一种连续大量提取质粒的方法
专利名称：一种连续大量提取质粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种连续大量提取质粒的方法。
背景技术：
近年来核酸疫苗和基因治疗取得了突飞猛进的进展(Liljeqvist，S.and Stahl，S，1999.Production of recombinant subunit vaccinesprotein immunogens，livedelivery and nucleic acid vaccines.J.Biotech.73，1-33；Friedman，T，1997.The road toward human gene therapy-a 25-year perspective.Ann.Med.29，575-577)。然而，基于质粒的传输载体转染细胞的效率很低——只有0.1％的质粒能到达细胞核并表达(Crystal，R.G.，1995.The gene as the drug.Nat.Med.1，15-17)。随着核酸疫苗和基因治疗的临床应用，生产和科研中需要越来越多的质粒(Guilherme N.M.Ferreira，Gabriel A.Monteiro，Duarte M.F.Prazeres andJoaquim M.S.Cabral，2000.Downstream processing of plasmid DNA for genetherapy and DNA vaccine applications.Trends in Biotechnology.18，380-388；M.Susana Levy，Ronan D.O’Kennedy，Parviz Ayazi-Shamlou and Peter Dunnill，2000.Biochemical engineering approaches to the challenges of producing pureplasmid DNA.Trends in Biotechnology.18，296-305)。在这种情况下，设计一个处理量足够大的质粒生产方法，成为生物化学工程师面临的新挑战(Durland，R.，Eastman，E.，1998.Manufacturing and quality control of plasmid-based geneexpression systems.Adv.Drug Deliv.Rev.30，33-48；Schleef，M.，1999.Issuesof large-scale plasmidDNAmanufacturing.InMountain，A.，Ney，U.，Schomburg，D.(Eds.)，Biotechnology，2nd ed.Wiley-VCH，New York)。
总的说来，质粒生产包括三个步骤质粒构建、细菌繁殖、质粒的提取和纯化(Guilherme N.M.Ferreira，Gabriel A.Monteiro，Duarte M.F.Prazeres andJoaquim M.S.Cabral，2000.Downstream processing of plasmid DNA for genetherapy and DNA vaccine applications.Trends in Biotechnology.18，380-388；Kristala Jones Prather，Sangeetha Sagar，Jason Murphy，Michel Chartrain，Industrial scale production of plasmid DNA for vaccine and gene therapyplasmid design，production，and purification.Enzyme and Microbial Technology，33，865-883)。在质粒的提取和纯化步骤中，最重要的部分是细菌细胞的裂解(Prazeres，D.M.F.，1999.Large-scale production of pharmaceuticalgradeplasmid DNA for gene therapyproblems and bottlenecks.Trends Biotechnol.17，169-174)。在这方面有很多方法。其中一种最常用的方法是碱裂解法(Lahijani，R.，Hulley，G.，Soriano，G.，Horn，N.A.，Marquet，M.，1996.High-yieldproduction of pBR322-derived plasmids intended for human gene therapy byemploying a temperature-controllable point mutation.Hum.Gene Ther.7，1971-1980)，在碱裂解法提取质粒的过程中，为了将目的质粒DNA与细菌的基因组DNA和菌体蛋白分离，不可避免地要用到离心(Kelly，B.，Hatton，T.，1991.Thefermentation/downstream processing interface.Bioseparation 1，333-349；Prazeres，D.，1998.Preparative purification of supercoiled plasmidDNAusinganion-exchange chromatography.J.Chromatogr.806，31-45)，这使得提高质粒生产处理的难度变得很高(Theodossiou，I.，1997.The processing of plasmidbased gene from Escherichia coliprimary recovery by filtration.BioprocessEng.16，175-183)。另一种比较流行的细菌裂解方法是煮沸法(Sambrook，J.，Fritsch，E.，Maniatis，T.，1989.Molecular CloningA Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。由于对温度控制要求较高，使得煮沸法在实验室的质粒制备中稳定性较低(Wang，B.，Merva，M.，Williams，W.，Weiner，D.，1995.Large-scale preparation of plasmid DNA by microwave lysis.Biotechniques 18，554-555)，更不用说工业生产了。2005年，朱开春等人发明并优化了一种连续性热裂解的方法(Kaichun Zhu，Huali Jin，Yijie Ma，Zhihui Ren，Chong Xiao，Zhonghuai He，Fuchun Zhang，Qinghong Zhu and Bin Wang，2005.Acontinuous thermal lysis procedure for the large-scale preparation of plasmidDNA.Journal of Biotechnology.118，257-264)，这种方法对传统煮沸法进行了改进，整个过程做到了连续化，可以处理大量菌体并且节约成本，但这种方法中的后提取过程还是有一定难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种连续大量提取质粒的方法。
本发明所提供的连续大量提取质粒的方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。
所述细菌菌体是将细菌发酵液进行微孔过滤得到的，如将细菌发酵液导入孔径为0.2μm中空纤维柱浓缩。
所述方法中，所述细菌菌体存在于菌体悬浮液中；所述菌体悬浮液是用将细菌菌体用悬浮细菌菌体的溶液悬浮得到的；所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50-500mmol/L葡萄糖，25-250mmol/L Tris-HCl，10-100mmol/L EDTA，pH6.5-8.5的溶液；所述悬浮细菌菌体的溶液优选为含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0的溶液；所述细菌菌体的悬浮液的OD600nm值为10-1000；优选为100。
所述方法中，所述过滤为一级过滤或一级以上过滤；所述一级过滤或一级以上过滤的最后一级的过滤目数为100-1000目，优选为400目。
所述过滤优选为四级过滤，所述四级过滤的第一级过滤目数为20-80目，第二级过滤目数为80-200目，第三级过滤目数为120-400目，第四级过滤目数为100-1000目；所述四级过滤的第一级过滤目数优选为40目，第二级过滤目数优选为80目，第三级过滤目数优选为120目，第四级过滤目数优选为400目。
所述方法中，所述裂解细菌菌体的试剂和菌体悬浮液是通过相同内径的管道以相等的流速泵入混合装置中进行反应，得到菌体裂解液；所述裂解细菌菌体的试剂与所述的菌体悬浮液在管道中的流速均可为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
所述裂解细菌菌体的试剂可为现有的裂解细菌菌体的试剂，如含有0.1M-1M NaOH和质量百分含量为0.50％-10％的SDS的溶液；所述裂解细菌菌体的试剂优选为含有0.2M NaOH和质量百分含量为1％SDS的溶液(溶液II)。
所述裂解细菌菌体的试剂是将0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的；所述0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液在管道中的流速均为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
所述裂解细菌菌体的试剂优选为将0.4M NaOH溶液和质量百分含量为2％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的。
所述方法中，所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别通过内径相同的管道按照0.01-10000cm/s的相等流速泵入混合装置中混合；所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在管道中的流速优选为3cm/s；所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂可为现有的沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，如含有1-10mol/L乙酸钠，1-10mol/L冰醋酸，pH 4-6的溶液；优选为含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH 4.8的溶液(溶液III)。
所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在混合腔中以10-500Hz的频率振荡混合，其中所述振荡频率优选为75Hz。
所述除去蛋白质和基因组DNA沉淀后的滤液中加入2倍体积的乙醇，混匀后进行100-1000目的过滤得到质粒，所述过滤的目数优选为200目。
所述方法中，还包括按照如下方法纯化质粒的步骤将提取的质粒溶于TE中，加入等体积的5M LiCl，12,000rpm离心10分钟，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，静置沉淀20分，12,000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用RNA酶除去RNA，使用QIAGEN-tip Plasmid Kits(Qiagen，Germen)按进一步纯化。
