后加入100 μ 1用洗涤液I按1 :6000稀释的HRP-proteinA偶联物，室温缓缓摇动1小时。
[0145] f、用200 μ 1洗涤液II洗涤三次，再用200 μ 1洗涤液I洗涤二次，每次3分钟，加 入100μ 1酶反应底物，避光静置10-30min，显色后呈蓝色。
[0146] g、显色结束后加入100 μ 1终止液终止，用酶标仪在450mn波长下测定吸光度（0D 值）。实验结果见表2。
[0147] h、分析结果。
[0148] 结果判定标准：
[0149] 试验有效性：阳性对照孔平均值彡〇. 8 ;阴性对照平均值< 0. 1 ;
[0150] 临界值：临界值=阴性对照孔平均值+0. 1 ;
[0151] 阴性判定：样品0D值〈临界值者为MHV阴性；
[0152] 阳性判定：样品0D值 > 临界值者为MHV阳性。
[0153] 实施例2 :利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠唾液中的鼠肝炎病毒
[0154] 用鼠唾液作为待测样品，一步法RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠 肝炎病毒的存在。唾液标本分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新 感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感^的 SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。 、…
[0155] (1)样品处理：分别收集上述小鼠10 μ 1唾液到含有1单位/毫升DNA酶j的 50μ 1 PBS溶液中。
[0156] (2) -步法RT-PCR检测鼠唾液样本：
[0157]样品编号：阳性对照（编号11)、阴性对照（编号12)、实验组1中丄只慢性MHV感 染的ICR小鼠唾液（编号13)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液（编号14、编号 15)、实验组 2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液（编号16)和2只新感染的SCID鼠唾 液（编号1 7、18)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠唾液（编号ig、2〇)。其余具体操作步骤 详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
[0158] (3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检 测鼠唾液样本： t〇159]样品编号：阳性对照（编号B1)、阴性对照（编号B2)、实验组1中！只慢性MHV感 染的ICR小鼠唾液（编号B3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液（编号B4、B5)、 实验组 2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液（编号B6)和2只新感染的SCID鼠唾液（编 号B7和编号B 8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠唾液（编号B9和B10)。
[0160]具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接 酶联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
[0161]实施例3 :利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠鼠便中的鼠肝炎病毒
[0162]使用鼠便作为实验标本并用一步法RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测 鼠肝炎病毒的存在。鼠便标本分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新 感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的 SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。
[0163] (1)样品处理：分别收集上述小鼠10mg鼠便，并完全溶解于5倍体积（W/V)含有1 单位/毫升DNA酶I的100 μ 1 PBS中，在3〇〇〇g下离心I5分钟，然后收集上清液，并调节 pH 到 7. 0-7. 4 之间。
[0164] (2) -步法RT-PCR检测鼠便样本：
[0165]样品编号：阳性对照（编号21)、阴性对照（编号22)、实验组1中1只慢性MHV感 染的ICR小鼠鼠便（编号23)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便（编号24和编号 25)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便（编号26)和2只新感染的SCID鼠便 (编号27和编号28)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠鼠便（编号29和编号30)。其余具 体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
[0166] (3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检 测鼠便样本：
