专利名称：鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法及其专用引物。
背景技术：
牦牛是家养动物中地理分布范围极其有限的珍奇家畜之，牦牛奶及其奶制品相对于普通牛奶，以其稀有和高的营养价值而称著。因此就出现了一些不法商贩，在牦牛奶中掺入普通牛奶从中谋取更高的利润，使消费者的利益受到了极大的损害。
牦牛主要生活在海拔2000-4500m的高原、高山、亚高山的寒冷半湿润地区。中国牦牛占世界牦牛的90％以上，主要分布在青藏高原中心地带及其东部边缘地区。牦牛的分布极其有限，作为珍奇的家畜品种，牦牛可以为人们提供乳、肉、脂肪、毛、绒、皮等产品。这些产品中特别是乳的加工、利用形式种类多样。由于牦牛乳制品的营养价值高，产量稀少，因此其市场价格要比普通牛乳制品高的多。
牦牛的产乳季节在每年5月产犊后至11月，泌乳高峰期在7、8月份，产乳期约为150天。牦牛的产乳量比较低，150天挤乳期内的产乳量为350kg左右，平均每日挤乳量1.0-2.5kg左右。在牦牛各地方品种中以新疆巴州牦牛最高，2.5kg/天。而在国内普通奶牛泌乳期分为305天，平均产奶量为4000kg，平均每天挤乳量为13.5kg。从营养成分上比较，牦牛奶的营养成分含量要比普通牛奶高的多，图1比较了普通牛乳、初乳与牦牛乳液、初乳之间的营养成分含量上的差异。从数据中可以看出，牦牛奶的两个主要特点营养价值高，而且稀有。
哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)的长度为16kb左右，人类的mtDNA的长度为16569bp；mtDNA呈闭合环状结构，位于线粒体基质内，每个细胞中有上千拷贝线粒体(依细胞类型不同而异)。线粒体DNA呈双链，一条富含鸟嘌呤的重链(H)，一条富含胞嘧啶的轻链(L)。重链编码12个多肽链，14个tRNA和所有的rRNA；轻链编码一个多肽链，8个tRNA。线粒体编码的基因内部没有内含子，基因内所有编码序列紧密相连。
线粒体DNA中仅有的非编码区是D-loop区(Displacement loop)，在人类线粒体DNA中该区域长1121bp，该区域包含有重链复制起始位点(OH)和轻链，重链的转录启动子区。线粒体DNA的复制起始于两个区域，复制最初在RNA引物的作用下发生在重链复制起始位点OH，当重链的合成到整个线粒体DNA的三分之二时，置换出来的部分亲本重链到达轻链复制起始位点(OL)，该位点位于五个tRNA基因簇中；当轻链复制起始位点被置换出来后，OL折叠成发卡结构，DNA聚合酶以置换出的重链为模板起始新轻链的合成；随后线粒体DNA进行非同步双向合成。
线粒体DNA呈母系遗传，单个卵母细胞中线粒体DNA可以达到100,000个拷贝，然而在精子中线粒体DNA仅含100～1500个拷贝。在受精过程精子中的线粒体进入卵母细胞，但是在胚胎发生的二细胞期和四细胞期逐渐消失。通过人工受精和单精注射的方法发育形成的个体中，来自父系的线粒体DNA也检测不到。
线粒体自身缺乏有效的DNA修复系统，同时也没有象组蛋白那样的有保护功能的蛋白质；而且线粒体DNA还暴露在由OXPHOS过程中产生的强诱变剂——氧自由基。另外线粒体中异常的代谢可能也会积累突变的线粒体DNA。这些比较独特的性质导致了线粒体DNA多态的积累速度要比核DNA快10～17倍。与编码区相比线粒体DNA的非编码区的突变率要高5-10倍。
线粒体DNA非编码区也就是D-loop区的高突变特性，以及单细胞中线粒体DNA的高拷贝的特性，使得其在样本鉴别中与核DNA相比存在着巨大的优势(1)对高度降解的样本有相对高的检测灵敏度，(2)可以检测痕迹量的样本，(3)高突变率使得它有比核DNA有更高的物种间或物种内的特异性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法。
本发明所提供的鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法，包括以下步骤1)以从待测牦牛奶制品中提取的DNA为模板，利用核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR反应；2)检测PCR扩增产物中是否有DNA条带，如PCR扩增产物中有DNA条带，则待测牦牛奶制品中掺杂有普通牛奶。
所述DNA条带的大小可为445bp(对所有的普通牛品种或个体，该DNA条带大小都是445bp)。
所述牦牛可为所有牦牛(Bos grunniens)品种。虽然不同牦牛品种或个体之间的D-loop区都会有个别碱基的差异，但是对本发明的PCR扩增没有影响，用上述序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，均得不到DNA条带。
所述普通牛可为所有Bos taurus种属的牛品种。虽然不同普通牛品种或个体之间的D-loop区都会有个别碱基的差异，但是对本发明的PCR扩增没有影响，用上述序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，均得到445bp的DNA条带。
上述方法中还包括对待测牦牛奶制品进行预处理的步骤；所述预处理的方法为将待测牦牛奶制品进行截留分子量为8000-12000Da的透析，然后向透析后的牦牛奶制品中加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的终浓度为10mmol/L、EDTA的终浓度为5mmol/L、NaCl的终浓度为50mmol/L、蛋白酶K的终浓度为200ug/ml，50℃反应2小时。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的一对引物。
本发明所提供的用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的一对引物，其核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2。
本发明的又一个目的是提供一种用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的试剂盒，其含有核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2的一对引物。
