专利名称：禽流感病毒标记疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，具体地，本发明涉及一种在NA基因的颈部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，更具体地，其为H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19。本发明还公开了制备所述H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的方法和该标记疫苗在制备预防禽流感的疫苗和在禽流感流行病学监测中的应用。
背景技术：
1.A型流感病毒的反向遗传技术近年来，流感病毒分子生物学研究进展很快，主要表现在分子流行病学、流感病毒复制及其调控、流感病毒载体改造及应用、流感病毒治疗与预防等领域。其中流感病毒复制及其调控机制是揭示流感病毒感染性与致病性机制，研究有效治疗与预防措施的基础，这一领域的进展得益于流感病毒反向遗传操作技术的建立与应用。
Conzelmann的研究小组在1994年首次利用克隆的cDNA救获了负链RNA病毒一狂犬病病毒(Schnell，et al，1994)。他们克隆了与病毒基因组互补的正链RNA(cRNA)序列的cDNA，将其置于T7 RNA聚合酶的启动子和δ肝炎病毒核酶序列的控制之下，从而构建了重组质粒。在用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒感染细胞后，将构建的重组质粒转染真核细胞，再用蛋白表达质粒共转染以提供病毒的转录复合体，这些都置于T7 RNA聚合酶的启动子的控制之下。利用这种方法，研究人员相继救获了弹状病毒科和正粘病毒科的其它成员(Baron，et al，1997；Clarke，et al，2000；Cassen，et al，2000)，并且很快促进了对基因组分节段RNA病毒救获的研究。
Bridgen和Elliott在1996年利用Conzelmann研究小组的方法救获了Bunyamwera病毒(Bridgen，et al，1996)，它的基因组由三个负链RNA片段所组成。这样对于基因组不分节段病毒和分节段病毒的救获，都已取得了成功。流感病毒则是一个例外，除了要由克隆的cDNA产生聚合酶蛋白和核蛋白，还要由它形成病毒的八个RNA片段，因此它的救获存在着特殊的复杂性。
1999年Kawaoka的研究小组将编码A/WSN/33(H1N1)病毒八个基因片段的cDNA置于人RNA聚合酶I启动子和鼠RNA聚合酶I的终止子序列之间，进而救获了流感病毒，终于克服了从克隆的cDNA救获流感病毒的技术障碍(Neumann，et al，1999)。将所构建的质粒转染293T细胞，细胞内的RNA聚合酶I转录产生了病毒的八个RNA片段。在最初的实验中，同时转染了9种结构蛋白的表达质粒。尽管要将这17种质粒(八种用于产生病毒RNA，九种用于表达蛋白)同时导入细胞，但是所救获的病毒产量很高，在每微升培养细胞的上清液中可达1×107个感染性病毒粒子。最近的研究中该研究小组通过改进系统参数，仅仅利用12个质粒，包括八个RNA转录质粒和四个蛋白表达质粒(PB1、PB2、PA及NP)转染细胞，获得了超过1×108个病毒粒子。这主要是由于293T细胞的转染效率高，使大量的细胞都获得了全部12个质粒以起始病毒的复制。此外，RNA聚合酶I在生长细胞内广泛存在，保证了所构建的质粒的复制。除了具有很高的效率以外，RNA聚合酶I系统非常简单，仅仅需要DNA克隆和转染技术，这在许多病毒学实验室都能够实现。在1999年Fodor等也报道了一种简单的救获流感病毒的方法，利用δ肝炎病毒的序列来替代RNA聚合酶I的终止子，保证了所产生的vRNA 3’端的真实性(Fodor，et al，1999)。
Hoffmann等在2000年对RNA聚合酶I系统进行了修饰，并将其命名为RNA聚合酶I/II系统(Hoffmann，et al，2000)。在这一系统中，编码病毒基因片段的cDNA被反向克隆在RNA聚合酶I的启动子和终止子序列之间，这一完整的转录单位又以正向取向置于RNA聚合酶II的启动子(CMV启动子)和多聚腺苷酸序列的控制之下，从而形成了一个双向转录系统。在该系统中RNA聚合酶I的转录产生了负链病毒vRNA，而RNA聚合酶II的转录则形成了正链病毒mRNA，所以由相同的模板既产生了vRNA，也产生了mRNA，从而不在需要构建蛋白表达质粒。这一系统的研究具有重要的意义，仅仅利用8个质粒就可以救获出流感病毒，大大减少了所应用的质粒数量，这对于转染效率低的细胞提高了病毒救获的效率。在RNA聚合酶I/II系统中，病毒蛋白的表达和vRNA的合成由相同的cDNA模板来完成，所以这一系统不能救获在一个或几个基因片段上缺失或含有致死性突变的流感病毒，在这种情况下12质粒系统就更适合一些。总之这两种以质粒为基础的8质粒和12质粒反向遗传操作系统为流感病毒的研究提供了有利的工具。
2.流感病毒反向遗传技术的应用流感病毒反向遗传操作系统最具吸引力、最有潜力的应用就是利用它进行疫苗生产。当前所采用的灭活疫苗可以有效的减轻流感所带来的综合症，但是不能预防感染。目前在美国一种冷适应致弱的疫苗已经进入了临床中试阶段，和常规的灭活苗相比，它可以对儿童提供更好的保护，但是对于成年人而言两种疫苗的效果差异不显著(Maassab，et al，1999)。此外这种疫苗仅仅具有少数几个氨基酸的取代，虽然在临床实验中它的表现型是稳定的，但是一旦大规模的推广应用仍不能避免发生毒力返强的危险。
利用RNA聚合酶I系统救获流感病毒，可以在编码病毒六个内部蛋白的基因上导入多个致弱突变，从而生产出流感病毒的疫苗株。利用反向遗传操作系统已经生产出具有现在流行毒株HA和NA的重组病毒(Ozaki，et al，2004；Li et al，1999)。Subbarrao等人利用12质粒的反向遗传操作系统，救获了分子修饰致弱的H5N1/PR8重组病毒，其中含有香港1997年H5N1亚型禽流感病毒A/HK/491/97的HA和NA基因以及高滴度鸡胚适应株A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6个内部基因(Subbarao，et al，2003)。该重组病毒的HA基因经过分子修饰去除了HA裂解位点的碱性氨基酸，从而失去了对鸡和鸡胚以及小鼠的高致病性，而且保持了高滴度鸡胚生长性的特点，制备的灭活疫苗能够对小鼠提供完全的保护。Chen等利用12质粒的反向遗传操作系统，救获了具有中国大陆H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因和A/Puerto Rico/8/34(PR8)六个内部基因的重组病毒，所制备的疫苗具有良好的免疫原性，免疫后可以产生高水平的HI抗体，即使是用不同亚群的病毒A/Hong Kong/1073/99进行攻毒，仍能提供完全的免疫保护(Chen，et al，2003)。
流感病毒也是一种很有潜力的载体，利用它可以将外源基因导入哺乳动物的细胞。事实上，在依赖于辅助病毒的反向遗传操作系统中，流感病毒可以容纳外源基因。对于几个比较短的多肽，如HIV-1病毒gp120蛋白的v3环和gp41蛋白胞内域中高度保守的片段都可以插入在流感病毒HA片段的抗原位点上，从而诱导出对于外源片段的免疫反应(Li，et al，1993；Muster，et al，1994，1995)。为了表达全长的外源蛋白，可以将目的基因和流感病毒的基因进行物理连接，在这种方法中外源基因的转录和翻译是作为流感病毒基因的一部分进行的(Garcia-Sastre et al，1994；Percy et al，1994)。另一种方法是将外源基因作为一个独立的片段进行表达。Enami等在1991年救获了编码野生型的NS1蛋白，但不含有NS2蛋白的重组病毒(Enami，et al，1991)。在这一反向遗传操作系统中，所采用的辅助病毒在NS1上含有温度敏感性突变。所以病毒在不适宜的温度下培养时，就需要九个基因片段才能进行有效的复制，这表明流感病毒在包装时可以含有多于八个基因片段的基因组。为了保证目的基因在没有选择压力的条件下可以在流感病毒的基因组中持续存在，可以对流感病毒基因的启动子进行突变，从而导致目的基因的超量复制或转录。
将外源基因安全有效的导入受体细胞，可以由病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)来实现，在VLPs中并不包含有病毒的全部八种RNA。在这种反向遗传操作系统中，编码流感病毒蛋白基因和具有与流感病毒RNA结构类似的报告基因的表达有效的形成了流感病毒的病毒样颗粒。Gomez-Puertas等在1999年和Neumann等在2000年利用这一系统，表达了病毒的所有结构蛋白和聚合酶蛋白及NP蛋白，同时将外源基因导入了受体细胞，在细胞中可以表达出聚合酶蛋白和NP蛋白，反过来又可以起始目的基因的复制和转录，从而使其有效的表达(Gomez-Puertas，et al，1999；Neumann，et al，2000)。因为在VLPs中不含有编码病毒结构蛋白的vRNA，所以在基因导入后不会产生出新的子代病毒粒子，这就保证了该系统的安全性。此外，由于有15个HA亚型和9个NA亚型的流感病毒可供利用，就可以减轻对于流感病毒载体自身蛋白产生免疫抵抗的危险性，从而可以反复使用VLPs来导入外源基因。
利用RNA聚合酶I系统可以将目的突变导入流感病毒的基因组，这就为长期停滞不前的流感病毒生物学研究开辟了新的途径，诸如病毒调控序列的特征，结构与功能关系，致病性和宿主细胞的亲嗜性等，尤其是病毒致病力分子机制的研究。