所述方法是利用下述装置连续大量提取质粒所述装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱2，至少一个用于悬浮菌体的容器5，至少一个用于盛放0.2-2M NaOH溶液的容器6，至少一个用于盛放质量百分含量为1％-20％的SDS的容器7，至少一个用于盛放上述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器8，至少一个用于菌体裂解的混合腔17，至少一个用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA的混合腔18，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA沉淀的过滤系统19，至少一个用于沉淀质粒的容器20，蠕动泵9，蠕动泵10，蠕动泵11和蠕动泵12；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接；所述方法是将发酵液泵入中空纤维柱2浓缩后得到发酵液浓缩液，将发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有所述悬浮细菌菌体的溶液的容器5中，搅拌重悬得到所述菌体悬浮液；将所述菌体悬浮液、0.2-2M NaOH、1％-20％的SDS分别从容器5、容器6、容器7泵入混合腔17中混合裂解所述细菌菌体，得到菌体裂解液，所述菌体裂解液和所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别从混合腔17和容器8中泵入混合腔18震荡混匀后进入多级过滤系统19中过滤，得到滤液经无水乙醇沉淀后，过滤得到质粒。
本发明的另一个目的是提供一种用于连续大量提取质粒的装置。
本发明所提供连续大量提取质粒的装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱2，至少一个用于悬浮所述细菌菌体的容器5，至少一个用于盛放0.4M NaOH的容器6，至少一个用于盛放1％-20％SDS的容器7，至少一个用于盛放所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器8，至少一个用于菌体裂解的混合腔17，至少一个用于沉淀上述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔18，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统19，至少一个用于沉淀质粒的容器20，蠕动泵9，蠕动泵10，蠕动泵11和蠕动泵12；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接。
其中，容器5、容器6、容器7、容器8、容器20是玻璃容器。
蠕动泵3、9、10、11、12是连续性可调速蠕动泵；上述装置中所用的管道为耐酸碱硅胶管。
混合腔17为普通玻璃管腔，1-100倍于硅胶管的粗细，优选为7倍。
混合腔18为普通玻璃管腔，1-100倍于硅胶管的粗细，优选为7倍。
多级过滤系统19为内置不同孔径尼龙网的容器，该容器由上至下设置的尼龙网的孔径由大到小，其中，容器由不能被弱酸(pH3-7)腐蚀的材料制成。
本发明的连续大量提取质粒方法中所用的质粒提取试剂为悬浮细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液I)、裂解细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液II)和沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂(如现有方法中的溶液III)。其中，悬浮细菌菌体的试剂的葡萄糖可使悬浮后的细菌不会快速沉积到容器底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其作用是抑制DNase的活性，防止DNA被降解。裂解细菌菌体的试剂中的NaOH是用来裂解菌体细胞的，所以才叫碱裂解抽提，裂解细菌菌体的试剂中SDS主要作用是与蛋白质结合。沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂加入后，沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂中的钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾)，产生大量沉淀，自然就将SDS结合的蛋白质沉淀了，同时因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，因此，细菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂中的5M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
本发明的连续大量提取质粒方法与现有的质粒提取方法相比，不仅去除了离心步骤，而且使提取过程无停顿首先，通过微孔过滤收集菌体，抛弃了传统的离心集菌方法，如采用0.2um孔径的中空纤维柱对细菌进行浓缩；其次，连续泵入的细菌在提取装置中经悬浮细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液I)、裂解细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液II)和沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂(如现有方法中的溶液III)逐步混合处理后，进行分级过滤，以去除菌体蛋白和基因组DNA等杂质，而不采用传统的离心方法；最后，通过过滤将无水乙醇中沉淀出的质粒滤出，省去了现有方法中离心处理限速步骤，解决了生产工业化面临的由于离心方法对于仪器的要求和处理量限制的难题。
本发明的方法在提取装置中的混合腔17，提高了细菌裂解效率；管道21使裂解细菌菌体的试剂预先配置好后再与重悬菌液混合；沉淀细菌裂解液中的蛋白质和基因组DNA的试剂与菌体裂解液在混合腔18通过振荡，提高混合效率；管道的菌液流动速度，以及混合腔18的振荡频率的设定，使本发明方法提取的质粒达到最佳的质量和产量。
本发明的方法可以连续、稳定的提取质粒，并且易于操作。与传统的方法相比提高了质粒提取的效率。实验表明，用本发明的方法提取质粒，1L OD600为50的大肠杆菌发酵液可以在45分钟之内获得粗提质粒，粗提质粒产量可以达到80-90mg/L发酵液。该方法还可以通过加粗管道和提高蠕动泵的输液量来提高质粒的产量和生产效率。
本发明的方法提取出的质粒具有和传统碱裂解法提取出的质粒相同的生物学活性。通过提取的pEGFP-N3质粒转染BHK细胞的对比实验表明，本发明的方法提取出的质粒的生物活性略高于传统碱裂解法。
图1为本发明连续性碱裂解法提取质粒的装置示意2为用溶液I悬浮的不同浓度细菌菌体对提取质粒的效果影响的凝胶检测3为NaOH和SDS以及悬浮菌液之间的混合次序对质粒提取效果影响的凝胶检测图4为图1的提取质粒装置中混合腔17对质粒提取效果影响的凝胶检测图5为原料流速对质粒提取效果影响的凝胶检测图6为混合腔18的震动频率对质粒提取效果影响的凝胶检测图7为本发明方法提取的pEGFP-N3和碱裂解法提取的pEGFP-N3的转染效率的比较具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、连续性碱裂解法大规模提取质粒一、细菌发酵将质粒pcDNA3，pVAX(购自Invitrogen，Inc.)和pcDNA3-VP1(JIN，H.，LI，Y.，MA，Z.，ZHANG，F.，XIE，Q.，GU，D.&WANG，B.(2004)Effect of chemicai adjuvantson DNA vaccination.Vaccine，22，2925-2935.)分别转化大肠杆菌菌株DH5α(购自Invitrogen，Inc.)得到分别含有pcDNA3，pVAX和pcDNA3-VP1的大肠杆菌菌株DH5α。将含有pcDNA3的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pcDNA3；将含有pVAX的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pVAX；将含有pcDNA3-VP1的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pcDNA3-VP1。
将DH-pcDNA3、DH-pVAX、DH-pcDNA3-VP1分别进行发酵，具体方法为挑取DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的单菌落，接种于含50g/ml卡那霉素的LB培养基，37℃摇床培养过夜。以40ml培养物作为种子，使用7L的自动控制发酵罐(Bioflo 110，NBS，New Browswick，NJ)，以4L含50g/ml卡那霉素的半合成培养基(5g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/L KH2PO4，4g/L K2HPO4，7g/L Na2HPO4，1.2g/L(NH4)2SO4，0.2g/L NH4Cl，10g/L甘油)进行发酵。温度控制在37℃，通过调整搅拌速度将溶氧值始终保持在30％左右。使用5％的氨水和4M的盐酸将PH值控制在7.0左右。400ml浓缩营养补料(71g/L胰蛋白胨，71g/L酵母提取物，170g/L甘油，5.7g/LMgSO4)以20ml/小时的速度加入。发酵过程中每小时取出4ml培养物测量600nm处的吸光值。分别得到DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的发酵液。
二、连续性碱裂解法提取质粒1、连续性碱裂解法提取质粒方法的优化利用如图1所示的装置提取质粒。该提取质粒装置包括通过蠕动泵3与发酵罐连接的中空纤维柱2，与中空纤维柱2连接的装有悬浮细菌菌体的溶液-溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮的菌液的容器5，装有0.4M NaOH的容器6，装有2％SDS的容器7，装有沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的试剂-溶液III(3M乙酸钠，5M冰醋酸，pH 4.8)的容器8，用于菌体裂解的混合腔17，用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔18，用于过滤除去菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的由40，80，120，400目四种不同尺寸的尼龙网组成的分级过滤系统19，用于沉淀质粒的装有无水乙醇的容器20；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接。
其中，容器5、容器6、容器7、容器8、容器20是玻璃容器或不锈钢的。
蠕动泵3、9、10、11、12是连续性可调速蠕动泵；上述装置中所用的管道为耐酸碱硅胶管。
混合腔17为普通玻璃或不锈钢管腔，其直径为管道的7倍。
混合腔18为普通玻璃或不锈钢管腔，其直径为管道的7倍。
多级过滤系统19为内置不同孔径尼龙网的玻璃柱体，玻璃柱体由上至下设置的尼龙网的孔径依次为40目、80目、120目、400目。