所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
本发明根据乳液在挤出过程中会随之带出一些体细胞(平均3.9×104个/毫升)，从奶制品中提取微量的DNA，而线粒体DNA的D-Loop区在牦牛和普通牛之间存在较大的差异，根据他们之间的差异设计普通奶牛特异的引物，通过PCR方法对掺假牦牛奶制品进行鉴定。
本发明的鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法快速(只需6小时)、准确、灵敏。
图1为中国牦牛乳及初乳营养成分平均含量与普通奶牛之间的差异。
图2为普通牛D-loop(NC_006853)和牦牛D-loop(NC_006380)之间所存在的差异。
图3为引物Milk-id-F和Milk-id-R的牦牛和普通牛混合乳液的扩增结果。
图4为引物Milk-id-F和Milk-id-R的牦牛和普通牛混合奶粉的扩增结果。
具体实施例方式
本发明分析了牦牛线粒体DNA D-loop区序列(NC_006380，序列表中序列4)和普通牛线粒体DNA D-loop区序列(NC_006853，序列表中序列3)之间的差异。结果如图2所示，序列中Yak为牦牛线粒体DNA D-loop区的序列，Cattle为普通奶牛线粒体DNA D-loop区的序列，Majority为它们之间的保守序列。方框表示正反向引物所在位置。图2中的普通牛是指荷斯坦牛，牦牛是指青海牦牛。虽然不同牦牛品种或个体之间D-loop区都会有个别碱基的差异，但是对本发明的PCR扩增来说没有影响，用上述序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，均得不到DNA条带；虽然不同普通牛品种或个体之间D-loop区都会有个别碱基的差异，但是对本发明的PCR扩增来说没有影响，用上述序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，均得到445bp的DNA条带。
根据牦牛和普通牛线粒体DNA D-loop区之间的差异，设计了普通牛特异引物Milk-id-F5’-GCCCATACACAGACCAC-3’(序列1)Milk-id-R5’-GTGAGCATGGGCTGATT-3’(序列2)。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法实验乳品市场购得的荷斯坦牛普通牛奶及奶粉，市场购得的青海牦牛牛奶及奶粉。
牦牛奶和普通牛奶分别按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的体积比混合，鉴定牦牛奶中的普通牛奶成分。
牦牛奶粉和普通牛奶粉分别按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的质量比混合，鉴定牦牛奶粉中的普通牛奶粉成分。
1、牛奶中DNA的提取(1)取牛奶500μl，放入截留分子量为8000-12000Da(道尔顿)的透析袋中。
(2)将透析袋放入准备好的500ml双蒸水中，透析1小时。
(3)将透析袋中的奶样移入1ml的EP管中。
(4)加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的终浓度为10mmol/L、EDTA的终浓度为5mmol/L、NaCl的终浓度为50mmol/L、蛋白酶K的终浓度为200ug/ml，50℃反应3小时。
(5)加入等体积的Tris-饱和酚，抽提10min，11000g离心10min。
(6)取上清重复步骤(5)。
(7)取上清加入等体积的1∶1(体积比)的苯酚氯仿抽提10min，11000g离心10min。
(8)取上清加入两倍体积的无水乙醇，11000g离心10min。
(9)弃上清，70％(体积百分含量)的乙醇漂洗两次。37℃烘干后，溶入5ul的双蒸水中。
相同的方法提取10份相同样本，将提取的DNA融入一个体系中。
2、奶粉中DNA的提取(1)取奶粉100μg，溶入600μl双蒸水中，移入截留分子量为8000-12000Da(道尔顿)的透析袋中。
(2)将透析袋放入准备好的500ml双蒸水中，透析2小时。
(3)更换500ml双蒸水，继续透析3小时。
(4)将透析袋中的奶样移入1ml的EP管中，每管500ul奶样。
(5)加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的终浓度为10mmol/L、EDTA的终浓度为5mmol/L、NaCl的终浓度为50mmol/L、蛋白酶K的终浓度为200ug/ml，50℃反应3小时。
(6)加入等体积的Tris-饱和酚，抽提10min，11000g离心10min。
(7)取上清重复步骤(6)。
(8)取上清加入等体积的1∶1(体积比)的苯酚氯仿抽提10min，11000g离心10min。
(9)取上清加入两倍体积的无水乙醇，11000g离心10min。
(10)弃上清，70％(体积百分含量)的乙醇漂洗两次。37℃烘干后，溶入5ul的双蒸水中。
相同的方法提取10份相同样本，将提取的DNA融入一个体系中。
3、PCR反应及检测分别以步骤1和步骤2提取的DNA为模板，利用Milk-id-F5’-GCCCATACACAGACCAC-3’(序列1)和Milk-id-R5’-GTGAGCATGGGCTGATT-3’(序列2)进行PCR反应。其中，PCR反应体系如下10倍的扩增缓冲液 2.5ul4种dNTP混合物，(各42.5mmol/L)2ulMilk-id-F和Milk-id-R(各10pmol/ul)1ul模板DNA 5ulTaq DNA聚合酶(3u/ul) 1ulddH2O 13.5ul总体积 25ul反应条件94℃预变性5分钟；循环条件(94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒)，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存。反应产物用2％的琼脂糖凝胶检测，并对扩增产物进行测序。