3.禽流感病毒与标记疫苗禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类感染和/或疾病综合征，AIV在分类学上属于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，基因组由8个单股负链RNA片段组成。其表面结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，被划分为不同亚型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。AIV的致病力与其表面结构蛋白HA裂解位点的氨基酸序列密切相关。低致病力AIV的HA裂解位点只有一个碱性氨基酸精氨酸(R)，这一结构决定了这些病毒感染动物后只能在呼吸系统内繁殖，因为只有呼吸道上皮细胞内含有一种精氨酸特异的类似胰酶的蛋白酶，可将裂解位点含单一碱性氨基酸精氨酸的HA0裂解为有活性的HA1和HA2，启动病毒的吸附和复制周期。高致病力H5和H7亚型AIV HA裂解位点含有连续的多个碱性氨基酸残基-RKKR-，可被体内多种细胞内广泛存在的蛋白酶识别和裂解，因此具有广泛的组织嗜性，一旦感染便会造成全身性扩散并导致迅速死亡。与可感染人的H1、H2、H3及H9等亚型流感病毒相比，高致病性的H5和H7亚型AIV对人类的潜在危害更为巨大，因为一旦感染人后即可能全身性扩散和迅速致死。
标记疫苗(marker vaccine)或称之为DIVA疫苗(differentiating infected fromvaccinated animals)，就是用一种疫苗给动物免疫后，通过与之相配套的血清学检测方法，可以将免疫动物和自然感染动物区分开来(Babiuk，et al，1999)。禽流感病毒灭活全病毒疫苗是目前世界上应用最为广泛的疫苗，主要是因为其免疫原性强，抗原组分齐全，免疫保护时间长，但是灭活全病毒疫苗也有自身的一些缺点，尤其是影响禽流感的监测和流行病学调查，所以只能用于禽流感暴发时的紧急免疫来减少经济损失，而在尚无疫情发生的地方不主张免疫，因此在很大程度上限制了它的应用。正由于常规禽流感灭活疫苗的不可克服的缺点，使得开发灭活标记疫苗成为必要。
在1999-2001年意大利暴发H7N1亚型禽流感期间进行了灭活疫苗免疫来预防禽流感，但是所用的疫苗并不是同源的H7N1亚型病毒，而是用异源的巴基斯坦H7N3分离株(A/CK/Pakistan/95/H7N3)制备灭活疫苗，其目的是将其作为一种自然的标记疫苗，更准确的说是DIVA疫苗(Capua，et al，2002)。因为在疫苗中的H7亚型HA作为主要的免疫保护抗原，可以提供对H7N1亚型禽流感病毒的免疫保护，而且在疫苗中含有不同于N1亚型的N3亚型NA基因，免疫后则产生针对N3NA的抗体，而当发生H7N1亚型病毒感染时则产生N1NA抗体，借助于诊断试剂盒可以将免疫家禽和感染家禽区分开来。利用这种标记疫苗意大利有效的消灭了由H7N1亚型禽流感病毒引起的流行。但是这种策略的标记疫苗只能在病毒流行背景单一的情况下使用，如果在一个区域内病毒流行情况复杂，各种亚型禽流感病毒共存，就很难选择出合适的作为自然标记的NA亚型，因此更好的策略是对流感病毒基因片段进行分子修饰，加入外源性的标签，通过标签的检测对疫苗免疫和自然感染禽流感的家禽进行区分。
发明内容
如上所述，流感病毒反向遗传操作系统的建立为流感病毒疫苗研制提供了有力工具，本研究中利用这一技术，人工救获了分子修饰致弱的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19，其HA和NA基因来源于我国分离到的第一株H5N1亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96，内部基因来源于高滴度鸡胚适应株A/PuertoRico/8/34 (PR8)。H5N1/PR8-5B19的HA基因经过分子修饰致弱，具有低致病性禽流感病毒的HA裂解位点特征，NA基因的颈部插入了小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19作为外源标签。该疫苗株不仅具有良好的鸡胚生长特性和对鸡和鸡胚的低致病性，所制备的灭活疫苗可以对H5N1亚型禽流感病毒的攻击提供完全的免疫保护，而且疫苗免疫后利用血清学方法可以区分疫苗免疫鸡和自然感染鸡，用于H5N1亚型禽流感病毒的防制。
因此，本发明的目的是提供以下各项1.在NA基因的颈部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其中所述鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据上述1的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其通过包括以下步骤的方法制备(1)将H5N1亚型禽流感病毒的负链病毒vRNA的转录质粒、聚合酶基因的蛋白表达质粒、HA基因转录质粒和插入鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的NA基因的转录质粒与转染试剂混合作用；(2)将作用后的质粒和转染试剂的混合物共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(3)收获转染后的细胞，接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。
3.根据上述2的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其中所述HA基因是人工缺失裂解位点处连续多个碱性氨基酸的突变型HA基因。
4.根据上述1的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其为H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19。
5.根据上述4的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其通过包括以下步骤的方法制备(1)将vRNA转录质粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS，四个聚合酶基因的蛋白表达质粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP以及分子修饰致弱的HA基因双向转录质粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因双向转录质粒pBD-NA-5B19与转染试剂混合作用；(2)将作用后的质粒和转染试剂的混合物共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(3)收获转染后的细胞，接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株，其中优选所述宿主细胞是293T细胞。
6.根据上述1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗在制备治疗和/或预防禽流感病毒所导致的疾病的药物中的应用。
7.根据上述1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗在禽流感流行病学监测中的应用。
8.根据上述7的应用，其中所述禽流感流行病学监测包括利用ELISA法检测目标生物体内的HI抗体和5B19表位的抗体的步骤，其中所述目标生物已经被施用了所述H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
9.一种禽流感灭活疫苗，其包含根据上述1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
10.一种用于区分禽流感疫苗免疫家禽和禽流感自然感染家禽的试剂盒，其包含根据上述1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击，而且具有重要的公共卫生学意义。疫苗免疫是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要技术手段，能与自然感染相区别的免疫措施对禽流感的控制和根除非常重要。本研究利用反向遗传操作技术人工救获了H5N1亚型重组流感病毒疫苗株H5N1/PR8-5B19，其6个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株PR8，HA和NA基因来源于我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96。通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸，使其具备了低致病性AIV的HA基因特征，在NA基因颈部49-67位之间插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19。
H5N1/PR8-5B19疫苗株病毒接种鸡胚后96小时内不致死，鼻腔和静脉感染后对SPF鸡不致病，具有高度的生物安全性。疫苗株病毒具有高度的鸡胚生长特性，在接种鸡胚后72小时病毒复制达到高峰，尿囊液血凝价为10.5log2。病毒在鸡胚中连续传代14次，致病力不返强，在NA基因中插入的5B19表位稳定存在。
H5N1/PR8-5B19疫苗株具有良好的免疫原性，单次免疫后，第2周即可检测到HI抗体，第4周时HI抗体水平达到高峰，到12周时还没有出现明显的下降；单次免疫后加强免疫一次可以明显提高抗体水平，在高峰时HI抗体滴度可以达到11.5log2。疫苗免疫后对高致病性H5N1亚型AIV的攻击提供完全保护，免疫鸡攻毒后不发病，不死亡，不排毒。
以人工合成的5B19表位的16个氨基酸短肽作为包被抗原建立了检测抗5B19表位抗体的间接ELISA方法。结果表明H5N1/PR8-5B19灭活疫苗单次免疫后第3周10只鸡中有2只鸡产生ELISA抗体，在第6周和12周时有7只鸡ELISA抗体检测阳性，而加强免疫后所有的10只鸡均产生可检测到的抗5B19抗体。