1)细菌菌体悬浮液的浓度的优化用孔径为0.2um的中空纤维柱2(天津膜天膜公司)收集步骤一得到的DH-pcDNA3发酵液，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)以不同比例稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值分别为50，100，150，200，250，300，350)。分别将上述溶液I稀释后的细菌悬浮液从容器与0.4M NaOH、2％SDS分别从容器5、容器6和容器7中以3.0cm/s的流速(管道直径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m3)，并在混合腔17中混合。将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH4.8的溶液，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照，具体方法为将含有与上述提取方法等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值为100，加入2倍体积的含有0.2M NaOH和1％SDS的溶液(溶液II)，轻轻混合，添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于与上述提取方法等量TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。将上述提取的质粒通过凝胶电泳检测，结果如图2所示，结果表明当细菌溶液在600nm的吸光值为100时，得到的质粒超螺旋的量较大并且没有ghost条带，质粒提取质量最好。图2中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取的质粒；泳道1-7分别为用溶液I调节细菌悬浮液的OD600值分别为50，100，150，200，250，300，350然后提取的质粒。
2)溶液混合次序的优化按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，调整上述建立的提取系统的管道(13，14，15)，使溶液以不同的顺序混合，分别为NaOH和SDS先混合，再与细菌混合(管道14与管道15先连接，再与管道13连接)；细菌和NaOH先混合，再与SDS混合(管道13与管道14先连接，再与管道15连接)；细菌和SDS先混合，再与NaOH混合(管道13与管道15先连接，再与管道14连接)。其中，溶液I稀释的细菌悬浮液、0.4M NaOH、2％SDS以3.0cm/s的流速(管道内径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m)，混合后，按照碱裂解法继续进行手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照(方法同步骤1))，提取的质粒用等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解。将上述溶于TE的质粒进行凝胶电泳检测，结果如图3所示，结果表明，当NaOH和SDS先混合，再与细菌混合时，提取的质粒量最大。图3中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取；泳道1为NaOH和SDS先混合配成溶液II，再与细菌混合提取的质粒；泳道2为细菌和NaOH先混合，再与SDS混合提取的质粒；泳道3为细菌和SDS先混合，再与NaOH混合提取的质粒。
3)混合腔17的影响在质粒提取过程中，细菌裂解是要求最为苛刻的一步。如果在裂解的时候菌体所受的剪切力过小，就会导致裂解不充分，降低生产效率；当菌体裂解后，质粒DNA和染色体DNA被释放出来，若剪切力过大，会导致质粒DNA和染色体DNA的断裂，前者影响质粒在应用中的效率，后者会影响质粒纯度。
为了让细菌与溶液II混合充分，使反应更完全，上述提取系统在细菌和溶液II交汇处设置了一个混合腔17。
按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，分别调整上述建立的提取系统，使系统中包括混合腔17(容积为0.0001m3)，或去掉混合腔17，将缺损处直接连接。将上述溶液I稀释后的细菌悬浮液与0.4M NaOH、2％SDS分别从容器5、容器6和容器7中以3.0cm/s的流速(管道直径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m3)或者直接泵入一统一的管道，并在混合腔17中混合或直接在管道中混合。将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照，具体方法为将含有与上述提取方法中等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的菌体浓缩液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值为，100，加入2倍体积的含有0.2M NaOH和1％SDS的溶液(溶液II)，轻轻混合，添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于与上述提取方法中等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。提取的质粒通过凝胶电泳检测。
通过实验，表明当使用混合腔17时，获得的质粒比不用混合腔17更多(图4)。图4中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取；泳道1为没有混合腔17；泳道2为使用混合腔17。
4)细菌、NaOH和SDS的泵入速度的优化按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，调整上述提取系统中蠕动泵的速度，使含溶液I稀释的细菌悬浮液、0.4M NaOH、2％SDS分别通过13、14、15以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0cm/s 6种相等的速度在上述提取系统中流动到混合腔17中，混合，其中管道的直径为3mm，混合腔17的容积为0.0001m3。混合后的液体，按照碱裂解法继续进行质粒提取，具体方法为将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。将提取的质粒溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，结果表明，当速度为3.0cm/s时，提取质粒量最大，质量最好。图5中泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取的质粒，泳道1-6分别为管道流动速度分别为0cm/s，0.5cm/s，1.0cm/s，1.5cm/s，2.0cm/s，2.5cm/s，3.0cm/s时提取的质粒。
5)混合腔18震动频率的优化裂解后的菌体粘度较大，在连续性系统中很难与溶液III混合完全。因此，设计了混合腔18并对其进行振荡，提高混合效率。同时通过对不同振荡频率的实验，选择出生产质粒最多同时杂质最少的参数。
按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，按照上述提取系统，将溶液I稀释后的细菌、0.4M NaOH、2％SDS分别通过13、14、15以3.0cm/s的速度在上述提取系统中流动到混合腔17中，混合，混合后的液体，和溶液III以3.0cm/s的速度通过管道进入混合腔18中混合，并通过不同频率(0，35，45，55，65，75或85Hz)的震动促进混合效率。其中管道的直径为3mm，混合腔17的容积为0.0001m3，混合腔18的容积为0.0001m3。反应完的混合物经系统管道流入分级过滤系统19，分级过滤系统19由40，80，120，400目四种不同网孔尺寸的尼龙网组成，滤出液体缓慢加入到2倍体积的无水乙醇中，使质粒沉淀出来。沉淀物再通过200目的尼龙网滤出，75％乙醇对沉淀物清洗2次后晾干，并溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。以完全用碱裂解法提取(同步骤1)，以及菌液于溶液II混合后的步骤用传统碱裂解提取法代替的方法作为对照，将提取的质粒分别进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图6所示，结果表明，混合腔18在75Hz的震动频率下提取的质粒量最大，质量最好。图6中，泳道M为DNA markerDL15000；泳道C1为手动碱裂解法提取的质粒；泳道C2为连续性碱裂解法裂解细菌，但与溶液III混合时采用手动方法；泳道1-7分别为混合腔18的震动频率为0，35，45，55，65，75或85Hz提取的质粒。
2、优化后的连续性碱裂解法提取质粒及质粒质量检测1)质粒提取利用步骤1中建立的提取系统提取质粒，将步骤一得到的DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的发酵细菌液分别通过蠕动泵泵入孔径为0.2m的中空纤维柱(天津膜天膜公司)收集，将发酵液浓缩。将发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)的容器5中，搅拌重悬，控制溶液I的量，使重悬菌液的OD600nm值为100，待用。
将上述得到的溶液I重悬的菌液、0.4M NaOH、2％SDS和溶液III(3M乙酸钠，5M冰醋酸，pH 4.8)分别使用四个可调速蠕动泵(Hitachi)9、10、11和12提取系统，液体在13、14、15和16中的流度为3.0cm/s。使等体积0.4M NaOH和2％SDS通过14和15后混合形成溶液II，溶液II通过管道进入混合腔17中，重悬菌液与溶液II混合，使细菌裂解。混合腔17中继续通过管道进入到混合腔18中，在此裂解的细菌和溶液III相混合，混合腔18用振荡器(LAB-LINE INSTRUMENTS)以75Hz的频率进行振荡，使其反应完全。反应完的混合物经系统管道流入多级过滤系统19，多级过滤系统由的第一级过滤目数为40目，第二级过滤目数为80目，第三级过滤目数为120目，第四级过滤目数为400目的四种不同网孔尺寸的尼龙网组成，滤出液体缓慢加入到2倍体积的无水乙醇中，使质粒沉淀出来。沉淀物再通过过滤目数为200目的尼龙网滤出，75％乙醇对沉淀物清洗2次后晾干，并溶于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。提取系统中，管道的直径为0.003m，混合腔17的容积为0.0001m3，混合腔18的容积为0.0001m3。
2)连续性碱裂解法提取质粒后的纯化将步骤1)提取的溶于TE中的质粒，加入等体积的5M LiCl，12,000rpm离心10分钟，上清转移至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分，12,000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀溶于含50g/ml RNA酶的TE中，加入RNA酶，37℃消化2小时。然后进行电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测质粒的步骤为在含0.05μg/mlEB的浓度为0.7％的琼脂糖凝胶上加入质粒样品，进行电泳，电泳结果在300nm的紫外光下检测，并使用数码相机(Olympus，Japan)拍照记录结果。然后对质粒使用QIAGEN-tip Plasmid Kits(Qiagen，Germen)按照公司建议方法进行进一步纯化。
