专利名称：一种重复使用的质粒提取试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸提取分离技术中使用的质粒提取试剂盒，特别涉及一种重复 使用的可以从裂解液中提取分离质粒的试剂盒及其应用，属于分子生物学和药用质粒提取 技术领域。
背景技术：
质粒提取是分子生物学和药用质粒研究领域中常见的操作。近年来，基因治疗和 DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗方面 显示了突出的优势，其应用研究正日益发展。目前质粒逐渐成为基因治疗的最重要的基因 传递系统，应用于基因治疗的药用质粒的提取技术的发展目前已成为该领域研究的重点之 一。这进一步促进了高纯度质粒提取技术的发展。质粒提取试剂盒因操作方便、提取效率较高成为质粒提取的主要方法。20世 纪90年代以来，商品化的试剂盒提取质粒已非常普遍。试剂盒通常采用碱裂解结合质 粒纯化柱分离纯化的方法提取质粒。试剂盒的主要生产厂家有Qiagen、Promega, Life Technologies、Stratagene 和 Nest Group, Inc.等国外公司，以及 Tiangen 和博大等国内 公司。目前试剂盒中选用的质粒纯化柱材料通常为硅胶，其分离原理是利用质粒与硅胶的 吸附作用纯化质粒，相互作用依赖于DNA的碱基组成和拓扑学结构，但该材料的吸附性能 会受到片断长度的影响。一般硅胶材料会制成球形，制备过程中除了包括球形粒子制备步 骤外，还需要筛分粒径适宜的粒子，同时还会受到柱装填技术的影响。而质粒吸附材料一般 采用碱再生，而常用的硅胶型吸附材料由于在碱性环境下会溶解，而难以重复使用。而且， 目前使用的高纯度质粒纯化柱主要是国外公司出产的Qiagen等进口试剂盒。因此质粒提 取成本非常高。
发明内容
针对目前质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利 用率有限、容量低、通常采用的硅胶材料无法重复使用，而且该产品主要依靠进口，价格昂 贵，本发明的目的是提供一种提取质粒纯度高、可重复使用的大幅度降低质粒纯化操作成 本的试剂盒。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种重复使用的质粒提取试剂盒，包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液 和菌体裂解液，其特征在于所述的质粒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱，该整体床型质粒 纯化柱采用以下方法合成1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与 交联剂、致孔剂和弓I发剂混合，得到反应混合物，其中a.所述交联剂与单体的物质的量的比值为0. 25 0. 35 ；b.所述引发剂与单体的物质的量的比值为0. 005 0. 03 ；
4
C.所述致孔剂用量占反应混合物体积百分含量的40 80% ；2)将上述反应混合物超声混和均勻，加入到塑料纯化柱管中，原位聚合形成整体 床，聚合温度控制在50 70°C之间，反应时间为12 24小时；3)聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4)将胺类修饰剂溶于有机溶剂，形成修饰液，利用修饰液对整体床进行改性，其中 胺类修饰剂占修饰液的体积百分含量为25 75%，修饰温度控制在50 70°C之间，反应 时间为12 24小时；5)修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床，得到整体床型质粒纯化柱；所述整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和 储存液，其中所述的平衡液pH 7. 0 8. 0，平衡液的组分和含量分别为
Tris 10 50mMEDTA 15 20mMNaCl 0.1 0.3M所述清洗液pH 7. 0 8. 0，清洗液的组分和含量分别为Tris 10 50mMEDTA 15 20mMNaCl 0. 4 0· 7M所述洗脱液pH 7. 0 8. 0，洗脱液的组分和含量分别为Tris 10 50mMEDTA 15 20mMNaCl 0. 9 1· 5M所述再生液的组分和含量分别为NaOH 0. 5 1. 5M所述储存液的组分和体积百分含量分别为乙醇溶液 20 50%。上述技术方案中，所述交联剂采用含有三个双键的化合物，优选采用三聚异腈尿
酸三烯丙酯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种；其中饱和烷烃优选采用正庚 烷、正辛烷和正壬烷中的任一种；所述芳烃优选采用甲苯、乙苯和二甲苯中的任一种。所述的引发剂采用偶氮类物质，优选采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种，所述醇类优选采用乙醇或甲醇，所 述环醚类优选采用四氢呋喃或二噁烷。本发明所述胺类修饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。本发明与现有技术中质粒提取试剂盒相比，具有以下优点及突出性效果该种类 型的试剂盒采用由聚合物形成的整体床型质粒纯化柱，该纯化柱具有制备简单，传质性能 好，耐污染能力强，可以多次提取质粒样品，而纯化柱性能无明显改变等优点。该类试剂盒 可重复使用，质粒提取过程方便快捷，成本低和提取样品纯度高，因此有效克服了现有质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、价格 昂贵以及无法重复使用的缺陷。