本研究首次利用以质粒为基础的反向遗传操作技术人工构建了H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株。灭活标记疫苗单次免疫后可以诱导高水平的HI抗体，对免疫鸡提供完全的免疫保护。加强免疫后所有免疫鸡血清均可检测到针对于5B19表位的抗体。因此，H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗的应用可以区分出标记疫苗免疫鸡和自然感染鸡，用于H5N1高致病性禽流感的防制。
图1.pBD载体简图；图2.分子修饰致弱的HA基因双向转录质粒pBD-MutHA的构建；图3.pUC-MutHA质粒的构建和PCR鉴定；图4.pBD-MutHA质粒PCR和酶切鉴定；图5.pBD-MutHA载体简图；图6.重组NA基因双向转录质粒pBD-NA-5B19构建；图7.pBD-NA-5B19质粒构建和PCR及酶切鉴定；图8.pBD-NA-5B19载体简图；图9.标记疫苗株神经氨酸酶活性测定；图10.H5N1/R8-5B19病毒株的鸡胚生长特性；图11.H5N1/PR8-5B19疫苗株NA-5B19基因的遗传稳定性；图12.H5N1/PR8-5B19灭活疫苗单次免疫(A)和加强免疫(B)后HI检测；图13.pBD载体的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)；图14.质粒pPOLI-PB2核苷酸序列；图15.质粒pPOLI-PB1核苷酸序列；图16.质粒pPOLI-PA核苷酸序列；图17.质粒pPOLI-NP核苷酸序列；
图18.质粒pPOLI-NS核苷酸序列；图19.质粒pPOLI-M核苷酸序列；图20.质粒pcDNA-PB2核苷酸序列；图21.质粒pcDNA-PB1核苷酸序列；图22.质粒pcDNA-PA核苷酸序列；图23.质粒pcDNA-NP核苷酸序列；图24.质粒pBD-NA核苷酸序列(SEQ ID NO.3)；图25.H5N1/PR8-5B19病毒分子修饰致弱HA基因MutHA(SEQ ID NO.4)；图26.H5N1/PR8-5B19病毒分析修饰NA基因NA-5B19。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1 分子致弱的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19的生产1材料与方法1.1 病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GS/GD/1/96)(购自哈尔滨兽医研究所)1.2 SPF鸡和SPF鸡胚9-11日龄SPF鸡胚和4-8周龄SPF鸡购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。所有SPF鸡试验均在负压隔离器中进行。
1.3 质粒载体及转染质粒pBD载体(图谱见图1)(Zejun Li，Hualan Chen，Peirong Jiao，Guohua Deng，GuobinTian，Yanbing Li，Erich Hoffmann，Robert G.Webster，Yumiko Matsuoka，and KangzhenYu.Molecular Basis of Replication of Duck H5N1 Influenza Viruses in a Mammalian MouseModel.J.Virol.7912058-12064.)由陈化兰博士构建，将单向转录质粒载体pPolIsapIRib(Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reverse genetics system for influenza。A virus.J.Virol.704188-4192.)中包含聚合酶I启动子-SapI克隆位点-鼠源核酶序列的XbaI酶切片段，反向插入pCI(Promega)质粒的XbaI位点，形成RNA聚合酶II启动子(CMV)→病毒RNA转录终止信号序列Rib→流感病毒基因组cDNA(5’→3’)→人RNA聚合酶I启动子→mRNA转录终止PolyA信号序列(SV40)构成的双向转录表达质粒载体，利用该载体可同时转录出流感病毒负链vRNA和正链mRNA。
本研究中利用了经过修饰后的12质粒反向遗传操作系统，其中六个内部基因的vRNA转录质粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS和四个聚合酶基因的蛋白表达质粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP(序列分别见后附附图)均来自于人源流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(A/RR/8/34)，是由美国联邦疾病控制中心的Kanta Subbarao博士惠赠(Subbarao，K.，Chen，H.，Swayne，D.，Mingay，L.，Fodor，E.，Brownlee，G.，Xu，X.，Lu，X.，Katz，J.，Cox，N.，Matsuoka，Y.Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virusvaccine candidate generated by plasmid-based genetics.Virology 2003，305(1)192-200)。分子修饰致弱的HA基因双向转录质粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因双向转录质粒pBD-NA-5B19在本研究中构建，来源于我国第一株H5N1亚型禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GS/GD/1/96)，其中pBD-NA-5B19是在pBD-NA(序列见附图)(Zejun Li，Yongping Jiang，Zhigao Bu，Guobin Tian，Fengiu Zhao，AiqingWang.Kangzhen Yu and Hualan Chen.The NS1 gene contributes to the virulence and hostrange of H5N1 avian influenza viruses in chickens.Accepted by J.Virol.)(李泽君博士提供)基础上构建而来。
1.4 主要试剂和仪器DNA Polymerase I Kleonw大片段，T4 DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，内切酶SapI，，XhoI，NotI，购自NEB公司，NsiI购自MBI公司(立陶宛)，EcoRI，XbaI，HindIII，BamHI，dATP，dGTP，dCTP和dTTP，r-Taq DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司。RNA提取试剂Trizol LS，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒，DTT，RNaseOUT和Pfx高保真DNA聚合酶，转染试剂盒Lipofectamine 2000， 无血清培养基Opti-MEM购自Invitrogen公司。胶回收试剂盒与小量质粒回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。测序反应试剂盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)购自BECKMAN公司。转染质粒提取试剂盒(Perfectprep Plasmid Mini)购自Eppendorf公司(美国)。
ELISA实验中所用到的45％明胶和HRP标记的兔抗鸡二抗购自Sigma公司，5B19多肽由上海生工生物工程有限公司合成纯化，OPD(o-Phenylenediamine，邻苯二胺)购自上海华舜生物工程有限公司。96孔酶标反应板购自Orange公司。酶标仪Model 680Microplate Reader购自BIO-RAD公司。
1.5 病毒RNA提取、反转录和PCRGS/GD/1/96种毒105稀释接种9-10日龄SPF鸡胚后收集24-36小时内的死胚尿囊液，进行RNA提取与反转录，产生病毒的cDNA(取250μl病毒尿囊液，加入750μl TrizolLS裂解液，混匀，室温作用10分钟，在加入200μl氯仿，混匀，室温放置5分钟，12000g、4℃离心15分钟，转移上清至新的离心管中，加500μl的异丙醇沉淀，室温放置10分钟。12000g离心10分钟后弃上清，沉淀真空干燥后，重悬于DEPC处理水。RNA提取出来以后，反转录按鼠源反转录酶(MLV)试剂盒说明加入各成分(反转录引物序列为5’AGC AAA AGC AGG3’)，37℃反应2-3h，直接用于PCR。)。PCR是在Pfx高保真DNA聚合酶作用下进行，按试剂盒说明书加入各成分，94℃变性5min，进入以下循环，变性94℃1min，退火根据引物不同在52-65℃之间，时间为1min，延伸68℃2-3min，共35个循环，72℃延伸10min。
1.6 序列测定在PCR管中分别将PCR鉴定阳性质粒和适量ddH2O混合，96℃加热预变性3分钟，自然凉到室温后加入测序引物(5pmol/μl)和DTCS Quick Start Master Mix 2μl，混匀后进行测序PCR反应，PCR反应程序为96℃20sec、50℃20sec、60℃4min，35个循环，最后保持在4℃。PCR反应完成后加入2.5ul的反应终止液(3M PH5.2的NaOAC 2ul，100mM PH8.0的EDTA 2ul，20mg/ml的Glycogen 1ul，即用即配)终止反应，然后加入30ul 95％冰乙醇沉淀DNA，混匀，4℃、12000rpm立即离心20min。小心倒掉上清后，用100-200ul 70％冰乙醇两次洗脱残留的盐，4℃、12000rpm离心5min。真空抽干或室温晾干DNA后，用30ul甲酰胺充分溶解DNA沉淀，小心加入CEQ样品板孔内，最后加一滴石蜡油到样品板孔内。随即采用双脱氧链终止法在BechmanCEQ8000测序仪(Bechman，America)上对克隆重组质粒进行测序，之后利用DNASTAR软件(DNASTAR.Inc.)将得到的序列进行分析。