[0167]样品编号：阳性对照（编号C1 )、阴性对照（编号C2)、实验组1中1只慢性MHV感 染的ICR小鼠鼠便（编号C3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便（编号C4、C5)、实 验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便（编号 C6)和2只新感染的SCID鼠便（编号 C7、C8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠鼠便（编号C9、ci〇)。其余具体操作步骤详见实 施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测血液样 本的操作步骤。实验结果见表！。
[0168]实施例4 :利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测鼠笼架表面擦拭物中的鼠 肝炎病毒
[0169]使用鼠笼表面擦拭物作为实验标本并用RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来 检测鼠肝炎病毒的存在。鼠笼表面尘埃标本来源分别取自实验组i、实验组2和对照组三个 鼠笼。
[οπ?] α)样品处理：用微湿棉签擦拭上述实验组鼠笼架表面，然后浸入含有1单位/毫 升DNA酶I 1500μ1 PBS中并静置20分钟。在3〇〇Og下离心15分钟，保留上清液。
[0171 ] (2) -步法RT-PCR检测鼠笼表面擦拭物
[0172]样品编号：阳性对照（编号31)、阴性对照（编号32)、实验组1鼠笼表面擦拭物 (编号33)、实验组2鼠笼表面擦拭物（编号34)和对照组鼠笼表面擦拭物（编号35)。其 余具体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
[0173] (3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检 测鼠笼表面擦拭物
[0174]样品编号：阳性对照（编号D1)、阴性对照（编号D2)、实验组1鼠笼表面擦拭物 (编号D3)、实验组2鼠笼表面擦拭物（编号M)和对照组鼠笼表面擦拭物（编号D5)。其 余具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶 联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
[0175]实施例5 :利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测鼠笼内饮用水中的鼠肝炎 病毒
[0176]使用鼠饮用水作为实验标本并用RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠 肝炎病毒的存在。鼠饮用水标本来源分别取自实验组1、实验组2和对照组鼠笼中的饮用 水。
[0177] (1)样本处理：轻轻收集上述鼠笼中饮用水500 μ 1，并溶于含有1单位/毫升DNA 酶I 1500μ1 PBS的3ml试管内，静置20分钟，然后3000g下离心10分钟，取上清液作为 样本。
[0178] ⑵一步法RT-PCR检测鼠笼内饮用水样本：
[0179]样品编号：阳性对照（编号36)、阴性对照（编号37)、实验组1鼠笼内饮用水（编 号38)、实验组2鼠笼内饮用水（编号39)和对照组鼠笼内饮用水（编号40)。其余具体操 作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
[0180] (3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检 测鼠笼内饮用水样本：
[0181]样品编号：阳性对照（编号D6)、阴性对照（编号D7)、实验组1鼠笼内饮用水（编 号D8)、实验组2鼠笼内饮用水（编号D9)和对照组鼠笼内饮用水（编号D10)。其余具体 操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附 技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
[0182] 实验结果和分析：
[0183] (1) 一步RT-PCR检测鼠肝炎病毒的结果：
[0184]图2显示了利用一步法反转录聚合酶链式反应（RT-pCR)的检测鼠肝炎病毒的电 泳结果。根据判断标准，以鼠肝炎病毒探针I、鼠肝炎病毒探针π和鼠肝炎病毒探针III进行 PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测观察是在4〇〇bp和240bp处有明显条带，若同时有这两 种条带，则判定为MHV阳性，若只有其中一种条带或两种条带都没有，则判定为 MHV阴性，从 图中可以看出：样品中阳性对照可以扩出目的条带，阴性对照无条带扩出，证明实验有效； 样品9号、10号、19号、20号、29号、30号和 35号，未能扩出目的条带，说明样品中鼠肝炎病 毒核酸颗粒检测为阴性；其余样品均可以扩增出两条带，说明样品中鼠肝炎病毒核酸颗粒 检测为阳性。
[0185] (2)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术：
[0186] 表1快速间接酶联免疫吸附反应（ELISA)实验结果
[0187]

【权利要求】
