专利名称：长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，特别是涉及实验长爪沙鼠的病毒质量控制领域，尤其是涉及一种长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)抗体检测试剂盒。
背景技术：
长爪沙鼠属于啮齿目—仓鼠种—沙鼠亚科—沙鼠属，体形大小介于大鼠与小鼠之间。它从野生到驯养，再到实验动物化乃至将其用作动物实验迄今已有70余年历史，日本、欧美学者对长爪沙鼠形态学、解剖学、生理学和繁殖方法及生物学特性进行了研究，发现长爪沙鼠是研究脂类代谢的理想动物模型，同时也是研究丝虫病、线虫病等寄生虫病、糖尿病、自发性癫痫等疾病的理想动物模型。随着现代医学的飞速发展，长爪沙鼠被广泛地用于药理学、血清学和细菌学、内分泌学、行为学等领域的研究，国外将长爪沙鼠看作一种正在被开发的“多能性”的实验动物，进一步加快了它的应用研究步伐，拓宽了它的应用范围。
1983年，朱智勇使用实验长爪沙鼠在国内外首次证明了实验长爪沙鼠对流行性出血热病毒(EHFV)敏感，是研究EHFV特性和研制流行性出血热疫苗的首选实验动物。近年来杭州天元药业公司又用实验长爪沙鼠研制出双价苗，供应社会。卫生部上海生物制品所亦用长爪沙鼠生产出血热疫苗。迄今为止，作为实验动物的长爪沙鼠质量(微生物、寄生虫、遗传)的国际标准、国家标准及检测方法均是空白，鉴于实验长爪沙鼠的应用范围日益扩大，对其质量进行标准化控制的研究，制订相应的规范，开发相应的检测试剂盒就成为亟待解决的问题。
技术内容本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒。
本试剂盒内装有阳性血清1支，阴性血清1支，酶标二抗1支，底物1支，底物缓冲液1瓶，洗液1瓶，样品稀释液1瓶，终止液1支，封板膜2张及真空包装的抗原包被板1块。
盒内的阳性血清为含0.05％的叠氮钠和MHV(小鼠肝炎病毒)抗体的实验长爪沙鼠血清(其OD值大于0.2)，阴性血清为含0.05％的叠氮钠同时不含MHV(小鼠肝炎病毒)抗体的实验长爪沙鼠血清(其OD值小于0.1)；盒内的底物为OPD(邻苯二胺)，底物缓冲液为含0.004％过氧化氢的磷酸盐—柠檬酸缓冲液(pH5.0)，洗液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，样品稀释液为含0.05％硫柳汞和10％小牛血清的洗液，终止液为2mol/L的硫酸。
所述酶标二抗是采用饱和硫酸铵法和Q sepharose high performance阴离子交换层析柱法纯化的长爪沙鼠IgG，并以之为抗原对新西兰白兔进行常规免疫，再分离血清纯化后用双向免疫琼扩法和间接ELISA法进行效价测定，然后用过碘酸钠法进行HRP(辣根过氧化物酶)标记，得到该酶标二抗。
所述的抗原包被板是使用四价抗原(包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM和A59)10μg/ml的细胞培养液包被ELISA96孔板。板内A-H行1，3，5，7，9，11列为正常抗原，A-H行2，4，6，8，10，12列为特异抗原。
本发明中盒内建立一种间接酶联免疫吸附试验方法，提供检测实验长爪沙鼠血清中小鼠肝炎病毒抗体的方法及判断标准，可检测样品48只。
本发明实施(使用)中按以下步骤进行(1)取出抗原包被板，室温平衡10分钟。
(2)加样阴阳性血清对照各加入两孔(一个正常抗原孔，一个特异抗原孔)，每孔两滴；其余各孔各加100μl稀释液，每份待检血清加入相邻的两孔(一个为正常抗原孔，一个为特异抗原孔)，各5.0μl。
(3)孵育用封板膜封板，震荡混匀，置37℃孵育30分钟。
(4)洗涤弃去孔内液体，洗液注满各孔，静置1.5分钟，甩干，重复3次后叩干。
(5)将酶标二抗溶于10ml稀释液中，每孔100μl，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
(6)洗涤同(4)。
(7)显色将酶底物溶于底物缓冲液中，每孔100μl，37℃避光放置10分钟。
(8)终止每孔加终止液1滴。
(9)用酶标仪读数在490nm读取各孔OD值。
(10)结果判定A.目测法(A1)待检血清与正常抗原反应孔和待检血清与特异抗原反应孔均呈无色或极浅黄色，判为阴性。
(A2)待检血清与正常抗原反应孔呈无色或极浅黄色，而待检血清与特异抗原反应孔呈桔黄色，判为阳性。
B.比色法(B1)待检血清与特异抗原反应孔的OD值/阴性血清与特异抗原反应孔的OD值≥2.1；(B2)待检血清与特异抗原反应孔的OD值≥0.2；(B3)待检血清与正常抗原反应孔和待检血清与特异抗原反应孔应有明显的颜色区别。
本发明可用于抗原工作浓度测定，包被抗原浓度与抗原结合的最适浓度测定，抗体工作浓度测定，酶标二抗的制备及工作浓度确定，酶标二抗的稳定剂及有效时间、各成份有效期测定，试剂盒敏感性与特异性的比较。
本发明还可用于实验动物质检机构对于实验长爪沙鼠的病毒质量检测及实验长爪沙鼠繁育生产单位(企业)对动物质量跟踪监测。