1.7 引物实验中所用到的引物包括pBD-MutHA和pBD-NA-5B19双向转录质粒构建过程中所用到的引物，由上海博亚生物工程有限公司合成。具体见表1。
表1 转染质粒构建所用到的引物
1.8 HA和NA转染质粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19的构建1.8.1 双向转录质粒pBD-MutHA的构建以GS/GD/1/96病毒的cDNA为模板，以两对引物HA1-F1/HA1-R1和HA2-F1/HA2-R1分别进行PCR反应，扩增出HA1和HA2片段，目的是去除HA裂解位点的多个连续碱性氨基酸，使其获得低致病性禽流感病毒的HA基因特征。取5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检查扩增结果，然后对于两个基因片段HA1和HA2分别用小量胶回收试剂盒回收。
HA1和HA2片段回收后，对于HA1片段用BamHI和XhoI进行双酶切，HA2片段用XhoI和Hind III酶切，并对pUC18(购自宝生物技术工程(大连)有限公司)用BamH I和Hind III进行双酶切。然后将经过酶切的HA1，HA2两片段和pUC18载体以3∶3∶1的比例混合，16℃，用T4 DNA连接酶作用16h，然后按常规方法转化JM109感受态大肠杆菌，挑菌，提质粒，进行电泳，以引物HAF1/HAR1进行PCR鉴定。鉴定为阳性的质粒用小量质粒提取试剂盒提取质粒后溶于50μL的灭菌去离子水中，用于测序反应。
对于PCR鉴定阳性和测序正确的阳性质粒pUC-MutHA，以引物MutHAF1/MutHAR1进行PCR，此引物与HA基因的5’和3’末端序列完全吻合外，上游引物5’端增加两个碱基CC，下游引物5’端增加TT。PCR产物在dCTP和dTTP存在下用T4 DNA聚合酶12℃处理30min，75℃20min使酶失活，胶回收试剂盒回收用于连接反应。
pBD载体用SapI酶在37℃下酶切作用3h，用胶回收试剂盒回收，然后在dGTP和dATP存在的条件下用DNA Polymerase I Kleonw大片段于25℃作用25min，75℃20min使酶失活，胶回收试剂盒回收，备用。
PCR产物和pBD载体处理好以后，按照1∶3-1∶6的比例混合，16℃，用T4 DNA连接酶作用16h，转化JM109感受态细胞，挑菌，提质粒，进行电泳，以引物HAF1/HAR1进行PCR鉴定。鉴定为阳性的质粒用小量质粒提取试剂盒提取质粒后溶于50μL的灭菌去离子水中，用于测序反应。
1.8.2 含有鼠肝炎病毒(MHV)5B19表位的双向转录质粒pBD-NA-5B19构建GS/GD/1/96的NA基因在颈部不存在缺失，为了构建带有外源标签的重组NA基因，我们将鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis virus，MHV)S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19插入NA基因颈部，以替换野生型NA基因颈部的49-67位氨基酸。5B19表位的氨基酸序列为“SPLLGCIGSTCAEDGN”，核苷酸序列为5’-AGT CCC CTG CTG GGA TGCATC GGC TCC ACC TGT GCC GAG GAC GGC AAC-3’。
以NA基因双向转录质粒pBD-NA为模板，利用两对引物NA-5B19-F1/NA-5B19-R1和NA-5B19-F2/NA-5B19-R2进行PCR，分别扩增含有部分5B19表位的核苷酸片段Fragment1和Fragment2。F1/R1的PCR产物全长应为306bp，5’端具有独特的EcoRI位点，3’端具有独特的NsiI位点并含有5B19表位的上游部分；F2/R2的PCR产物应为1553bp，5’端具有独特的NsiI位点并含有5B19表位的下游部分，3’端具有独特的NotI位点。取5ul PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检查扩增结果。
将两个片段Fragment 1和Fragment 2的PCR产物按照胶回收(小量)试剂盒说明书操作步骤回收。Fragmentl用EcoRI和NsiI，Fragment 2用NsiI和NotI酶切，并对pBD-NA质粒用EcoRI和NotI进行双酶切，然后将经过酶切的Fragment1，Fragment2两片段和pBD-NA载体以3∶3∶1的比例混合，16℃，用T4 DNA连接酶作用16h，然后按常规方法转化JM109感受态细胞，挑菌，提质粒，进行电泳，以引物Marker174U24/Marker1200L25和NAF1/NAR1进行PCR鉴定，并进行酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒用于进行测序反应。
1.9 分子致弱的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19的救获1.9.1 H5N1/PR8-5B19的救获293T细胞(人胚胎肾细胞，CRL-11268，来自ATCC)先以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养于细胞培养瓶中，连续传代5代以上后传于六孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待293T细胞长至80％铺满时，按Lipofectamine 2000试剂盒使用说明书进行转染。
为了人工制造H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株，利用经过修饰的12质粒反向遗传操作系统。上述来源于A/PR/8/34病毒的6种单向转录质粒和4种蛋白表达质粒以及本研究中构建的双向转录质粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19，每个质粒取1μg加入50μl OPTi-MEM培养基中充分混合均匀，同时取12μl Lipofectamine 2000转染试剂加入250μl OPTi-MEM培养基中，混匀后于室温静置5分钟。然后将含有转染试剂和质粒的OPTi-MEM培养基混合，于室温作用30分钟。
待转染试剂和质粒作用完成后，将六孔板中的细胞培养液吸掉，并用OPTi-MEM培养基洗两次，然后每孔加入1ml的OPTi-MEM培养液，并将转染试剂与质粒混合物加入293T细胞六孔板的一个孔内，于37℃，5％CO2培养箱中培养。转染24小时后将培养板中的转染试剂换掉，然后用OPTi-MEM洗一次，以除去残留的转染试剂，最后加入2ml OPTi-MEM(含0.5μg/ml TPCK-Trypsin，Sigma)，继续培养48-72小时。转染结束后将细胞吹洗下来，分散均匀后接种9-11日龄SPF鸡胚，每个鸡胚尿囊腔接种0.2ml转染细胞悬液。接种后48小时收取鸡胚尿囊液，以0.5％的鸡红细胞进行血凝试验(HA)，对于有血凝价的鸡胚收取尿囊液，进行病毒鉴定。
在转染救获H5N1/PR8-5B19病毒的同时，利用该系统救获了H5N1/PR8病毒，转染和病毒救获过程与H5N1/PR8-5B19相同，但是所用到的NA基因双向转录质粒为pBD-NA，在NA基因中不含有5B19表位。
1.9.2 H5N1/PR8-5B19病毒HA和NA基因的鉴定利用反向遗传操作系统人工制造了H5N1/PR8-5B19病毒以后，需要对救获的病毒进行鉴定，以确定所救获病毒的HA和NA基因是否包含有所加入的分子修饰。H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒接种SPF鸡胚，48h后收取鸡胚尿囊液，提取病毒的RNA，然后利用流感病毒的特异性引物Uni-12(序列为5’AGC AAA AGC AGG 3’)进行反转录产生病毒的cDNA。利用HA和NA基因的特异性引物HAF1/HAR1和NAF1/NAR1进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶(1％)电泳鉴定后回收，然后用CEQTM DTCS-QUICK Star Kit进行PCR产物测序。
2 结果2.1 pBD-MutHA质粒构建野生型的GS/GD/1/96病毒是高致病性禽流感病毒，为了构建分子修饰致弱的疫苗株，采用PCR的方法缺失掉HA基因裂解位点的多个连续的碱性氨基酸，使其获得低致病性禽流感病毒的HA基因特征，具体的构建策略如图2所示。
2.1.1 pUC-MutHA质粒的构建以GS/GD/1/96病毒的cDNA为模板，利用两对引物HA1-F1/HA1-R1和HA2-F1/HA2-R1分别进行PCR反应，扩增出HA1和HA2片段。取5ul PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳上检查扩增结果，片段HA1和HA2的大小依次分别为1078bp和752bp(见图3)，电泳结果与预期相符。
将HA1和HA2片段回收后，对于HA1片段用BamHI和XhoI双酶切，HA2片段用XhoI和HindIII酶切，并对pUC18用BamHI和HindIII进行双酶切。三者酶切回收后进行连接转化，提取质粒，以引物HAF1/HAR1进行PCR鉴定(图3)。GS/GD/1/96的野生型HA基因全长为1778bp，经过突变以后应为1767bp，PCR电泳结果与预期一致。鉴定为阳性的质粒用小量质粒回收试剂盒提取质粒后溶于50μL的灭菌去离子水中，用于测序反应。测序结果表明，pUC-MutHA质粒中HA基因为1767bp，该质粒中插入的HA基因与野生基因不同，其HA裂解位点的氨基酸序列已由-RERRRKKR-突变为-RETR-，后者为典型的H5亚型低致病力禽流感病毒HA分子特征。而且，将靠近裂解位点的精氨酸(R)密码子由AGA无意突变为CGA，这样就避免了在病毒传代的过程中由于聚合酶蛋白的核苷酸序列复制作用(Polymerase stuttering)而重新在HA裂解位点插入新的碱性氨基酸而使毒力返强。