3)质粒的检测A、质粒提取效率和纯度检测将步骤2)纯化后的质粒pcDNA3、pVAX或pcDNA3-VP1，测量其溶液在260nm和280nm处的光吸收值，计算比值。将质粒连续稀释，并与标准DNA Marker同时进行凝胶电泳，在含0.05μg/ml EB的浓度为0.7％的琼脂糖凝胶上加入质粒样品，进行电泳，电泳结果在300nm的紫外光下检测，并使用数码相机(Olympus，Japan)拍照记录结果。照片采用Quantity One software(Bio-Rad，CA)分析，得出与标准DNA Marker亮度相同的稀释度条带，以此计算质粒浓度，并根据质粒的浓度计算质粒的产率。结果如表1。
表1.质粒提取效率和纯度
B、质粒转染真核细胞转染效率和转染细胞活性检测将可表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N3(购自Invitrogen，Inc.)转化大肠杆菌菌株DH5α(购自Invitrogen，Inc.)得到含有pEGFP-N3的大肠杆菌菌株DH5α，将其命名为DH-pEGFP-N3。将DH-pEGFP-N3按照步骤1)和步骤2)所述得方法进行发酵提取质粒并纯化，同时按照传统的碱裂解方法提取pEGFP-N3并按照步骤2)所述得方法进行纯化作为对照，将纯化的10ug pEGFP-N3质粒与Lipofectamine 2000Reagent(Invitrogen，USA)混合后，按照公司说明书将质粒转入BHK-21细胞中，在DMEM-10％小牛血清中培养48小时后，利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)对细胞表达的绿色荧光水平进行检测，以未转染质粒的BHK-21细胞为对照。结果如图7所示，结果表明两者表达的绿色荧光水平相近，表明转染效率相近。图7中A为未转染质粒的BHK-21细胞绿色荧光水平检测结果；图7中B为手动提取pEGFP质粒转染的BHK-21细胞绿色荧光水平检测结果；图7中C为连续性碱裂解法提取pEGFP质粒转染的BHK-21细胞；其中，图7中各图的横坐标为相对绿色荧光强度；纵坐标为细胞数，单位为个；图中的百分数表示转染阳性的细胞占总数的比例；M1表示转染阳性细胞所在区域。
权利要求
1.一种连续大量提取质粒的方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细菌菌体是将细菌发酵液进行微孔过滤得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述微孔过滤是在孔径为0.2μm的中空纤维柱进行。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述细菌菌体存在于菌体悬浮液中，所述菌体悬浮液是用将细菌菌体用悬浮细菌菌体的溶液悬浮得到的；所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50-500mmol/L葡萄糖，25-250mmol/L Tris-HCl，10-100mmol/L EDTA，pH6.5-8.5的溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0的溶液；所述菌体悬浮液的OD600nm值为10-1000，优选为100。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述过滤为一级过滤或一级以上过滤；所述一级过滤或一级以上过滤的最后一级的过滤目数为100-1000目，优选为400目。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述过滤优选为四级过滤，所述四级过滤的第一级过滤目数为20-80目，第二级过滤目数为80-200目，第三级过滤目数为120-400目，第四级过滤目数为100-1000目；所述四级过滤的第一级过滤目数优选为40目，第二级过滤目数优选为80目，第三级过滤目数优选为120目，第四级过滤目数优选为400目。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂和所述菌体悬浮液是通过相同内径的管道以相等的流速泵入混合装置中进行反应，得到菌体裂解液；所述裂解细菌菌体的试剂与所述菌体悬浮液在管道中的流速均可为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂为含有0.1M-1M NaOH和质量百分含量为0.50％-10％的SDS的溶液；所述裂解细菌菌体的试剂优选为含有0.2M NaOH和质量百分含量为1％SDS的溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂是将0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的；所述0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液在管道中的流速均为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s；所述裂解细菌菌体的试剂优选为将0.4M NaOH溶液和质量百分含量为2％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别通过内径相同的管道按照0.01-10000cm/s的相等流速泵入混合腔中混合；所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在管道中的流速优选为3cm/s；所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂为含有1-10mol/L乙酸钠，1-10mol/L冰醋酸，pH 4-6的溶液；优选为含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH 4.8的溶液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在混合腔中以10-500Hz的频率振荡混合，其中所述振荡频率优选为75Hz。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述除去蛋白质和基因组DNA沉淀后的滤液中加入2倍体积的乙醇，混匀后进行100-1000目的过滤得到质粒，所述过滤的目数优选为200目。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述方法是利用下述装置连续大量提取质粒所述装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱(2)，至少一个用于悬浮所述细菌菌体的容器(5)，至少一个用于盛放NaOH溶液的容器(6)，至少一个用于盛放SDS溶液的容器(7)，至少一个用于盛放所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器(8)，至少一个用于菌体裂解的混合腔(17)，至少一个用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔(18)，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统(19)，至少一个用于沉淀质粒的容器(20)，蠕动泵(9)，蠕动泵(10)，蠕动泵(11)和蠕动泵(12)；其中，所述中空纤维柱(2)与所述容器(5)连接，所述容器(5)通过所述蠕动泵(9)与所述混合腔(17)的入口端连接，所述混合腔(17)的出口端与所述混合腔(18)的入口端连接，所述混合腔(18)的出口端与过滤系统(19)连接；所述容器(6)与所述蠕动泵(10)的入口端相连，所述容器(7)与所述蠕动泵(11)的入口端相连，所述蠕动泵(10)的出口端和所述蠕动泵(11)的出口端并入管道(21)后与所述混合腔(17)的入口端相连；所述容器(8)通过所述蠕动泵(12)与所述混合腔(18)的入口端连接；所述方法是将菌体发酵液泵入中空纤维柱(2)浓缩后得到菌体发酵液浓缩液，将所述发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有所述悬浮细菌菌体的溶液的容器(5)中，搅拌重悬得到所述菌体悬浮液；将所述菌体悬浮液、0.2-2M NaOH、1％-20％的SDS分别从容器(5)、容器(6)、容器(7)泵入混合腔(17)中混合裂解所述细菌菌体，得到所述菌体裂解液，所述菌体裂解液和所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别从混合腔(17)和容器(8)中泵入混合腔(18)震荡混匀后进入多级过滤系统(19)中过滤，收集滤液，得到质粒。
15.根据权利要求1-14中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括纯化提取的质粒的步骤。
16.一种连续大量提取质粒的装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱(2)，至少一个用于重悬菌体的容器(5)，至少一个用于盛放NaOH溶液的容器(6)，至少一个用于盛放SDS溶液的容器(7)，至少一个用于盛放权利要求11所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器(8)，至少一个用于菌体裂解的混合腔(17)，至少一个用于沉淀所述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔(18)，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统(19)，至少一个用于沉淀质粒的容器(20)，蠕动泵(9)，蠕动泵(10)，蠕动泵(11)和蠕动泵(12)；其中，所述中空纤维柱(2)与所述容器(5)连接，所述容器(5)通过所述蠕动泵(9)与所述混合腔(17)的入口端连接，所述混合腔(17)的出口端与所述混合腔(18)的入口端连接，所述混合腔(18)的出口端与过滤系统(19)连接；所述容器(6)与所述蠕动泵(10)的入口端相连，所述容器(7)与所述蠕动泵(11)的入口端相连，所述蠕动泵(10)的出口端和所述蠕动泵(11)的出口端并入管道(21)后与所述混合腔(17)的入口端相连；所述容器(8)通过所述蠕动泵(12)与所述混合腔(18)的入口端连接。
全文摘要
本发明公开了一种连续大量提取质粒的方法。该方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。本发明的方法提高了质粒提取的产量，解决了生产工业化面临的由于离心方法对于仪器的要求和处理量的限制的难题。
文档编号C12N15/31GK1948481SQ20061011406
公开日2007年4月18日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者王宾, 李小林 申请人:中国农业大学
技术领域：
本发明涉及一种连续大量提取质粒的方法。
背景技术：