牦牛奶的检测结果如图3所示，作为对照的牦牛奶中未得到DNA条带，牦牛奶和普通牛奶分别按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的体积比混合的样品中均得到445bp的DNA条带。而未混入普通奶的样品没有扩增条带产生，该结果表明引物Milk-id-F和Milk-id-R特异于普通牛，可用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶。图3中，M为100bp分子量标记，CON是PCR模板为牦牛奶的对照，1-5分别为牦牛奶和普通牛奶分别按20∶1，10∶1，5∶1，3∶1和1∶1的体积比的混合奶样PCR结果。
牦牛奶粉的检测结果如图4所示，作为对照的牦牛奶粉中未得到DNA条带，牦牛奶粉和普通牛奶粉分别按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的质量比混合的样品中均得到445bp的DNA条带。而未混入普通奶粉的样品没有扩增条带，说明引物Milk-id-F和Milk-id-R特异于普通牛，可用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶。图4中，M为pBR322分子量标记，CON是PCR模板为牦牛奶粉的对照，1-5分别为牦牛奶粉和普通牛奶粉分别按20∶1，10∶1，5∶1，3∶1和1∶1的质量比的混合奶样PCR结果。
序列表<160>4<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcccatacac agaccac 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtgagcatgg gctgatt 17<210>3<211>910<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>3aacactatta atatagttcc ataaatacaa agagccttat cagtattaaa tttatcaaaa 60atcccaataa ctcaacacag aatttgcacc ctaaccaaat attacaaaca ccactagcta120acataacacg cccatacaca gaccacagaa tgaattacct acgcaagggg taatgtacat180aacattaatg taataaagac ataatatgta tatagtacat taaattatat gccccatgca240tataagcaag cacatgacct ctatagcagt acataataca tataattatt gactgtacat300
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1.一种鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法，包括以下步骤1)以从待测牦牛奶制品中提取的DNA为模板，利用核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR反应；2)检测PCR扩增产物中是否有DNA条带，如PCR扩增产物中有DNA条带，则待测牦牛奶制品中掺杂有普通牛奶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA条带的大小为445bp。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述牦牛为Bos grunniens种属所有牦牛品种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述普通牛为Bos taurus种属所有牛品种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述牦牛为青海牦牛，所述普通牛为荷斯坦牛。
6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中还包括对待测牦牛奶制品进行预处理的步骤；所述预处理的方法为将待测牦牛奶制品进行截留分子量为8000-12000Da的透析，然后向透析后的牦牛奶制品中加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的终浓度为10mmol/L、EDTA的终浓度为5mmol/L、NaCl的终浓度为50m mol/L、蛋白酶K的终浓度为200ug/ml，50℃反应2小时。
7.用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的一对引物，其核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2。
8.用于鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的试剂盒，其含有核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2的一对引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法及其专用引物。本发明所提供的鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法，包括以下步骤1)以从待测牦牛奶制品中提取的DNA为模板，利用核苷酸序列分别是序列表中的序列1和序列2的一对引物进行PCR反应；2)检测PCR扩增产物中是否有DNA条带，如PCR扩增产物中有DNA条带，则待测牦牛奶制品中掺杂有普通牛奶。本发明的鉴别牦牛奶制品中是否掺杂普通牛奶的方法快速、准确、灵敏。
文档编号A23C7/00GK1965664SQ200610114329
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月6日 优先权日2006年11月6日
发明者赵兴波, 刘玉方 申请人:中国农业大学