2.1.2 pBD-MutHA质粒构建以质粒pUC-MutHA为模板，以引物MutHAF1/MutHAR1进行PCR，扩增全长的MutHA基因。PCR产物在dCTP和dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理后，以胶回收试剂盒回收用于连接反应。pBD载体用SapI酶在37℃下酶切处理后用胶回收试剂盒回收，然后在dGTP和dATP存在的情况下用DNAPolymerase I Kleonw处理，胶回收试剂盒回收。PCR产物和pBD载体处理好以后，进行连接转化，提取质粒，进行电泳，以引物HAF1/HAR1进行PCR鉴定，结果为阳性。同时进行酶切鉴定，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。结果，用XhoI酶切得到了1.2Kb和4.9kb的两条带、用XbaI酶切得到了1.5kb，0.6kb和4.0kb的条带、用HindIII酶切时得到了线性化的6.1kb的片段，所得结果均与预期得到的pBD-MutHA的分析结果一致(图4)。鉴定为阳性的质粒用小量质粒提取试剂盒提取质粒后溶于50μL的灭菌去离子水中，用于测序反应。测序结果表明，pBD-MutHA质粒中HA基因为1767bp(序列见附图)，与pUC-MutHA相同，未发生突变，HA裂解位点的氨基酸序列为-RETR-，pBD-MutHA质粒简图见图5。
2.2 pBD-NA-5B19质粒构建为了构建H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株，以PCR方法将MHV S2糖蛋白5B19表位的16个氨基酸插入NA基因颈部，以此作为外源标签，具体的构建策略如图6所示。以pBD-NA为模板，利用两对引物NA-5B19-F1/NA-5B19-R1和NA-5B19-F2/NA-5B19-R2进行PCR，分别扩增含有部分5B19表位的核苷酸片段Fragment1和Fragment2。F1/R1的PCR产物全长应为306bp，F2/R2的PCR产物应为1553bp。取5ul PCR产物在进行电泳检测，结果片段Fragment1和Fragment2的大小依次分别为0.3kb和1.5kb左右(见图7)，与预期相符。两片段回收后，Fragment1用EcoRI和NsiI，Fragment2用NsiI和NotI酶切，并对pBD-NA质粒用EcoRI和NotI进行双酶切，将三者进行连接转化，提取质粒，以引物NAF1/NAR1和Marker174U24/Marker1200L25进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果，用BamHI酶切时得到了0.8Kb和5.0kb的两条带、用XbaI酶切得到了1.8kb和4.0kb的条带、用NsiI酶切时得到了线性化的5.8kb的片段，所得结果均与预期得到的pBD-NA-5B19的分析结果一致(见图7)，pBD-NA-5B19质粒简图见图8(NA-5B19序列见附图)。
2.3 H5N1/PR8-5B19的救获和病毒鉴定12种质粒共同转染293T细胞后24小时后换液，每孔补加200μl OPTI-MEM(含0.5μg/ml TPCK-Trypsin)，继续培养48-72小时。然后将转染细胞悬液接种SPF鸡胚，48小时后测定尿囊液的血凝活性。对于有血凝价的尿囊液以104稀释后，接种SPF鸡胚，48小时后收取尿囊液，提取病毒RNA，进行RT-PCR，对HA和NA基因进行序列测定，以鉴定救获病毒的HA和NA基因中是否包含所加入的分子修饰。序列分析结果表明HA基因全长为1767bp，在HA裂解位点的氨基酸组成为-RETR-，为低致病力禽流感病毒的HA基因特征；NA基因全长为1446bp，在NA基因颈部以16个氨基酸的5B19表位替代了野生型NA基因的20个氨基酸序列，因此产生的NA基因比野生型基因少了4个氨基酸，均与预期的疫苗株病毒一致。
实施例2 H5N1/PR8-5B19疫苗株的生物学特性1.材料和方法1.1 H5N1/PR8-5B19疫苗株对鸡的致病性在静脉接种致病指数(IVPI)测定试验中，选取2组10只6周龄SPF鸡，每只鸡静脉接种0.2ml 1∶10倍稀释的H5N1/PR8-5B19或H5N1/PR8病毒尿囊液，接种后10天内观察发病和死亡情况，计算IVPI。
在鼻腔感染试验中，选取2组10只6周龄SPF鸡，每只鸡以鼻腔途径接种0.1ml106EID50的H5N1/PR8-5B19或H5N1/PR8病毒尿囊液。感染后1，3，5，7，9天采集喉拭子和泄殖腔拭子进行病毒分离，并观察发病情况。感染后21天，采集血清测定血凝抑制(HI)抗体。
1.2标记疫苗株NA神经氨酸酶活性测定流感病毒的NA具有神经氨酸酶活性，作用于胎球蛋白底物，可以释放出唾液酸，亚砷酸盐可以终止这一酶活性。硫代巴比妥酸与游离的唾液酸以一定比例结合产生粉红色。为了验证插入外源表位以后对H5N1/PR8-5B19病毒的神经氨酸酶活性有无影响，利用神经氨酸酶试验进行检测。具体的操作步骤如下1.以PBS将H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒稀释成107.0EID50/0.1ml的病毒剂量，在此基础上，以0.5log10(1∶3.16)倍进行倍比稀释，分别为原液，10-0.5，10-1，10-1.5，10-2，10-2.5，10-3，10-3.5稀释。
2.病毒样品50μl各个稀释度的病毒+50μlPBS+100μl胎球蛋白；阴性对照100μlPBS+100μl胎球蛋白。样品加好后，摇动试管，封好管口，37℃水浴16-18小时。
3.水浴后，室温冷却2分钟，每管中加0.1ml过碘酸盐溶液。震荡试管，室温放置20分钟。
4.每管加1.0ml亚砷酸盐溶液，液体呈棕色，剧烈振荡至棕色消失，管内液体变为白色。
5.每管加2.5ml硫代巴比妥酸溶液，剧烈振荡，快速置于试管架上沸水浴15分钟。硫代巴比妥酸与游离的唾液酸以一定比例结合变成粉红色。
6.冰浴冷却试管，冷却后离开水浴，加入warrenoff溶液5ml，盖好管口，拧紧，200rpm离心10分钟，小心吸取上层的丁醇相到比色杯中，在分光光度计测定549nm处的OD值。在测病毒样品之前，以胎球蛋白阴性对照组做空白对照。
7.通过绘制NA活性曲线来判断NA活性，横坐标为病毒稀释度，纵坐标为549nm处的OD值。
1.3 H5N1/PR8-5B19疫苗株的鸡胚生长特性为了测定H5N1/PR8-5B19疫苗株的鸡胚生长特性，选择H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒，以每个鸡胚103EID50的剂量接种9-11日龄鸡胚。鸡胚接种后分别在18，24，30，36，42，48，54，60，72和96小时各取10个鸡胚。将每组10个鸡胚尿囊液以同等比例混合后，测定尿囊液血凝价，然后绘制病毒生长曲线，观察病毒的生长特性。
1.4 H5N1/PR8-5B19疫苗株中HA和NA的遗传稳定性H5N1/PR8-5B19疫苗株的HA基因经过分子修饰致弱，NA基因经过修饰插入了外源表位5B19，为了验证经过修饰后的HA和NA基因的遗传稳定性，将H5N1/PR8-5B19疫苗株在SPF鸡胚上进行14次传代。为了验证插入的5B19表位在NA基因中能否稳定存在，是否会因为病毒传代而发生丢失，分别选取第1，5，10，12，14代的病毒尿囊液，利用Trisol LS试剂提取病毒的RNA，以流感病毒的特异性引物Uni-12进行反转录产生病毒的cDNA。然后利用NA-5B19基因的特异性引物进行PCR扩增，引物序列为Marker 174U24/Marker 1200L25，然后进行电泳检测。
2.结果2.1 H5N1/PR8-5B19疫苗株对鸡的致病性以灭菌PBS将H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒尿囊液做1∶10倍稀释后，分别测定对于6周龄SPF鸡的静脉接种致病指数(IVPI)，结果这两株人工救获的病毒对鸡均为低致病性毒株，在感染后10天内没有出现任何发病症状，也没有死亡，IVPI为0。采集感染后21天血清，以血凝抑制试验检测HI抗体，结果表明所有10只鸡HI抗体水平都在7-9log2之间，表明病毒在鸡体内进行了复制。
H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒尿囊液分别以106EID50的病毒剂量鼻腔感染6周龄SPF鸡，在感染后14天内试验鸡无异常，不发病，不死亡，采取感染后1，3，5，7，9天的喉拭子和泄殖腔拭子进行病毒分离，结果均为阴性。感染后21天，采集血清测定血凝抑制(HI)抗体，结果在每种病毒感染的10只鸡中只有2只鸡检测到很低水平的HI抗体(＜3log2)。分析表明两株病毒在鼻腔感染后不能在鸡的呼吸道内复制，个别鸡所产生的低水平的HI抗体是由接种病毒本身作为抗原刺激机体产生的。
2.2 标记疫苗株H5N1/PR8-5B19神经氨酸酶(NA)活性测定为了确定在NA基因颈部插入外源性的5B19表位后是否会降低H5N1/PR8-5B19疫苗株NA的神经氨酸酶活性，将H5N1/PR8和H5N1/PR8-5B19病毒稀释至含有相同的病毒感染剂量后进行梯度稀释检测神经氨酸酶活性，如图9所示。
H5N1/PR8和H5N1/PR8-5B19两病毒的遗传背景相同，只是在H5N1/PR8-5B19的NA基因颈部插入了外源性的MHV的5B19表位，从图9可以看出，H5N1/PR8-5B19病毒的神经氨酸酶活性明显低于H5N1/PR8。例如病毒稀释度在1.5log10时，H5N1/PR8的549nm的OD值仍为1.31，而H5N1/PR8-5B19则已经降低到0.097。