1. 一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有： (1) 一步法反转录聚合酶链式反应试剂，其中包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲 液、鼠肝炎病毒探针、无核糖核酸酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液、阳性对照品和阴性 对照品，所述鼠肝炎病毒探针包括鼠肝炎病毒探针I、鼠肝炎病毒探针II、鼠肝炎病毒探针 III； 鼠肝炎病毒探针I如序列表中的SEQ ID NO. 1所示： 5; -GAGGATTACCATACACTAAC-3;； 鼠肝炎病毒探针II如序列表中的SEQ ID NO. 2所示： 5，-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3,; 鼠肝炎病毒探针III如序列表中的SEQ ID NO. 3所示： 5 / -TTTAACCCGCGCTCGGTTTG_3/ ; (2) 应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用S2抗体检测的 阳性对照、应用S2抗体检测的阴性对照、S2抗体； 应用S2抗体检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； 应用S2抗体检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； S2抗体为抗原蛋白S2通过噬菌体抗体库筛选后生产获得的单克隆抗体； (3) 应用抗原蛋白S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用抗 原蛋白S2检测的阳性对照、应用抗原S2检测的阴性对照、S2蛋白稀释液； 应用抗原蛋白S2检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； 应用抗原蛋白S2检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； S2蛋白稀释液为溶于磷酸盐缓冲液中的S2抗原蛋白； (4) 包被液； (5) 洗涤液，包括洗涤液I和洗涤液II ; (6) 封闭液； (7) 辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物； (8) 酶反应底物； (9) 终止液； (10) 脱氧核糖核酸酶I ; (11) 肝素。
2. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述鼠肝炎 病毒探针选自鼠肝炎病毒核酸的共同恒定区序列。
3. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合 液含有莫洛尼氏鼠白血病毒反转录酶和脱氧核糖核酸聚合酶。
4. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对 照品为含有鼠肝炎病毒核酸的样品稀释液；所述阴性对照品为不含有鼠肝炎病毒核酸的样 品稀释液。
5. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2蛋白 基因序列选自鼠肝炎病毒目前流行的6种主要亚型的共同特有的结构蛋白S稳定区S2基 因区域，并通过基因工程技术生物合成S2蛋白；所述6种主要亚型为MHV-l、MHV-2、MHV-3、 JHM、A59 和 S。
6. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2抗体 通过噬菌体抗体库筛选技术和酶联免疫吸附技术制备。
7. 根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过 氧化物酶-蛋白A偶联物直接用于特异性抗体检测；所述辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物 由以下步骤制备： (1) 溶解2毫克过氧化物酶于500 μ 1去离子水中； (2) 加入100 μ 1新鲜制备的0. 1Μ高碘酸钠，室温下避光搅拌20min ; (3) 将上述修饰后的酶化合物在1升1. OmM醋酸钠缓冲液中于4°C隔夜透析； ⑷溶解2毫克蛋白A在500 μ 1 10mM碳酸钠缓冲液，溶液pH为9. 5 ; (5) 通过加入250 μ 1 pH为9. 5的0. 2M的碳酸钠缓冲液调整透析后酶溶液pH为 9. 0-9. 5,在室温下搅拌该混合物3小时； (6) 加入50 μ 1新鲜配制的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后，4°C搅拌2-3小时； (7) 在1L磷酸盐缓冲液中透析上述溶液，透析6-16小时后更换新的磷酸盐缓冲液透析 液继续透析6-16小时； (8) 按照每lml上述溶液加入5mg牛血清蛋白的比例添加牛血清蛋白，将溶液储存 于-20°C ;
8. -种利用权利要求1 - 7任一项所述的鼠肝炎病毒的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒 的检测方法，其特征在于，包括采集待测样品以及对样品进行预处理、一步法反转录聚合酶 链式反应检测、快速间接酶联免疫吸附法检测和快速双抗体夹心酶联免疫吸附法检测；所 述待测样品为组织或污染标本，选取鼠尾或鼠背部静脉血液、唾液、粪便、鼠笼架表面擦拭 物和鼠笼内饮用水一种或几种；所述样品预处理方法为：收集样品，加入脱氧核糖核酸酶 I处理，加入磷酸盐缓冲液悬浮，静置20分钟，3000g离心1-20分钟，取上清；所述一步法 反转录聚合酶链式反应检测用于检测鼠肝炎病毒核酸；所述快速间接酶联免疫吸附法检测 用于检测鼠肝炎病毒的表面蛋白抗原；所述快速双抗体夹心酶联免疫吸附法用于检测待测 样品中鼠体内自身产生的鼠肝炎病毒抗体。
9. 一种利用权利要求1 - 7任一项所述的复合型试剂盒在鼠肝炎病毒检测中的应用。
10. -种利用权利要求8所述的复合型试剂盒检测方法在致病微生物检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104232797SQ201410510086
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】冯翔, 石建芳, 高忠翔, 唐利军, 黎炎梅, 郏志明 申请人:武汉科隆生物医学有限公司