近年来核酸疫苗和基因治疗取得了突飞猛进的进展(Liljeqvist，S.and Stahl，S，1999.Production of recombinant subunit vaccinesprotein immunogens，livedelivery and nucleic acid vaccines.J.Biotech.73，1-33；Friedman，T，1997.The road toward human gene therapy-a 25-year perspective.Ann.Med.29，575-577)。然而，基于质粒的传输载体转染细胞的效率很低——只有0.1％的质粒能到达细胞核并表达(Crystal，R.G.，1995.The gene as the drug.Nat.Med.1，15-17)。随着核酸疫苗和基因治疗的临床应用，生产和科研中需要越来越多的质粒(Guilherme N.M.Ferreira，Gabriel A.Monteiro，Duarte M.F.Prazeres andJoaquim M.S.Cabral，2000.Downstream processing of plasmid DNA for genetherapy and DNA vaccine applications.Trends in Biotechnology.18，380-388；M.Susana Levy，Ronan D.O’Kennedy，Parviz Ayazi-Shamlou and Peter Dunnill，2000.Biochemical engineering approaches to the challenges of producing pureplasmid DNA.Trends in Biotechnology.18，296-305)。在这种情况下，设计一个处理量足够大的质粒生产方法，成为生物化学工程师面临的新挑战(Durland，R.，Eastman，E.，1998.Manufacturing and quality control of plasmid-based geneexpression systems.Adv.Drug Deliv.Rev.30，33-48；Schleef，M.，1999.Issuesof large-scale plasmidDNAmanufacturing.InMountain，A.，Ney，U.，Schomburg，D.(Eds.)，Biotechnology，2nd ed.Wiley-VCH，New York)。
总的说来，质粒生产包括三个步骤质粒构建、细菌繁殖、质粒的提取和纯化(Guilherme N.M.Ferreira，Gabriel A.Monteiro，Duarte M.F.Prazeres andJoaquim M.S.Cabral，2000.Downstream processing of plasmid DNA for genetherapy and DNA vaccine applications.Trends in Biotechnology.18，380-388；Kristala Jones Prather，Sangeetha Sagar，Jason Murphy，Michel Chartrain，Industrial scale production of plasmid DNA for vaccine and gene therapyplasmid design，production，and purification.Enzyme and Microbial Technology，33，865-883)。在质粒的提取和纯化步骤中，最重要的部分是细菌细胞的裂解(Prazeres，D.M.F.，1999.Large-scale production of pharmaceuticalgradeplasmid DNA for gene therapyproblems and bottlenecks.Trends Biotechnol.17，169-174)。在这方面有很多方法。其中一种最常用的方法是碱裂解法(Lahijani，R.，Hulley，G.，Soriano，G.，Horn，N.A.，Marquet，M.，1996.High-yieldproduction of pBR322-derived plasmids intended for human gene therapy byemploying a temperature-controllable point mutation.Hum.Gene Ther.7，1971-1980)，在碱裂解法提取质粒的过程中，为了将目的质粒DNA与细菌的基因组DNA和菌体蛋白分离，不可避免地要用到离心(Kelly，B.，Hatton，T.，1991.Thefermentation/downstream processing interface.Bioseparation 1，333-349；Prazeres，D.，1998.Preparative purification of supercoiled plasmidDNAusinganion-exchange chromatography.J.Chromatogr.806，31-45)，这使得提高质粒生产处理的难度变得很高(Theodossiou，I.，1997.The processing of plasmidbased gene from Escherichia coliprimary recovery by filtration.BioprocessEng.16，175-183)。另一种比较流行的细菌裂解方法是煮沸法(Sambrook，J.，Fritsch，E.，Maniatis，T.，1989.Molecular CloningA Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。由于对温度控制要求较高，使得煮沸法在实验室的质粒制备中稳定性较低(Wang，B.，Merva，M.，Williams，W.，Weiner，D.，1995.Large-scale preparation of plasmid DNA by microwave lysis.Biotechniques 18，554-555)，更不用说工业生产了。2005年，朱开春等人发明并优化了一种连续性热裂解的方法(Kaichun Zhu，Huali Jin，Yijie Ma，Zhihui Ren，Chong Xiao，Zhonghuai He，Fuchun Zhang，Qinghong Zhu and Bin Wang，2005.Acontinuous thermal lysis procedure for the large-scale preparation of plasmidDNA.Journal of Biotechnology.118，257-264)，这种方法对传统煮沸法进行了改进，整个过程做到了连续化，可以处理大量菌体并且节约成本，但这种方法中的后提取过程还是有一定难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种连续大量提取质粒的方法。
本发明所提供的连续大量提取质粒的方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。
所述细菌菌体是将细菌发酵液进行微孔过滤得到的，如将细菌发酵液导入孔径为0.2μm中空纤维柱浓缩。
所述方法中，所述细菌菌体存在于菌体悬浮液中；所述菌体悬浮液是用将细菌菌体用悬浮细菌菌体的溶液悬浮得到的；所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50-500mmol/L葡萄糖，25-250mmol/L Tris-HCl，10-100mmol/L EDTA，pH6.5-8.5的溶液；所述悬浮细菌菌体的溶液优选为含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0的溶液；所述细菌菌体的悬浮液的OD600nm值为10-1000；优选为100。
所述方法中，所述过滤为一级过滤或一级以上过滤；所述一级过滤或一级以上过滤的最后一级的过滤目数为100-1000目，优选为400目。
所述过滤优选为四级过滤，所述四级过滤的第一级过滤目数为20-80目，第二级过滤目数为80-200目，第三级过滤目数为120-400目，第四级过滤目数为100-1000目；所述四级过滤的第一级过滤目数优选为40目，第二级过滤目数优选为80目，第三级过滤目数优选为120目，第四级过滤目数优选为400目。
所述方法中，所述裂解细菌菌体的试剂和菌体悬浮液是通过相同内径的管道以相等的流速泵入混合装置中进行反应，得到菌体裂解液；所述裂解细菌菌体的试剂与所述的菌体悬浮液在管道中的流速均可为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
所述裂解细菌菌体的试剂可为现有的裂解细菌菌体的试剂，如含有0.1M-1M NaOH和质量百分含量为0.50％-10％的SDS的溶液；所述裂解细菌菌体的试剂优选为含有0.2M NaOH和质量百分含量为1％SDS的溶液(溶液II)。
所述裂解细菌菌体的试剂是将0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的；所述0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液在管道中的流速均为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
所述裂解细菌菌体的试剂优选为将0.4M NaOH溶液和质量百分含量为2％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的。
所述方法中，所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别通过内径相同的管道按照0.01-10000cm/s的相等流速泵入混合装置中混合；所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在管道中的流速优选为3cm/s；所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂可为现有的沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，如含有1-10mol/L乙酸钠，1-10mol/L冰醋酸，pH 4-6的溶液；优选为含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH 4.8的溶液(溶液III)。
所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在混合腔中以10-500Hz的频率振荡混合，其中所述振荡频率优选为75Hz。
所述除去蛋白质和基因组DNA沉淀后的滤液中加入2倍体积的乙醇，混匀后进行100-1000目的过滤得到质粒，所述过滤的目数优选为200目。
所述方法中，还包括按照如下方法纯化质粒的步骤将提取的质粒溶于TE中，加入等体积的5M LiCl，12,000rpm离心10分钟，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，静置沉淀20分，12,000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用RNA酶除去RNA，使用QIAGEN-tip Plasmid Kits(Qiagen，Germen)按进一步纯化。