具体实施例方式一种重复使用的质粒提取试剂盒，包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液 和菌体裂解液，所述的质粒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱；整体床型质粒纯化柱配有的 系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和储存液；菌体裂解液采用现有技术中通常 采用的裂解液，包括重悬液、碱液、中和液和RNAse酶液。该整体床型质粒纯化柱采用以下 方法合成1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与 交联剂、致孔剂和弓I发剂混合，得到反应混合物，其中a.所述交联剂与单体的物质的量的比值为0. 25 0. 35，所述交联剂采用含有三 个双键的化合物的混合物，优选三聚异腈尿酸三烯丙酯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一 种；b.所述引发剂与单体的物质的量的比值为0.005 0.03，所述的引发剂采用偶氮 类物质，优选偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一种；c.所述致孔剂用量占反应混合物体积百分含量的40 80%，所述的致孔剂采用 饱和烷烃和芳烃中的至少一种，所述饱和烃优选正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一种；所述 芳烃优选甲苯、乙苯和二甲苯中的任一种。；2)将上述反应混合物超声混和均勻，加入到塑料纯化柱管中，原位聚合形成整体 床，聚合温度控制在50 70°C之间，反应时间为12 24小时；3)聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床，所述的有机溶剂为醇类和环醚类 中的任一种，所述醇类优选乙醇或甲醇；所述环醚类优选四氢呋喃或二噁烷；4)将胺类修饰剂溶于有机溶剂，形成修饰液，利用修饰液对整体床进行改性，其中 胺类修饰剂占修饰液的体积百分含量为25 75%，修饰温度控制在50 70°C之间，反应 时间为12 24小时，所述胺类修饰剂优选乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。；5)修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床，得到整体床型质粒纯化柱。所述整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和 储存液，其中所述的平衡液pH 7. 0 8. 0，平衡液的组分和含量分别为Tris 10 50mMEDTA 15 20mMNaCl 0.1 0.3M所述清洗液pH 7. 0 Tris 10 50mMEDTA 15 20mMNaCl 0. 4 0· 7M所述洗脱液pH 7. 0 Tris 10 50mM
8. 0，清洗液的组分和含量分别为
8. 0，洗脱液的组分和含量分别为
EDTA 15 20mMNaCl 0. 9 1· 5M所述再生液的组分和含量分别为NaOH 0. 5 1. 5M所述储存液的组分和体积百分含量分别为乙醇溶液 20 50%。下面通过几个具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 整体床型质粒纯化柱合成称取单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、交联剂三聚异腈尿 酸三烯丙酯(1 0. 35mol/mol)；引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0. 005 lmol/mol), 致孔剂正壬烷(致孔剂/反应混合物70vol% )，混合均勻，装入塑料管中，于50°C反应24 小时。利用乙醇冲洗整体床。然后利用二乙胺为修饰剂，溶剂采用乙醇，二乙胺的体积含量 为75%，修饰反应控制在50°C，反应时间为12小时。反应结束后，采用乙醇冲洗，得到整体 床型质粒纯化柱。实施例2 整体床型质粒纯化柱合成称取单体甲基丙烯酸环氧乙酯、交联剂三甲基丙烯酸 丙三醇酯(1 0. 25mol/mol)；引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0. 03 lmol/mol)；致 孔剂乙苯(致孔剂/反应混合物40vol % )，混合均勻，装入塑料管中，于55°C反应20小时。 利用甲醇冲洗整体床。然后利用乙胺为修饰剂，溶剂采用甲醇，乙胺的体积含量为40%，修 饰反应控制在70°C，反应时间为16小时。反应结束后，采用乙醇冲洗，得到整体床型质粒纯 化柱。实施例3 整体床型质粒纯化柱合成称取单体丙烯酸缩水甘油酯、交联剂三聚异腈尿酸三 烯丙酯(1 0. 28mol/mol)；引发剂偶氮二异庚腈(引发剂/单体0. 01 lmol/mol)；致孔 剂二甲苯和正辛烷(致孔剂/反应混合物50vol%，二甲苯/正辛烷1 lvol/vol)，混合 均勻，装入塑料管中，于60°C反应16小时。