2.4.3 H5N1/PR8-5B19疫苗株的鸡胚生长特性H5N1/PR8-5B19病毒的神经氨酸酶活性因为在NA基因颈部插入了5B19表位而降低，为确定是否会因此而影响病毒的生长特性，进行病毒的鸡胚增殖试验。选取H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒，分别以尿囊腔途径接种9-11日龄鸡胚，每个鸡胚接种103EID50的病毒剂量。鸡胚接种后分别在18，24，30，36，42，48，54，60，72和96小时各取10个鸡胚，将每组10个鸡胚尿囊液以同等比例混合后，测定尿囊液血凝价，绘制病毒生长曲线，结果见图10。
H5N1/PR8-5B19以及H5N1/PR8病毒在接种鸡胚后96小时内均不致死，表明两株病毒对鸡胚均为低致病性毒株。如图10所示，H5N1/PR8在接种鸡胚后18小时尿囊液没有检测到血凝活性，在接种后24小时尿囊液则出现血凝性，HA价为2log2，此后随着病毒在鸡胚中的复制，尿囊液的血凝价迅速提高，在接种鸡胚后72小时生长滴度为最高，达到11 log2，在96小时尿囊液血凝价稍有下降，但仍然在10.5 log2。H5N1/PR8-5B19在接种鸡胚后18小时尿囊液也没有血凝活性，在24小时尿囊液血凝价为1 log2，随后尿囊液的血凝价迅速提高，也在接种鸡胚后72小时达到生长高峰，尿囊液血凝价为10.5log2。从总体上看，H5N1/PR8病毒在鸡胚中的生长滴度要高于H5N1/PR8-5B19，但是两者之间并不存在显著差异。结果表明虽然H5N1/PR8-5B19 NA基因中插入了外源性的5B19表位，导致病毒的神经氨酸酶活性降低，但是标记疫苗株病毒仍然具有良好的鸡胚生长特性。
2.4.4 H5N1/PR8-5B19疫苗株的遗传稳定性H5N1/PR8-5B19疫苗株的HA基因经过分子修饰致弱具有了低致病性禽流感病毒的HA基因裂解位点的特征，NA基因经过修饰插入了外源表位5B19，为了验证在HA和NA基因中加入的分子修饰能否随着病毒的传代而稳定存在，将H5N1/PR8-5B19疫苗株在SPF鸡胚上进行连续14次传代。在传代过程中H5N1/PR8-5B19病毒株对鸡胚始终不致死，表明HA基因的低致病力特征得到保持，没有出现毒力返强的现象，表明该疫苗株具有高度的生物安全性。
为了验证插入的5B19表位在NA基因中能否稳定存在，是否会因为病毒传代而发生丢失，分别选取第1，5，10，12，14代的病毒尿囊液，提取病毒RNA，进行RT-PCR，以NA-5B19基因的特异性引物Marker 174U24/Marker 1200L25进行PCR扩增。电泳结果如图11所示，结果得到了长约1kb的条带，与预期大小1051bp一致。阴性对照选择H5N1/PR8的病毒尿囊液，PCR没有扩增出目的大小的片段。结果表明，所插入的5B19表位能够在H5N1/PR8-5B19病毒中稳定存在，可以作为稳定的外源表位标签用于标记疫苗的生产。
实施例3 一种能够区分H5N1/PR8-5B19标记疫苗免疫血清和非标记疫苗免疫血清或自然感染鸡血清的ELISA检测方法的初步建立1.材料与方法1.1 ELISA操作程序为了能够利用血清学方法区分标记疫苗免疫鸡和非标记疫苗免疫鸡或自然感染H5N1亚型禽流感病毒的鸡，建立了一种间接法的多肽酶联免疫吸附实验方法，具体步骤如下1.抗原包被人工合成鼠肝炎病毒5B19表位的16个氨基酸(“SPLLGCIGSTCAEDGN”)作为包被用抗原。多肽合成后，溶解于双蒸水中，用pH9.2的碳酸盐缓冲液将多肽稀释成一定浓度。在酶标板的每孔内加入100μl多肽包被液，于4℃冰箱中包被16-24小时。
2.封闭抗原包被后，将酶标板中的包被液弃掉，以PBST洗液清洗三次。然后每孔加入5％的明胶100μl封闭样品孔，于37℃湿盒中封闭2小时。
3.加入一抗血清酶标板封闭后，弃掉封闭液，用PBST洗液洗涤三次。将一抗血清以PBST做一定倍数稀释后，每孔加入100μl，于37℃湿盒中作用90分钟。
4.加入酶标二抗一抗血清作用结束后将其弃掉，以PBST洗液洗涤三次。然后以PBST(Phosphate Buffered Saline/Tween)将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体做1∶5000倍稀释，每孔加入100μl，于37℃湿盒中作用90分钟。
5.加入底物显色二抗作用结束后将其弃掉，以PBST洗液洗涤三次。然后每孔加入100μl配制好的OPD底物。于37℃湿盒中显色10至15分钟。
6.终止反应显色结束后，每孔加入50μl 2M的H28O4终止液终止反应。
7.测定光密度OD值显色反应终止后利用酶标仪测定490nm的OD值。
1.2 抗原包被浓度和血清稀释度试验用包被缓冲液将人工合成的5B19多肽稀释成2μg/100μl，1μg/100μl，0.5μg/100μl，0.25μg/100μl四个不同浓度，包被酶标反应板，每孔100μl，每个滴度两孔，4℃过夜。用PBST将H5N1/PR8-5B19标记疫苗免疫鸡血清和自然感染H5N1亚型禽流感病毒的耐过鸡血清分别做1∶50，1∶100，和1∶200，1∶400倍稀释，组成方阵。抗原包被完成后，用封闭液于37℃封闭2小时，洗涤后，加入不同稀释度的一抗血清，37℃作用1.5小时后洗涤，然后每孔加入100μl 1∶5000稀释的酶标二抗按照上述ELISA程序进行。同时设定不加血清对照组，以同样的程序测定。
1.3 判定标准试验抗原和血清稀释度确定以后，按照所确定的方法对50份H5N1禽流感病毒试验感染耐过鸡血清和H5N1亚型非标记疫苗免疫血清进行ELISA测定，对结果进行统计分析。
2.结果2.5.1 抗原包被浓度和血清稀释度的确定表2抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定
5B19多肽抗原以2-0.25μg/100μl包被反应板，血清从1∶50到1∶400倍比稀释，酶标二抗1∶5000倍稀释，从方阵试验结果(表2)看，随着血清稀释倍数的增加和抗原包被浓度的降低，血清的OD值随之降低，当血清稀释度在1∶100，多肽包被浓度在1μg/100μl时，阳性血清OD值接近于1.0，阴性血清OD值＜0.2，并且阳性和阴性血清的比值(P/N)值为最高，因此此时多肽及阳性血清的稀释度为最佳工作条件。据此，确定多肽抗原的包被浓度为1μg/100μl，血清的最佳稀释度为1∶100。
2.5.2 判定标准的确定选取50份H5N1亚型禽流感病毒非标记疫苗免疫血清和H5N1亚型禽流感病毒实验感染后的耐过鸡血清，按照所建立的方法进行ELISA检测，结果表明50份血清的OD值在0.123至0.267之间，样品平均值和标准差分别为X＝0.188，SD＝0.036，得到置信区间上限X+3SD＝0.298≈0.30，将0.30作为非标记疫苗免疫鸡或自然感染鸡血清OD值的上限，根据统计学原理，当血清样品OD值＞X+3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。因此我们得出间接ELISA判定标准，即待测样品的OD值大于0.30为阳性，小于或等于0.30则为阴性。
实施例4 H5N1/PR8-5B19疫苗免疫试验1.材料与方法1.1 灭活疫苗的制备将H5N1/PR8-5B19病毒尿囊液稀释后，以尿囊腔途径接种9-11日龄鸡胚，每个鸡胚接种103EID50的病毒剂量，接种后继续孵化48小时后收取鸡胚尿囊液，测定血凝价在9-11log2之间。经过1000rpm/min低速离心后去除组织和细胞碎片，取上清以0.25％的比例加入福尔马林于4℃灭活72小时。为了验证灭活效果，取灭活后的尿囊液接种鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，于37℃培养48小时后检测接种鸡胚的尿囊液血凝性，结果表明灭活后所接种鸡胚尿囊液HA检测均为阴性，说明已经灭活完全。灭活以后按照93∶7∶150(尿囊液∶吐温∶矿物油)的比例混合，利用涡流混合器反复搅拌以达到充分乳化的目的，直至以注射器滴出时在水面上不散开为止，至此疫苗即制备完成。
1.2 疫苗免疫后HI抗体和5B19表位ELISA抗体的检测为了确定H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗的免疫原性，以及能否通过多肽ELISA检测方法区分出标记疫苗免疫鸡和非标记疫苗免疫鸡以及自然感染H5N1亚型禽流感病毒的鸡，进行SPF鸡的疫苗免疫试验。将4周龄SPF鸡随机分为2组，每组10只。第一组用H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗免疫，每只鸡0.4ml，经腿部分两点肌肉注射。第二组用，H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗免疫，每只鸡0.4ml，免疫两周后，以同样的途径和剂量加强免疫一次。免疫后每周采集免疫血清，直至免疫后的12周，检测HI抗体水平，同时以ELISA方法检测免疫后3周，6周和12周针对于5B19表位的ELISA抗体。
1.3 H5N1/PR8-5B19灭活疫苗对SPF鸡的免疫保护试验为了评价H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗的免疫保护效果，选取10只4周龄SPF鸡肌肉注射0.4ml灭活疫苗，同时设立10只非免疫SPF鸡对照。免疫后三周，采集血清，测定HI抗体，然后以106EID50剂量的H5N1强毒GS/GD/1/96经鼻腔途径进行攻击，攻毒后观察发病和死亡情况，以确定疫苗的免疫保护效果，并采集攻毒后3天的喉头拭子和泄殖腔拭子，对于在3天内死亡的鸡则采集死亡当天的拭子，棉拭子采集后在9-11日龄鸡胚中进行病毒滴定。