所述方法是利用下述装置连续大量提取质粒所述装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱2，至少一个用于悬浮菌体的容器5，至少一个用于盛放0.2-2M NaOH溶液的容器6，至少一个用于盛放质量百分含量为1％-20％的SDS的容器7，至少一个用于盛放上述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器8，至少一个用于菌体裂解的混合腔17，至少一个用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA的混合腔18，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA沉淀的过滤系统19，至少一个用于沉淀质粒的容器20，蠕动泵9，蠕动泵10，蠕动泵11和蠕动泵12；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接；所述方法是将发酵液泵入中空纤维柱2浓缩后得到发酵液浓缩液，将发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有所述悬浮细菌菌体的溶液的容器5中，搅拌重悬得到所述菌体悬浮液；将所述菌体悬浮液、0.2-2M NaOH、1％-20％的SDS分别从容器5、容器6、容器7泵入混合腔17中混合裂解所述细菌菌体，得到菌体裂解液，所述菌体裂解液和所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别从混合腔17和容器8中泵入混合腔18震荡混匀后进入多级过滤系统19中过滤，得到滤液经无水乙醇沉淀后，过滤得到质粒。
本发明的另一个目的是提供一种用于连续大量提取质粒的装置。
本发明所提供连续大量提取质粒的装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱2，至少一个用于悬浮所述细菌菌体的容器5，至少一个用于盛放0.4M NaOH的容器6，至少一个用于盛放1％-20％SDS的容器7，至少一个用于盛放所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器8，至少一个用于菌体裂解的混合腔17，至少一个用于沉淀上述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔18，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统19，至少一个用于沉淀质粒的容器20，蠕动泵9，蠕动泵10，蠕动泵11和蠕动泵12；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接。
其中，容器5、容器6、容器7、容器8、容器20是玻璃容器。
蠕动泵3、9、10、11、12是连续性可调速蠕动泵；上述装置中所用的管道为耐酸碱硅胶管。
混合腔17为普通玻璃管腔，1-100倍于硅胶管的粗细，优选为7倍。
混合腔18为普通玻璃管腔，1-100倍于硅胶管的粗细，优选为7倍。
多级过滤系统19为内置不同孔径尼龙网的容器，该容器由上至下设置的尼龙网的孔径由大到小，其中，容器由不能被弱酸(pH3-7)腐蚀的材料制成。
本发明的连续大量提取质粒方法中所用的质粒提取试剂为悬浮细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液I)、裂解细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液II)和沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂(如现有方法中的溶液III)。其中，悬浮细菌菌体的试剂的葡萄糖可使悬浮后的细菌不会快速沉积到容器底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其作用是抑制DNase的活性，防止DNA被降解。裂解细菌菌体的试剂中的NaOH是用来裂解菌体细胞的，所以才叫碱裂解抽提，裂解细菌菌体的试剂中SDS主要作用是与蛋白质结合。沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂加入后，沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂中的钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾)，产生大量沉淀，自然就将SDS结合的蛋白质沉淀了，同时因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，因此，细菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂中的5M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
本发明的连续大量提取质粒方法与现有的质粒提取方法相比，不仅去除了离心步骤，而且使提取过程无停顿首先，通过微孔过滤收集菌体，抛弃了传统的离心集菌方法，如采用0.2um孔径的中空纤维柱对细菌进行浓缩；其次，连续泵入的细菌在提取装置中经悬浮细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液I)、裂解细菌菌体的试剂(如现有方法中的溶液II)和沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂(如现有方法中的溶液III)逐步混合处理后，进行分级过滤，以去除菌体蛋白和基因组DNA等杂质，而不采用传统的离心方法；最后，通过过滤将无水乙醇中沉淀出的质粒滤出，省去了现有方法中离心处理限速步骤，解决了生产工业化面临的由于离心方法对于仪器的要求和处理量限制的难题。
本发明的方法在提取装置中的混合腔17，提高了细菌裂解效率；管道21使裂解细菌菌体的试剂预先配置好后再与重悬菌液混合；沉淀细菌裂解液中的蛋白质和基因组DNA的试剂与菌体裂解液在混合腔18通过振荡，提高混合效率；管道的菌液流动速度，以及混合腔18的振荡频率的设定，使本发明方法提取的质粒达到最佳的质量和产量。
本发明的方法可以连续、稳定的提取质粒，并且易于操作。与传统的方法相比提高了质粒提取的效率。实验表明，用本发明的方法提取质粒，1L OD600为50的大肠杆菌发酵液可以在45分钟之内获得粗提质粒，粗提质粒产量可以达到80-90mg/L发酵液。该方法还可以通过加粗管道和提高蠕动泵的输液量来提高质粒的产量和生产效率。
本发明的方法提取出的质粒具有和传统碱裂解法提取出的质粒相同的生物学活性。通过提取的pEGFP-N3质粒转染BHK细胞的对比实验表明，本发明的方法提取出的质粒的生物活性略高于传统碱裂解法。
图1为本发明连续性碱裂解法提取质粒的装置示意2为用溶液I悬浮的不同浓度细菌菌体对提取质粒的效果影响的凝胶检测3为NaOH和SDS以及悬浮菌液之间的混合次序对质粒提取效果影响的凝胶检测图4为图1的提取质粒装置中混合腔17对质粒提取效果影响的凝胶检测图5为原料流速对质粒提取效果影响的凝胶检测图6为混合腔18的震动频率对质粒提取效果影响的凝胶检测图7为本发明方法提取的pEGFP-N3和碱裂解法提取的pEGFP-N3的转染效率的比较具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、连续性碱裂解法大规模提取质粒一、细菌发酵将质粒pcDNA3，pVAX(购自Invitrogen，Inc.)和pcDNA3-VP1(JIN，H.，LI，Y.，MA，Z.，ZHANG，F.，XIE，Q.，GU，D.&WANG，B.(2004)Effect of chemicai adjuvantson DNA vaccination.Vaccine，22，2925-2935.)分别转化大肠杆菌菌株DH5α(购自Invitrogen，Inc.)得到分别含有pcDNA3，pVAX和pcDNA3-VP1的大肠杆菌菌株DH5α。将含有pcDNA3的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pcDNA3；将含有pVAX的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pVAX；将含有pcDNA3-VP1的大肠杆菌菌株DH5α命名为DH-pcDNA3-VP1。
将DH-pcDNA3、DH-pVAX、DH-pcDNA3-VP1分别进行发酵，具体方法为挑取DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的单菌落，接种于含50g/ml卡那霉素的LB培养基，37℃摇床培养过夜。以40ml培养物作为种子，使用7L的自动控制发酵罐(Bioflo 110，NBS，New Browswick，NJ)，以4L含50g/ml卡那霉素的半合成培养基(5g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/L KH2PO4，4g/L K2HPO4，7g/L Na2HPO4，1.2g/L(NH4)2SO4，0.2g/L NH4Cl，10g/L甘油)进行发酵。温度控制在37℃，通过调整搅拌速度将溶氧值始终保持在30％左右。使用5％的氨水和4M的盐酸将PH值控制在7.0左右。400ml浓缩营养补料(71g/L胰蛋白胨，71g/L酵母提取物，170g/L甘油，5.7g/LMgSO4)以20ml/小时的速度加入。发酵过程中每小时取出4ml培养物测量600nm处的吸光值。分别得到DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的发酵液。
二、连续性碱裂解法提取质粒1、连续性碱裂解法提取质粒方法的优化利用如图1所示的装置提取质粒。该提取质粒装置包括通过蠕动泵3与发酵罐连接的中空纤维柱2，与中空纤维柱2连接的装有悬浮细菌菌体的溶液-溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮的菌液的容器5，装有0.4M NaOH的容器6，装有2％SDS的容器7，装有沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的试剂-溶液III(3M乙酸钠，5M冰醋酸，pH 4.8)的容器8，用于菌体裂解的混合腔17，用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔18，用于过滤除去菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的由40，80，120，400目四种不同尺寸的尼龙网组成的分级过滤系统19，用于沉淀质粒的装有无水乙醇的容器20；其中，所述中空纤维柱2与所述容器5连接，所述容器5通过所述蠕动泵9与所述混合腔17的入口端连接，所述混合腔17的出口端与所述混合腔18的入口端连接，所述混合腔18的出口端与过滤系统19连接；所述容器6与所述蠕动泵10的入口端相连，所述容器7与所述蠕动泵11的入口端相连，所述蠕动泵10的出口端和所述蠕动泵11的出口端并入管道21后与所述混合腔17的入口端相连；所述容器8通过所述蠕动泵12与所述混合腔18的入口端连接。
其中，容器5、容器6、容器7、容器8、容器20是玻璃容器或不锈钢的。
蠕动泵3、9、10、11、12是连续性可调速蠕动泵；上述装置中所用的管道为耐酸碱硅胶管。
混合腔17为普通玻璃或不锈钢管腔，其直径为管道的7倍。
混合腔18为普通玻璃或不锈钢管腔，其直径为管道的7倍。
多级过滤系统19为内置不同孔径尼龙网的玻璃柱体，玻璃柱体由上至下设置的尼龙网的孔径依次为40目、80目、120目、400目。