利用四氢呋喃冲洗整体床。然后利用乙二胺为 修饰剂，溶剂采用四氢呋喃，乙二胺的体积含量为60%，修饰反应控制在60°C，反应时间为 20小时。反应结束后，采用乙醇冲洗，得到整体床型质粒纯化柱。实施例4:整体床型质粒纯化柱合成称取单体丙烯酸环氧乙酯、交联剂三甲基丙烯酸丙三 醇酯(1 0. 32mol/mol)；引发剂偶氮二异庚腈(引发剂/单体0. 02 lmol/mol)；致孔剂 甲苯和正庚烷(致孔剂/反应混合物SOvol%，甲苯/正庚烷3 2vol/vol)；混合均勻，装 入塑料管中，于70°C反应12小时。利用二噁烷冲洗整体床。然后利用二甲胺为修饰剂，溶 剂采用二噁烷，二甲胺的体积含量为25%，修饰反应控制在65°C，反应时间为24小时。反 应结束后，采用乙醇冲洗，得到整体床型质粒纯化柱。实施例5 试剂盒纯化质粒的过程取5mL发酵液，离心，收集菌体；加入200 μ 1重悬液(葡 萄糖50mM、三羟甲基氨基甲烷Tris 25mM、乙二胺四乙酸EDTA IOmM,pH 8.0)，重悬菌体，加 入浓度为2. 0 μ L RNAse酶液(10mg/ml)；加入400 μ 1碱液(氢氧化钠0. 2Μ、十二烷基硫酸钠SDS 1. 0% m/V)，裂解时间为5min ；加入300 μ 1中和液(乙酸钾3Μ、冰乙酸2Μ)，冰水浴 上放置IOmin ；将以上溶液离心，得到裂解液。利用0. 5ml平衡液(Tris 50m M、EDTA15mM、 NaCl 0. 2M pH 8. 0)平衡整体床型质粒纯化柱；将裂解液加入到纯化柱上；利用2ml清洗液 (Tris 50mM、EDTA 15mM、NaCl 0·6Μ，ρΗ 8. 0)冲洗质粒纯化柱；再次利用2ml清洗液冲洗质 粒纯化柱；利用Iml洗脱液(Tris 50mM、EDTA 15mM、NaCl 1·2Μ，ρΗ 8.0)洗脱纯化柱，得到 含有质粒的洗脱液；在含有质粒的洗脱液中加入0. 6倍体积的异丙醇；离心获得质粒沉淀； 利用TE(10mM Tris, ImM EDTA，pH 8. 0)溶解质粒沉淀，得到质粒溶液。利用2ml 1. OM NaOH 再生液再生纯化柱；利用2ml 20%乙醇溶液存储液清洗纯化柱；将纯化柱保藏于含有存储 液的贮存管中备用。所采用的整体床型质粒纯化柱按实施例1制备。纯化柱重复使用5次 以上性能没有明显改变。实施例6 试剂盒纯化质粒的过程利用0. 5ml平衡液(Tris 30mM、EDTA 20mM、NaCl 0. 3M， pH7. 0)平衡整体床型质粒纯化柱；将裂解液加入到纯化柱上；利用2ml清洗液(Tris 30mM、EDTA 20mM、NaCl 0. 7M，pH 7. 0)冲洗质粒纯化柱；再次利用2ml清洗液冲洗质粒纯 化柱；利用Iml洗脱液(Tris 30mM、EDTA 20mM、NaCl 1·5Μ，ρΗ 7.0)洗脱纯化柱，得到含有 质粒的洗脱液；在含有质粒的洗脱液中加入0. 6倍体积的异丙醇；离心获得质粒沉淀；利用 TEdOmM Tris, ImM EDTA, pH 8.0)溶解质粒沉淀，得到质粒溶液。利用2ml 1. 5M NaOH再 生液再生纯化柱；利用2ml 30%乙醇溶液存储液清洗纯化柱；将纯化柱保藏于含有存储液 的贮存管中备用。所采用的整体床型质粒纯化柱按实施例2制备。所采用的裂解液按实施 例5得到。纯化柱重复使用7次以上性能没有明显改变。实施例7 试剂盒纯化质粒的过程利用0. 5ml平衡液(Tris IOmM, EDTA 15mM、NaCl 0. 2M， pH7. 5)平衡整体床型质粒纯化柱；将裂解液加入到纯化柱上；利用2ml清洗液(Tris IOmM, EDTA 15mM、NaCl 0. 6M，pH 7. 5)冲洗质粒纯化柱；再次利用2ml清洗液冲洗质粒纯 化柱；利用Iml洗脱液(Tris IOmM,EDTA 15mM、NaCl 1·2Μ，ρΗ 7.5)洗脱纯化柱，得到含有 质粒的洗脱液；在含有质粒的洗脱液中加入0. 6倍体积的异丙醇；离心获得质粒沉淀；利用 TEdOmM Tris, ImM EDTA, pH 8.0)溶解质粒沉淀，得到质粒溶液。利用2ml 1. OM NaOH再 生液再生纯化柱；利用2ml 40%乙醇溶液存储液清洗纯化柱；将纯化柱保藏于含有存储液 的贮存管中备用。所采用的整体床型质粒纯化柱按实施例3制备。所采用的裂解液按实施 例5得到。纯化柱重复使用6次以上性能没有明显改变。实施例8 试剂盒纯化质粒的过程利用0. 5ml平衡液(Tris 50mM、EDTA 20mM、NaCl 0. 1M， pH7. 5)平衡整体床型质粒纯化柱；将裂解液加入到纯化柱上；利用2ml清洗液(Tris 50mM、EDTA 20mM、NaCl 0. 4M，pH 7. 5)冲洗质粒纯化柱；再次利用2ml清洗液冲洗质粒纯 化柱；利用Iml洗脱液(Tris 50mM、EDTA 20mM、NaCl 0. 9M, pH 7.5)洗脱纯化柱，得到含有 质粒的洗脱液；在含有质粒的洗脱液中加入0. 6倍体积的异丙醇；离心获得质粒沉淀；利用 TEdOmM Tris, ImM EDTA, pH 8.0)溶解质粒沉淀，得到质粒溶液。利用2ml 0. 5M NaOH再 生液再生纯化柱；利用2ml 50%乙醇溶液存储液清洗纯化柱；将纯化柱保藏于含有存储液 的贮存管中备用。所采用的整体床型质粒纯化柱按实施例4制备。所采用的裂解液按实施
8例5得到。纯化柱重复使用8次以上性能没有明显改变。
权利要求