2.结果标记疫苗免疫后HI抗体和5B19表位ELISA抗体的检测2.1 HI抗体检测如图12所示，H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗以0.4ml单次免疫后，10只SPF鸡免疫后一周均未检测到HI抗体，免疫后2周所有鸡均可检测到HI抗体，HI抗体水平在免疫后4周达到高峰，为8log2左右，当检测到免疫后的12周时HI抗体水平没有出现明显的下降，仍在7.5log2以上。第二组试验鸡免疫后第一周也没有检测到HI抗体，免疫后两周时抗体水平达到5log2左右，然后以同样的剂量加强免疫，继续检测到免疫后的12周，抗体水平在第一次免疫后的5周达到高峰，可以达到11.5log2，然后在高峰持续很长时间，当检测到12周时所有鸡的HI抗体水平仍然在10log2左右。上述实验结果表明H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗具有良好的免疫原性，可以诱导产生高水平的HI抗体。
2.2 针对于5B19表位的ELISA抗体检测表3单次免疫和加强免疫后ELISA抗体检测
以所建立的多肽ELISA方法对单次免疫和加强免疫后3，6，和12周的免疫鸡血清中针对于5B19表位的抗体进行检测，结果如表3所示。单次免疫后3周10实验鸡只有两只鸡产生了ELISA抗体，免疫后6周和12周则有7只鸡产生了ELISA抗体，到最后仍有3只鸡没有检测到抗体。在第一次免疫后2周加强免疫的试验组，在免疫后3周(以第一次免疫计算)有4只鸡产生ELISA抗体，在免疫后的6周和12周所有的10只鸡都产生了针对于5B19表位的抗体。此外和HI抗体比较，针对于5B19表位的ELISA抗体出现的更晚一些，在免疫后3周只有个别鸡产生抗体。
2.3 标记疫苗免疫保护试验以H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗免疫10只4周龄SPF鸡，每只鸡肌肉注射0.4ml灭活疫苗，同时设立10只非免疫SPF鸡对照。免疫后三周，采集血清，测定HI抗体，结果H5N1/PR8-5B19灭活标记疫苗免疫三周后HI抗体可以达到8log2以上，对照组均为HI抗体阴性。然后以106EID50剂量的H5N1强毒GS/GD/1/96经鼻腔途径进行攻击，标记疫苗免疫鸡攻毒后未出现任何临床症状，也没有死亡，攻毒后三天喉头拭子和泄殖腔拭子均未分离到病毒，而对照组10只鸡在攻毒后6天内全部死亡，喉头拭子和泄殖腔拭子均分离到很高滴度的病毒。实验结果说明标记疫苗对免疫鸡提供了完全保护(表4)。
表4H5N1/PR8-5B19灭活疫苗对SPF鸡的免疫保护
H5N1亚型高致病性禽流感病毒流行范围广泛，给养禽业造成了严重危害，尤其是2003年底始于韩国席卷整个东南亚地区的H5N1亚型禽流感大流行更是给养禽业带来了灾难性的打击。野生鸟类和鸭，鹅等水禽是流感病毒的自然宿主，流感病毒在这些宿主体内稳定进化，并且进一步传播给家禽(Chin，et al，2002；Webster，et al，2002)。本实验室的研究表明H5N1亚型禽流感病毒可以在健康鸭子体内存在而不出现任何临床症状(Chen，et al，2004)，这使得从根本上消灭禽流感病毒似乎是不可能的。因此，除了加强流行病学监测和生物安全措施，疫苗免疫是是防制禽流感发生的主动措施和关键环节。
目前，在全世界范围内，全病毒灭活油乳剂疫苗是应用最为广泛的禽流感疫苗(Subbarao，et al，2003)。灭活疫苗安全性好，抗原组分齐全，免疫原性强，可以给免疫鸡群提供良好的免疫保护。油苗的使用有效的控制了1995年墨西哥HPAI疫情的扩散和进一步蔓延(Garcia，et al，1998)。在我国，H9N2和H5N1亚型灭活疫苗也得到了广泛的应用，为禽流感疫情的控制起到了积极作用。理想的灭活疫苗种毒株应该具备以下4方面的条件第一、良好的抗原针对性，即疫苗株病毒应该具有和流行病毒相一致的抗原性；第二、高度生物安全性，疫苗株病毒对鸡和其它动物以及人不应具有致病性；第三、高度鸡胚生长适应性，疫苗株应该在鸡胚上有效复制，所制备的疫苗抗原含量高，可以确保免疫效果。第四、疫苗的应用不会干扰禽流感的疫情调查和流行病学监测。
我国分离到的H5N1亚型禽流感病毒均为高致病性毒株，而且部分毒株已经获得对哺乳动物的高致病性(Chen，et al，2004)，接种鸡胚后，可以很快的致死鸡胚，病毒在鸡胚内很难复制达到较高的滴度，因此将其做为疫苗株既无法保证疫苗的生物安全性，也不能确保疫苗株的有效抗原量和免疫效果。从国外引进的弱毒疫苗株虽然不存在这样的缺点，但是又缺乏和我国流行毒株一致的抗原性，所以从国外引进的标准疫苗株也不适用于作为生产防制我国禽流感疫苗的理想毒株。
因此，为了构建既具有高度的鸡胚生长适应性，生物安全性和良好抗原针对性，又不会干扰流行病学监测的H5N1亚型禽流感病毒灭活疫苗株，本研究中人工救获了H5N1亚型重组流感病毒株H5N1/PR8-5B19，其六个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株A/Puerto Rico/8/34(PR8)(H1N1)，HA和NA基因来源于我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96。通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续的碱性氨基酸，使其具备了低致病性禽流感病毒的HA基因特征。在NA基因的颈部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19。H5N1/PR8-5B19作为标记疫苗和一种多肽酶联免疫吸附实验方法结合起来可以区分标记疫苗免疫鸡和自然感染鸡。其理论依据是1.A/PR/8/34是最常用的内部基因供体株，借以提高重组疫苗株的生长特性目前世界上应用的人流感病毒疫苗株是三价流感病毒灭活疫苗，包括H1N1，H3N2亚型A型流感病毒，以及B型流感病毒(Subbarao，et al，2003)。其中所包括的H1N1和H3N2流感病毒都是6+2重排流感病毒，也就是具有流行毒株的两个表面基因HA和NA，另外六个内部基因PB2，PB1，PA，NP，M，和NS则是由高滴度鸡胚适应株A/PR/8/34提供。这样所构建的重组流感病毒既具有流行毒株的主要免疫原性基因HA和NA，和流行毒株具有相一致的抗原匹配性，能够最大限度的提供对流行毒株的免疫保护。另一方面，A/PR/8/34是多次传代后的鸡胚生长适应株，在鸡胚生长后不致死，具备良好疫苗株生长滴度高的特点。A/PR/8/34的高鸡胚生长特性主要是由M基因决定的(Kilbourne，et al，1969)。
2.GS/GD/1/96病毒具有和我国现有H5N1亚型禽流感病毒良好的抗原一致性对我国1996年以来不同时期，不同地域，不同宿主分离的大量H5亚型高致病性禽流感病毒进行了系统的抗原性分析，证实所有毒株在起主要免疫保护作用的HA基因上没有发生明显变异，与我国最早分离的鹅源GS/GD/1/96病毒株抗原性基本一致(田国彬等，2004)。
3.流感病毒HA基因是分子修饰致弱的主要靶基因H5N1亚型禽流感病毒对鸡呈高致病力，对鸡胚呈高致死性(Shortridge，et al，1998；Suarez，et al，1998；Subbarao，et al，1998)。9-11日龄鸡胚中培养的病毒尿囊液是流感病毒疫苗生产的最主要方式。尽管可以通过提高鸡胚的孵化温度，延长孵化时间来提高其在鸡胚上的生长性能，H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚上的生长滴度很难得到提高，不利于疫苗生产(Takada，et al，1999)。HA基因裂解位点具有多个连续的碱性氨基酸是禽流感病毒具有高致病性的重要决定因素和必要条件(Steinhauer，et al，1999；Taubenberger，1998)，低致病力AIV的HA裂解位点只有一个碱性氨基酸-精氨酸(R)，高致病力AIV的HA裂解位点含有连续多个碱性氨基酸。HA裂解位点的多个碱性氨基酸提高了高致病性禽流感病毒的组织嗜性，可以在机体的多个重要器官复制，因此导致感染鸡的全身性和致死性疾病(Senne et al，1996)。因此疫苗设计的一个重要策略就是通过突变的方法去除HA基因裂解位点的多个碱性氨基酸，使其具有低致病力禽流感病毒的HA基因特征，所产生的流感病毒疫苗株则成为对鸡胚无致死性的低致病力毒株。根据此种策略，美国学者相继构建了1997香港H5N1亚型人流感病毒HA基因分子修饰致弱的冷适应重组病毒和鸡胚高滴度适应重组病毒(Subbarao，et al，2003；Li，et al，1999)。在本研究中，将GS/GD/1/96HA基因裂解位点的RERRRKKR-突变为-RETR-，缺失了4个碱性氨基酸，并把一个赖氨酸(K)突变为苏氨酸(T)，将靠近裂解位点的精氨酸密码子AGA无意突变为CGA，以避免由于聚合酶的核苷酸序列复制作用而重新在裂解位点处插入多个碱性氨基酸。这种情况见于1995年墨西哥的高致病性H5N2亚型禽流感病毒，在最初的流行中只有低致病性病毒，但随着流行则出现了HPAI，经过分析，是由于在裂解位点的HA基因的RNA序列形成了发卡结构，聚合酶蛋白将核苷酸序列AAAGAA复制后插入到RNA的发卡结构而增加了两个额外的碱性氨基酸赖氨酸(K)和精氨酸(R)，而使之突变为具有高致病性禽流感病毒(Garcia，et al，1996)。
4.流感病毒的NA基因是进行分子修饰构建标记疫苗株的理想基因近年来，标记疫苗在兽医领域广泛用于病毒性传染病的消灭计划，越来越得到重视。标记疫苗设计的常用策略就是通过修饰删除疫苗株病毒中的非必需但是具有免疫原性的抗原基因。与之相配套的检测方法的基础就是标记疫苗免疫的动物血清中检测不到针对于缺失抗原的抗体，而自然感染的动物血清中则含有缺失抗原的抗体，因此就可以把标记疫苗免疫的动物和自然感染的动物区分开来。这种策略已经在很多病毒疫苗的设计中得到了应用，诸如伪狂犬病病毒，牛瘟病毒，典型猪瘟病毒等(van Oirschot，et al，1996；Walsh，et al，2000；van Gennip，et al，2002；Widjojoatmodjo，et al，2000)。其中作为选择标记的缺失抗原的重要标准就是在感染动物中该抗原能够产生快速和持续时间长的抗体反应，而在标记疫苗免疫的动物血清中则不能检测到针对该抗原的抗体反应。