1)细菌菌体悬浮液的浓度的优化用孔径为0.2um的中空纤维柱2(天津膜天膜公司)收集步骤一得到的DH-pcDNA3发酵液，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)以不同比例稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值分别为50，100，150，200，250，300，350)。分别将上述溶液I稀释后的细菌悬浮液从容器与0.4M NaOH、2％SDS分别从容器5、容器6和容器7中以3.0cm/s的流速(管道直径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m3)，并在混合腔17中混合。将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH4.8的溶液，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照，具体方法为将含有与上述提取方法等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值为100，加入2倍体积的含有0.2M NaOH和1％SDS的溶液(溶液II)，轻轻混合，添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于与上述提取方法等量TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。将上述提取的质粒通过凝胶电泳检测，结果如图2所示，结果表明当细菌溶液在600nm的吸光值为100时，得到的质粒超螺旋的量较大并且没有ghost条带，质粒提取质量最好。图2中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取的质粒；泳道1-7分别为用溶液I调节细菌悬浮液的OD600值分别为50，100，150，200，250，300，350然后提取的质粒。
2)溶液混合次序的优化按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，调整上述建立的提取系统的管道(13，14，15)，使溶液以不同的顺序混合，分别为NaOH和SDS先混合，再与细菌混合(管道14与管道15先连接，再与管道13连接)；细菌和NaOH先混合，再与SDS混合(管道13与管道14先连接，再与管道15连接)；细菌和SDS先混合，再与NaOH混合(管道13与管道15先连接，再与管道14连接)。其中，溶液I稀释的细菌悬浮液、0.4M NaOH、2％SDS以3.0cm/s的流速(管道内径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m)，混合后，按照碱裂解法继续进行手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照(方法同步骤1))，提取的质粒用等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解。将上述溶于TE的质粒进行凝胶电泳检测，结果如图3所示，结果表明，当NaOH和SDS先混合，再与细菌混合时，提取的质粒量最大。图3中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取；泳道1为NaOH和SDS先混合配成溶液II，再与细菌混合提取的质粒；泳道2为细菌和NaOH先混合，再与SDS混合提取的质粒；泳道3为细菌和SDS先混合，再与NaOH混合提取的质粒。
3)混合腔17的影响在质粒提取过程中，细菌裂解是要求最为苛刻的一步。如果在裂解的时候菌体所受的剪切力过小，就会导致裂解不充分，降低生产效率；当菌体裂解后，质粒DNA和染色体DNA被释放出来，若剪切力过大，会导致质粒DNA和染色体DNA的断裂，前者影响质粒在应用中的效率，后者会影响质粒纯度。
为了让细菌与溶液II混合充分，使反应更完全，上述提取系统在细菌和溶液II交汇处设置了一个混合腔17。
按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，分别调整上述建立的提取系统，使系统中包括混合腔17(容积为0.0001m3)，或去掉混合腔17，将缺损处直接连接。将上述溶液I稀释后的细菌悬浮液与0.4M NaOH、2％SDS分别从容器5、容器6和容器7中以3.0cm/s的流速(管道直径为0.003m)泵出，通过管道13、14、15泵入混合腔17(容积为0.0001m3)或者直接泵入一统一的管道，并在混合腔17中混合或直接在管道中混合。将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。以完全手动碱裂解法提取质粒方法为对照，具体方法为将含有与上述提取方法中等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的菌体浓缩液，用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)稀释，使得稀释后的细菌溶液在600nm处的吸光值为，100，加入2倍体积的含有0.2M NaOH和1％SDS的溶液(溶液II)，轻轻混合，添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于与上述提取方法中等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。提取的质粒通过凝胶电泳检测。
通过实验，表明当使用混合腔17时，获得的质粒比不用混合腔17更多(图4)。图4中，泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取；泳道1为没有混合腔17；泳道2为使用混合腔17。
4)细菌、NaOH和SDS的泵入速度的优化按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，调整上述提取系统中蠕动泵的速度，使含溶液I稀释的细菌悬浮液、0.4M NaOH、2％SDS分别通过13、14、15以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0cm/s 6种相等的速度在上述提取系统中流动到混合腔17中，混合，其中管道的直径为3mm，混合腔17的容积为0.0001m3。混合后的液体，按照碱裂解法继续进行质粒提取，具体方法为将混合后的菌液，用碱裂解法继续手动提取质粒添加1.5倍体积的溶液III，12000rpm离心10分钟；弃沉淀，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，12000rpm离心10分钟；弃上清，沉淀溶于等量TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并用RNA酶去除RNA杂质。将提取的质粒溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，结果表明，当速度为3.0cm/s时，提取质粒量最大，质量最好。图5中泳道M为DNA marker DL15000；泳道C为手动碱裂解法提取的质粒，泳道1-6分别为管道流动速度分别为0cm/s，0.5cm/s，1.0cm/s，1.5cm/s，2.0cm/s，2.5cm/s，3.0cm/s时提取的质粒。
5)混合腔18震动频率的优化裂解后的菌体粘度较大，在连续性系统中很难与溶液III混合完全。因此，设计了混合腔18并对其进行振荡，提高混合效率。同时通过对不同振荡频率的实验，选择出生产质粒最多同时杂质最少的参数。
按照步骤1)所述的方法，收集步骤一发酵得到的DH-pcDNA3菌体，将含有等量(600nm处的吸光值为500)细菌菌体的浓缩菌液，分别用溶液I稀释至600nm处的吸光值为100，按照上述提取系统，将溶液I稀释后的细菌、0.4M NaOH、2％SDS分别通过13、14、15以3.0cm/s的速度在上述提取系统中流动到混合腔17中，混合，混合后的液体，和溶液III以3.0cm/s的速度通过管道进入混合腔18中混合，并通过不同频率(0，35，45，55，65，75或85Hz)的震动促进混合效率。其中管道的直径为3mm，混合腔17的容积为0.0001m3，混合腔18的容积为0.0001m3。反应完的混合物经系统管道流入分级过滤系统19，分级过滤系统19由40，80，120，400目四种不同网孔尺寸的尼龙网组成，滤出液体缓慢加入到2倍体积的无水乙醇中，使质粒沉淀出来。沉淀物再通过200目的尼龙网滤出，75％乙醇对沉淀物清洗2次后晾干，并溶于等量的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。以完全用碱裂解法提取(同步骤1)，以及菌液于溶液II混合后的步骤用传统碱裂解提取法代替的方法作为对照，将提取的质粒分别进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图6所示，结果表明，混合腔18在75Hz的震动频率下提取的质粒量最大，质量最好。图6中，泳道M为DNA markerDL15000；泳道C1为手动碱裂解法提取的质粒；泳道C2为连续性碱裂解法裂解细菌，但与溶液III混合时采用手动方法；泳道1-7分别为混合腔18的震动频率为0，35，45，55，65，75或85Hz提取的质粒。
2、优化后的连续性碱裂解法提取质粒及质粒质量检测1)质粒提取利用步骤1中建立的提取系统提取质粒，将步骤一得到的DH-pcDNA3、DH-pVAX或DH-pcDNA3-VP1的发酵细菌液分别通过蠕动泵泵入孔径为0.2m的中空纤维柱(天津膜天膜公司)收集，将发酵液浓缩。将发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)的容器5中，搅拌重悬，控制溶液I的量，使重悬菌液的OD600nm值为100，待用。
将上述得到的溶液I重悬的菌液、0.4M NaOH、2％SDS和溶液III(3M乙酸钠，5M冰醋酸，pH 4.8)分别使用四个可调速蠕动泵(Hitachi)9、10、11和12提取系统，液体在13、14、15和16中的流度为3.0cm/s。使等体积0.4M NaOH和2％SDS通过14和15后混合形成溶液II，溶液II通过管道进入混合腔17中，重悬菌液与溶液II混合，使细菌裂解。混合腔17中继续通过管道进入到混合腔18中，在此裂解的细菌和溶液III相混合，混合腔18用振荡器(LAB-LINE INSTRUMENTS)以75Hz的频率进行振荡，使其反应完全。反应完的混合物经系统管道流入多级过滤系统19，多级过滤系统由的第一级过滤目数为40目，第二级过滤目数为80目，第三级过滤目数为120目，第四级过滤目数为400目的四种不同网孔尺寸的尼龙网组成，滤出液体缓慢加入到2倍体积的无水乙醇中，使质粒沉淀出来。沉淀物再通过过滤目数为200目的尼龙网滤出，75％乙醇对沉淀物清洗2次后晾干，并溶于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。提取系统中，管道的直径为0.003m，混合腔17的容积为0.0001m3，混合腔18的容积为0.0001m3。
2)连续性碱裂解法提取质粒后的纯化将步骤1)提取的溶于TE中的质粒，加入等体积的5M LiCl，12,000rpm离心10分钟，上清转移至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀20分，12,000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀溶于含50g/ml RNA酶的TE中，加入RNA酶，37℃消化2小时。然后进行电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测质粒的步骤为在含0.05μg/mlEB的浓度为0.7％的琼脂糖凝胶上加入质粒样品，进行电泳，电泳结果在300nm的紫外光下检测，并使用数码相机(Olympus，Japan)拍照记录结果。然后对质粒使用QIAGEN-tip Plasmid Kits(Qiagen，Germen)按照公司建议方法进行进一步纯化。
