一种提取农杆菌质粒dna的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，属于生物技术领域。 技术背景
[0002] 农杆菌质粒DNA的提取和检测在植物基因工程研究中是必需的试验，也是在分子 生物学试验中一项常规技术。农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统。农杆菌分为 根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导（T)质粒，Ti质粒上含有可转移 DNA(T-DNA)区、毒性区（Vir区）以及冠癭碱代谢基因编码区。T-DNA两端是两个25bp的 重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因 以及冠癭碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如FiM、FirB、FirC、VirD.、VirE、VirG、 VirH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这 些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因（chvA、chvB等介导的趋化性促使农杆菌向植物 受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由VirA和VirG组成的双组 分调节系统识别，从而诱导其他Vir的表达。VirDl和VirD2共同作用，由T-DNA右边界开 始向左边界切割产生一条T-DNA单链，并与Vir其它表达蛋白结合成复合体转移到农杆菌 外，然后进入细胞到达细胞核内并整合到细胞染色体上。
[0003] 转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为 人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化，是将外源基 因导入目的植物的重要方法之一。将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对 植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改 变。如转基因的抗虫棉花，通过人们的改造，使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗 害虫的毒素，以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。
[0004] 为了更好地将外源基因导入目的植物，需要研制一种提取农杆菌质粒DNA的方 法。因此研制一种农杆菌质粒DNA提取的试剂盒对于外源基因整合到植物基因组中，参与 植物基因调控表达具有重要意义。
【发明内容】
： 本发明提供一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，利用该试剂盒可以方便、快速地提取 到农杆菌的质粒DNA。
[0006] -种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA 吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，具体步骤如下： 农杆菌菌液培养：挑取含有质粒的农杆菌菌株接种到50-100ml YEB液体培养基中， 在恒温摇床上28-30°C，160-200rpm/h，培养40-48h。吸取2-4ml菌液于5ml离心管中， 10000-13000rpm/min 离心 5-10min，弃上清，保留沉淀。
[0007] 农杆菌细胞破碎：往含有农杆菌沉淀的5ml离心管中加入3-4ml Buffer A，漩 祸悬浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中加入3-4ml Buffer A,漩祸悬浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中 加入0. 4-0. 5ml Buffer B，漩涡悬浮菌体，室温下静止10-20min，加入0. 8-lml新配置的 Buffer C，上下颠倒离心管5-10次，室温下静止10_20min，加入0.4-lml Buffer D，轻柔颠 倒离心管数次，使其充分混匀。加入0.2-lml Buffer E，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混 勾，将离心管冰浴5-10min后10000-13000rpm/h离心10_15min，将上清转入新的离心管中。 加入与上清等体积的Buffer F溶液抽提，10000-13000rpm/min离心5-10分钟，将上清转 移至新的离心管中。加入与上清等体积的Buffer G抽提，10000-13000rpm/min离心10-20 分钟，将上清转移至新的离心管中。
[0008] DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后 加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液，加入500-600 y 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 离心 l-2min，弃废液，加入 300-500 y 1 漂洗液，12000-13000rpm/min 离心l-2min，弃废液，加入500-600 y 1漂洗液，12000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液， 12000-13000rpm/min 离心 l_2min，静置吹干。
[0009] DNA 洗脱：往吸附柱中加入 30-60 y 1 洗脱液，12000-13000rpm/min 离心 l-2min， 所得液体为农杆菌质粒DNA。取3-6 yl DNA水溶液，于1-2%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0010] 试剂的配方如下： DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
[0011] YEB液体培养基：5-10g/L牛肉浸膏，5-10g/L胰蛋白胨，l-10g/L酵母提取物， 5-10g/L蔗糖，0. 5-lg/L七水硫酸镁，用氢氧化钠调PH至7. 0-8. 0。
[0012] Buffer A:0. 1-0. 5mol/L 氯化钠，10-20mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（PH = 8-9)， 0? 1-0. 3mol/L 乙二胺四乙酸（PH = 8-9)。
[0013] Buffer B: 50_80mmol/L 葡萄糖，25_50mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（PH = 8-9)， 10_20mmol/L 乙二胺四乙酸（PH = 8-9)，2. 5_4mg/ml 溶菌酶。
[0014] Buffer C:0. 2-0. 5mol/L氢氧化钠，1-3%质量体积比的十二烷基硫酸钠（SDS)，氢 氧化钠溶液与SDS溶液单独配置，使用前现配现用，等体积混合即是Buffer C溶液。
[0015] 811打6『0:3-5111〇1/1醋酸钾，11.5-20%冰醋酸。
[0016] Buffer E:3-5mol/L 乙酸钠（PH = 4. 8-6)，用冰乙酸调 PH 至 4. 8-6〇
[0017] Buffer F:酸：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0018] Buffer G:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0019] 沉淀剂：70-80 %无水乙醇。
[0020] 去蛋白液：3-61盐酸胍，10-30禮三羟甲基氨基甲烷〇^8)，口11 = 6.0-7.0，用前 加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为30-40 %。
[0021] 漂洗液：20-50mM 氯化钠（NaCL)，2-5mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0-8. 0， 80-90%比重无水乙醇。
[0022] 洗脱液：10-20mM三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 8. 0-9. 0。
[0023] 本发明的显著优点： 农杆菌质粒DNA的提取和检测在植物基因工程研究中是必需的试验，常规的农杆菌质 粒提取步骤繁琐，操作麻烦，一般需要4h左右才能完成农杆菌质粒DNA的提取。本发明提 供一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，利用该试剂盒仅需1. 5h即可完成农杆菌质粒DNA的 提取，该试剂盒与常规提取方法相比不仅节省了大量时间，同时也更加方便、快捷，具有一 定的经济效应。
【附图说明】
[0024] 图1为利用本试剂盒提取的农杆菌质粒DNA的电泳检测图。 具体实施例
[0025] 图1中，泳道1、2均为利用本试剂盒提取的农杆菌质粒DNA电泳检测图，泳道3为 TAKARA 公司的 DL4500Marker。
[0026] -种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，具体步骤如下： (1)农杆菌菌液培养：挑取含有质粒的农杆菌菌株EH105接种到50ml YEB液体培养基 中，在恒温摇床上28°C，160rpm/h,培养48h。吸取4ml菌液于5ml离心管中，10000rpm/min 离心5min，弃上清，保留沉淀。
[0027] (2)农杆菌细胞破碎：往含有农杆菌沉淀的5ml离心管中加入3ml Buffer A，漩 祸悬浮菌体后l〇〇〇〇rpm/h离心3min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中加入3ml Buffer A,漩 祸悬浮菌体后l〇〇〇〇rpm/h离心3min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中加入0.4ml Buffer B， 漩涡悬浮菌体，室温下静止l〇min，加入0. 8ml新配置的Buffer C，上下颠倒离心管5次，室 温下静止l〇min，加入0. 4ml Buffer D，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀。加入0. 2ml Buffer E，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀，将离心管冰浴5min后10000rpm/h离心 10min，将上清转入新的离心管中。加入与上清等体积的Buffer F溶液抽提，13000rpm/min 离心10分钟，将上清转移至新的离心管中。加入与上清等体积的Buffer G抽提，1300