本发明(试剂盒)具有携带方便，检测迅速省时，检测结果敏感可靠，操作规范标准等特点。配合高等级实验长爪沙鼠病毒学质量国家标准的制订与实施，为其提供检测手段与方法，具有重大而深远的意义。
本发明在确定长爪沙鼠对小鼠肝炎病毒易感的基础上，利用四价抗原(目前及以前国内曾流行或正在流行的小鼠肝炎病毒的四个代表性毒株，包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM和A59)包被96孔酶标板，自行制备并纯化了兔抗实验长爪沙鼠IgG，进一步用HRP标记后滴定其工作浓度，结合其它试剂制成长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒。
具体实施例方式
试剂盒内装有阳性血清1支(200μl)，阴性血清1支(200μl)，酶标二抗1支(10μl)，底物1支(4mg)，底物缓冲液1瓶(10ml)，样品稀释液1瓶(20ml)，洗液1瓶(30ml 20倍浓缩液)，终止液1支(5ml)，封板膜2张及真空包装的抗原包被板1块。抗原包被板是使用四价抗原10μg/ml的细胞培养液包被ELISA96孔板。
做13个样品，来自两个单位两种微生物控制级别，10只(1-10)为A单位屏障系统饲养的实验长爪沙鼠，第11为B单位开放环境饲养的实验长爪沙鼠，第12-13为B单位屏障环境饲养的实验长爪沙鼠。
(1)取出抗原包被板，室温平衡10分钟，打开外包装。
(2)加样阴、阳性血清对照各加入两孔(一个正常抗原孔，一个特异抗原孔)，每孔两滴(约100μl)；其余各孔各加100μl稀释液，每份待检血清加入相邻的两孔(一个为正常抗原孔，一个为特异抗原孔)，各5.0μl，同时设立稀释液对照(除稀释液外不加任何液体)。
(3)孵育用封板膜封板，震荡混匀，置37℃孵育30分钟。
(4)洗涤弃去孔内液体，洗液注满各孔，静置1.5分钟，甩干，重复3次后叩干。
(5)将酶标二抗溶于10ml稀释液中，每孔100μl，用封板膜封板，置37℃孵育30分钟。
(6)洗涤同(4)。
(7)显色将底物溶于底物缓冲液中，每孔100μl，37℃避光放置10分钟。
(8)终止每孔加终止液1滴。
(9)用酶标仪读数取490nm，读取各孔OD值。
加样示意图 上述样品酶标仪测定结果 根据判断标准判定A单位中1-10为小鼠肝炎病毒抗体阳性，B单位三个样品均为小鼠肝炎病毒抗体阳性。
权利要求
1.长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒内装有阳性血清1支，阴性血清1支，酶标二抗1支，底物1支，底物缓冲液1瓶，洗液1瓶，样品稀释液1瓶，终止液1支，封板膜2张及真空包装的抗原包被板1块。
2.如权利要求1所述的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述的阳性血清为含0.05％的叠氮钠和MHV抗体的实验长爪沙鼠血清，阴性血清为含0.05％的叠氮钠同时不含MHV抗体的实验长爪沙鼠血清；底物为邻苯二胺，底物缓冲液为含0.004％过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，洗液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液，样品稀释液为含0.05％硫柳汞和10％小牛血清的洗液，终止液为2mol/L的硫酸。
3.如权利要求1所述的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗是采用饱和硫酸铵法和Q sepharose high perfor-mance阴离子交换层析柱法纯化的沙鼠血清IgG，并以之为抗原对新西兰白兔进行常规免疫，再分离血清纯化后用双向免疫琼扩法和间接ELISA法进行效价测定，然后用过碘酸钠法进行酶标，得到该酶标二抗。
4.如权利要求1所述的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述的抗原包被板是使用四价抗原10μg/ml的细胞培养液包被ELISA96孔板；板内A-H行1，3，5，7，9，11列为正常抗原，A-H行2，4，6，8，10，12列为特异抗原。
全文摘要
本发明涉及一种长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体检测试剂盒。本发明中的试剂盒内装有阳性血清1支，阴性血清1支，酶标二抗1支，底物1支，底物缓冲液1瓶，洗液1瓶，样品稀释液1瓶，终止液1支，封板膜2张及真空包装的抗原包被板1块。其中阳性血清为含0.05％的叠氮钠和MHV抗体的实验长爪沙鼠血清，阴性血清为含0.05％的叠氮钠同时不含MHV抗体的实验长爪沙鼠血清；抗原包被板是使用四价抗原的细胞培养液包被ELISA96孔板。本发明中盒内建立一种间接酶联免疫吸附试验方法，提供检测实验长爪沙鼠血清中小鼠肝炎病毒抗体的方法及判断标准，可检测样品48只。
文档编号G01N33/569GK1877334SQ20061005228
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月4日 优先权日2006年7月4日
发明者吴旧生, 刘月环 申请人:浙江大学