3)质粒的检测A、质粒提取效率和纯度检测将步骤2)纯化后的质粒pcDNA3、pVAX或pcDNA3-VP1，测量其溶液在260nm和280nm处的光吸收值，计算比值。将质粒连续稀释，并与标准DNA Marker同时进行凝胶电泳，在含0.05μg/ml EB的浓度为0.7％的琼脂糖凝胶上加入质粒样品，进行电泳，电泳结果在300nm的紫外光下检测，并使用数码相机(Olympus，Japan)拍照记录结果。照片采用Quantity One software(Bio-Rad，CA)分析，得出与标准DNA Marker亮度相同的稀释度条带，以此计算质粒浓度，并根据质粒的浓度计算质粒的产率。结果如表1。
表1.质粒提取效率和纯度
B、质粒转染真核细胞转染效率和转染细胞活性检测将可表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N3(购自Invitrogen，Inc.)转化大肠杆菌菌株DH5α(购自Invitrogen，Inc.)得到含有pEGFP-N3的大肠杆菌菌株DH5α，将其命名为DH-pEGFP-N3。将DH-pEGFP-N3按照步骤1)和步骤2)所述得方法进行发酵提取质粒并纯化，同时按照传统的碱裂解方法提取pEGFP-N3并按照步骤2)所述得方法进行纯化作为对照，将纯化的10ug pEGFP-N3质粒与Lipofectamine 2000Reagent(Invitrogen，USA)混合后，按照公司说明书将质粒转入BHK-21细胞中，在DMEM-10％小牛血清中培养48小时后，利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)对细胞表达的绿色荧光水平进行检测，以未转染质粒的BHK-21细胞为对照。结果如图7所示，结果表明两者表达的绿色荧光水平相近，表明转染效率相近。图7中A为未转染质粒的BHK-21细胞绿色荧光水平检测结果；图7中B为手动提取pEGFP质粒转染的BHK-21细胞绿色荧光水平检测结果；图7中C为连续性碱裂解法提取pEGFP质粒转染的BHK-21细胞；其中，图7中各图的横坐标为相对绿色荧光强度；纵坐标为细胞数，单位为个；图中的百分数表示转染阳性的细胞占总数的比例；M1表示转染阳性细胞所在区域。
权利要求
1.一种连续大量提取质粒的方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细菌菌体是将细菌发酵液进行微孔过滤得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述微孔过滤是在孔径为0.2μm的中空纤维柱进行。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述细菌菌体存在于菌体悬浮液中，所述菌体悬浮液是用将细菌菌体用悬浮细菌菌体的溶液悬浮得到的；所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50-500mmol/L葡萄糖，25-250mmol/L Tris-HCl，10-100mmol/L EDTA，pH6.5-8.5的溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述悬浮细菌菌体的溶液为含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0的溶液；所述菌体悬浮液的OD600nm值为10-1000，优选为100。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述过滤为一级过滤或一级以上过滤；所述一级过滤或一级以上过滤的最后一级的过滤目数为100-1000目，优选为400目。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述过滤优选为四级过滤，所述四级过滤的第一级过滤目数为20-80目，第二级过滤目数为80-200目，第三级过滤目数为120-400目，第四级过滤目数为100-1000目；所述四级过滤的第一级过滤目数优选为40目，第二级过滤目数优选为80目，第三级过滤目数优选为120目，第四级过滤目数优选为400目。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂和所述菌体悬浮液是通过相同内径的管道以相等的流速泵入混合装置中进行反应，得到菌体裂解液；所述裂解细菌菌体的试剂与所述菌体悬浮液在管道中的流速均可为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂为含有0.1M-1M NaOH和质量百分含量为0.50％-10％的SDS的溶液；所述裂解细菌菌体的试剂优选为含有0.2M NaOH和质量百分含量为1％SDS的溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述裂解细菌菌体的试剂是将0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的；所述0.2-2M NaOH溶液和质量百分含量为1％-20％的SDS溶液在管道中的流速均为0.01-10000cm/s，优选为3cm/s；所述裂解细菌菌体的试剂优选为将0.4M NaOH溶液和质量百分含量为2％的SDS溶液分别按照相同流量泵入提取装置的连接管道后，通过管道的合并使所述NaOH溶液和SDS溶液等体积混合得到的。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别通过内径相同的管道按照0.01-10000cm/s的相等流速泵入混合腔中混合；所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在管道中的流速优选为3cm/s；所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂为含有1-10mol/L乙酸钠，1-10mol/L冰醋酸，pH 4-6的溶液；优选为含有3mol/L乙酸钠，5mol/L冰醋酸，pH 4.8的溶液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述菌体裂解液与所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂在混合腔中以10-500Hz的频率振荡混合，其中所述振荡频率优选为75Hz。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述除去蛋白质和基因组DNA沉淀后的滤液中加入2倍体积的乙醇，混匀后进行100-1000目的过滤得到质粒，所述过滤的目数优选为200目。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述方法是利用下述装置连续大量提取质粒所述装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱(2)，至少一个用于悬浮所述细菌菌体的容器(5)，至少一个用于盛放NaOH溶液的容器(6)，至少一个用于盛放SDS溶液的容器(7)，至少一个用于盛放所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器(8)，至少一个用于菌体裂解的混合腔(17)，至少一个用于沉淀菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔(18)，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统(19)，至少一个用于沉淀质粒的容器(20)，蠕动泵(9)，蠕动泵(10)，蠕动泵(11)和蠕动泵(12)；其中，所述中空纤维柱(2)与所述容器(5)连接，所述容器(5)通过所述蠕动泵(9)与所述混合腔(17)的入口端连接，所述混合腔(17)的出口端与所述混合腔(18)的入口端连接，所述混合腔(18)的出口端与过滤系统(19)连接；所述容器(6)与所述蠕动泵(10)的入口端相连，所述容器(7)与所述蠕动泵(11)的入口端相连，所述蠕动泵(10)的出口端和所述蠕动泵(11)的出口端并入管道(21)后与所述混合腔(17)的入口端相连；所述容器(8)通过所述蠕动泵(12)与所述混合腔(18)的入口端连接；所述方法是将菌体发酵液泵入中空纤维柱(2)浓缩后得到菌体发酵液浓缩液，将所述发酵液浓缩液用蠕动泵泵入装有所述悬浮细菌菌体的溶液的容器(5)中，搅拌重悬得到所述菌体悬浮液；将所述菌体悬浮液、0.2-2M NaOH、1％-20％的SDS分别从容器(5)、容器(6)、容器(7)泵入混合腔(17)中混合裂解所述细菌菌体，得到所述菌体裂解液，所述菌体裂解液和所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂分别从混合腔(17)和容器(8)中泵入混合腔(18)震荡混匀后进入多级过滤系统(19)中过滤，收集滤液，得到质粒。
15.根据权利要求1-14中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括纯化提取的质粒的步骤。
16.一种连续大量提取质粒的装置，包括至少一个用于收集菌体的中空纤维柱(2)，至少一个用于重悬菌体的容器(5)，至少一个用于盛放NaOH溶液的容器(6)，至少一个用于盛放SDS溶液的容器(7)，至少一个用于盛放权利要求11所述沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂的容器(8)，至少一个用于菌体裂解的混合腔(17)，至少一个用于沉淀所述菌体裂解液中的蛋白质和基因组DNA的混合腔(18)，至少一个用于过滤除去所述菌体裂解液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的过滤系统(19)，至少一个用于沉淀质粒的容器(20)，蠕动泵(9)，蠕动泵(10)，蠕动泵(11)和蠕动泵(12)；其中，所述中空纤维柱(2)与所述容器(5)连接，所述容器(5)通过所述蠕动泵(9)与所述混合腔(17)的入口端连接，所述混合腔(17)的出口端与所述混合腔(18)的入口端连接，所述混合腔(18)的出口端与过滤系统(19)连接；所述容器(6)与所述蠕动泵(10)的入口端相连，所述容器(7)与所述蠕动泵(11)的入口端相连，所述蠕动泵(10)的出口端和所述蠕动泵(11)的出口端并入管道(21)后与所述混合腔(17)的入口端相连；所述容器(8)通过所述蠕动泵(12)与所述混合腔(18)的入口端连接。
全文摘要
本发明公开了一种连续大量提取质粒的方法。该方法，是用裂解细菌菌体的试剂裂解细菌菌体，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；再将该混合液进行过滤，除去所述混合液中的蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀，收集滤液，得到质粒。本发明的方法提高了质粒提取的产量，解决了生产工业化面临的由于离心方法对于仪器的要求和处理量的限制的难题。
文档编号C12N15/31GK1948481SQ20061011406
公开日2007年4月18日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者王宾, 李小林 申请人:中国农业大学
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0访客 来自[中国] 2022年01月27日 14:43用真空富集装置和BIOG试剂盒可以提取中大量质粒
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