一种重复使用的质粒提取试剂盒，包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液和菌体裂解液，其特征在于所述的质粒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱，该整体床型质粒纯化柱采用以下方法合成1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a.所述交联剂与单体的物质的量的比值为0.25～0.35；b.所述引发剂与单体的物质的量的比值为0.005～0.03；c.所述致孔剂用量占反应混合物体积百分含量的40～80％；2)将上述反应混合物超声混和均匀，加入到塑料纯化柱管中，原位聚合形成整体床，聚合温度控制在50～70℃之间，反应时间为12～24小时；3)聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4)将胺类修饰剂溶于有机溶剂，形成修饰液，利用修饰液对整体床进行改性，其中胺类修饰剂占修饰液的体积百分含量为25～75％，修饰温度控制在50～70℃之间，反应时间为12～24小时；5)修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床，得到整体床型质粒纯化柱；所述整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和储存液，其中所述的平衡液pH 7.0～8.0，平衡液的组分和含量分别为Tris10～50mMEDTA15～20mMNaCl0.1～0.3M所述清洗液pH 7.0～8.0，清洗液的组分和含量分别为Tris10～50mMEDTA15～20mMNaCl0.4～0.7M所述洗脱液pH 7.0～8.0，洗脱液的组分和含量分别为Tris10～50mMEDTA15～20mMNaCl0.9～1.5M所述再生液的组分和含量分别为NaOH0.5～1.5M所述储存液的组分和体积百分含量分别为乙醇溶液 20～50％。
2.按权利要求1所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述交联剂采 用含有三个双键的化合物。
3.按权利要求2所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述含有三个 双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。
4.按权利要求1所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述的致孔剂 采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种。8. 0，清洗液的组分和含量分别为8. 0，洗脱液的组分和含量分别为
5.按权利要求4所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述饱和烷烃 采用正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一种；所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲苯中的任一种。
6.按权利要求1所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述的引发剂 采用偶氮类物质。
7.按权利要求6所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述偶氮类物 质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一种。
8.按权利要求1所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述的有机溶 剂为醇类和环醚类中的任一种。
9.按权利要求8所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述醇类采用 乙醇或甲醇；所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。
10.按权利要求1所述的一种重复使用的质粒提取试剂盒，其特征在于所述胺类修饰 剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。
全文摘要
一种重复使用的质粒提取试剂盒，涉及一种核酸提取分离技术中使用的质粒提取试剂盒。该试剂盒包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液和菌体裂解液。本发明的主要技术特点是采用由聚合物形成的整体床型质粒纯化柱和与该质粒纯化柱配备的系列溶液。整体床型质粒纯化柱制备简单、传质性能好、耐污染能力强、质粒提取过程方便快捷，且多次提取质粒样品而纯化柱性能无明显改变。本发明有效克服了现有质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、价格昂贵以及无法重复使用的缺陷。
文档编号C12N15/10GK101892222SQ20101022258
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者张敏莲, 江骏, 陈然, 靳琳 申请人:清华大学