上述策略对于流感病毒标记疫苗的设计似乎是不适用的。因为在流感病毒中HA基因是主要的免疫原性基因，是诱导保护性免疫的主要抗原成分，如果将其缺失所产生的疫苗株将随之失去相应的免疫保护作用。对于流感病毒标记疫苗设计的一个可供选择的方法就是将流感病毒某一基因的一部分用无关病毒的表位进行替代。流感病毒的NA基因具有这样的优势，可以用外源表位替换NA基因的一部分非必须区。
5.流感病毒的反向遗传操作系统是构建良好流感病毒疫苗株的有效方法利用以质粒为基础的反向遗传操作系统是对流感病毒基因组进行修饰构建具有所需要特征疫苗株的最佳方法和有效途径。利用这一技术，可以把一个良好疫苗株所应有的特性集于一身。所救获的流感病毒疫苗株具有A/PR/8/34病毒的六个内部基因，和H5N1病毒株GS/GD/1/96的HA和NA基因。该疫苗株既具有高滴度鸡胚生长性，又具有对鸡的低致病性，对鸡胚的不致死性，以及在NA基因插入了外源表位标签可以作为标记疫苗的特性，因此也就具备了一个良好疫苗株所应该具备的各种条件。
H5N1/PR8-5B19疫苗株病毒接种后96小时内不致死鸡胚，虽然在NA基因颈部插入了外源性的表位明显降低了NA的神经氨酸酶活性，但这并没有影响病毒在鸡胚中的复制，在感染鸡胚后72小时尿囊液的血凝价可以达到10.5lo2，鼻腔感染和静脉感染后对鸡不致病，病毒在鸡胚传代过程中没有出现毒力返强，表明HA基因的分子修饰稳定存在，而且在病毒传代过程中插入NA基因颈部的MHV病毒5B19表位没有发生缺失，作为外源性的标签得以稳定传代，因此保证了其作为分子修饰致弱的标记疫苗株的各种条件。
H5N1/PR8-5B19灭活疫苗免疫后，第二周即可检测到HI抗体，单次免疫后4周，HI抗体水平达到高峰，到免疫后的12周还没有出现明显的下降；单次免疫后加强免疫一次可以明显提高免疫所产生的HI抗体水平，在高峰时HI抗体滴度可以达到11.5log2，并且可以在高峰期持续很长时间，这些表明H5N1/PR8-5B19灭活疫苗具有良好的免疫原性。疫苗免疫后对高致病性H5N1亚型禽流感病毒的攻击提供完全保护，免疫鸡攻毒后不发病，不死亡，而且在喉拭子和泄殖腔拭子中均未分离到病毒，保证了其作为疫苗应用的有效性。
为了区分免疫动物和感染动物，更为重要的是检测针对于标记疫苗株5B19表位的ELISA抗体。5B19表位是鼠肝炎病毒S2糖蛋白中的优势B细胞表位，该表位具有很强的免疫原性(Koolen，et al，1990；Luytjes，et al，1987，1989；Talbot，et al，1984)，并且用于鸡新城疫病毒标记疫苗的研究(Mebatsion，et al，2002)。
人工合成MHV 5B19表位的16个氨基酸，将其作为抗原包被ELISA板，以间接法进行ELISA实验，检测免疫鸡血清中针对于该表位的ELISA抗体。在对阴性血清样品进行检测确定ELISA检测方法的判定标准实验中，50份阴性鸡血清的ELISA检测OD值在0.123-0.267之间，阴性值稍高。可能的原因是，5B19抗原表位16个氨基酸中两端的氨基酸具有非特异性，因此能够和阴性血清中的某些成分发生非特异性结合，进一步的改进方法是只合成该表位中起核心作用的10个氨基酸“LLGCIGSTCA”，或者利用原核表达系统表达该表位后包被反应板进行ELISA，以此进一步优化ELISA检测方法。尽管如此，利用所建立的ELISA方法，可以有效区分标记疫苗免疫鸡和自然感染鸡或非标记疫苗免疫鸡。结果表明，在标记疫苗单次免疫后的第3周有部分鸡产生ELISA抗体，在第6周和12周10只鸡中有7只鸡ELISA抗体检测阳性，其它3只鸡没有出现ELISA抗体，而且与疫苗免疫后所产生的HI抗体比较，ELISA抗体出现的更晚一些。究其原因可能是在疫苗株的构建中，将5B19表位插入了NA基因颈部，这一部位处于NA分子庞大的头部的掩盖之下，因此使得插入的表位不容易被免疫系统所识别。但是，当在单次免疫后以同样的途径和剂量加强免疫一次，在免疫后3周时4只鸡产生抗体，当在6周和12周检测时，所有的10只鸡均检测到抗体。因此对于标记疫苗的应用应该确定合理的免疫程序，并进一步确定免疫持续期，最佳免疫剂量等。此外，借助反向遗传操作系统这一对流感病毒基因组进行修饰的有利工具，可以通过进一步的探索，对于流感病毒的HA和NA基因进行分子修饰，优化外源表位插入位点，构建既不显著影响流感病毒的复制和HA及NA的免疫保护作用，也能够产生很强的针对外源表位抗体反应的流感病毒标记疫苗株。
结论1.利用反向遗传操作系统人工构建了一株低致病力的、高度鸡胚适应的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19。病毒多次传代后毒力不返强，且其分子标记5B19序列可稳定遗传。
2.以人工合成的含有5B19序列的短肽为抗原，建立了抗5B19表位抗体的ELISA检测方法。
3.H5N1/PR8-5B19灭活疫苗一次免疫SPF鸡后可以诱导产生高水平的HI抗体，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供完全保护，即免疫鸡不发病，不死亡，不排毒。以常规免疫剂量于初免后2周加强免疫一次，所有鸡只均能产生可检测到的抗5B19抗体。因此可以H5N1/PR8-5B19为疫苗株研制可与自然感染相鉴别的标记疫苗，用于H5N1亚型禽流感的防制。
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1.在NA基因的颈部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其中所述鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其通过包括以下步骤的方法制备(1)将H5N1亚型禽流感病毒的负链病毒vRNA的转录质粒、聚合酶基因的蛋白表达质粒、HA基因转录质粒和插入鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的NA基因的转录质粒与转染试剂混合作用；(2)将作用后的质粒和转染试剂的混合物共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(3)收获转染后的细胞，接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。
3.根据权利要求2的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其中所述HA基因是人工缺失裂解位点处连续多个碱性氨基酸的突变型HA基因。
4.根据权利要求1的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其为H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8-5B19。
5.根据权利要求4的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，其通过包括以下步骤的方法制备(1)将vRNA转录质粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS，四个聚合酶基因的蛋白表达质粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP以及分子修饰致弱的HA基因双向转录质粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因双向转录质粒pBD-NA-5B19与转染试剂混合作用；(2)将作用后的质粒和转染试剂的混合物共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(3)收获转染后的细胞，接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株，其中优选所述宿主细胞是293T细胞。
6.根据权利要求1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗在制备治疗和/或预防禽流感病毒所导致的疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗在禽流感流行病学监测中的应用。
8.根据权利要求7的应用，其中所述禽流感流行病学监测包括利用ELISA法检测目标生物体内的HI抗体和5B19表位的抗体的步骤，其中所述目标生物已经被施用了所述H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
9.一种禽流感灭活疫苗，其包含根据权利要求1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
10.一种用于区分禽流感疫苗免疫家禽和禽流感自然感染家禽的试剂盒，其包含根据权利要求1-5中任何一项的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种在NA基因的颈部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗，更具体地，其为H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1/PR8－5B19。本发明还公开了制备所述H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的方法和该标记疫苗在制备预防禽流感的疫苗和在禽流感流行病学监测中的应用。
文档编号C12N15/44GK1970081SQ200610114408
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月9日 优先权日2006年11月9日
发明者陈化兰, 田国彬, 姜永萍, 步志高, 于康震 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所