专利名称：乙型肝炎病毒dna提取试剂及提取方法
乙型肝炎病毒DNA提取试剂及提取方法技术领域[ooo1] 本发明涉及一种I)NA提取试剂方法，特别涉及一种有关乙型肝炎病毒I)NA的提取试剂及方法。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(}]BsAg携带者)超过2．8亿，我国约占9300万。乙型肝炎病毒(HBV)为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出厂[BV—I)NA。厂tBV—I)NA阳性是表示}]BV复制的最可靠指标。近年用多聚酶链反应(PCR)这一体外I)NA扩增技术，使灵敏度提高lOO倍以上(10FGfg／m1)，可测出极微量的病毒。特别荧光定量PCR技术，能对}]BV—I)NA实时定量测定，在乙型肝炎病人的临床治疗监测中具有重要参考价值，是国内用于厂[BV—I)NA定量测定的基本方法。[o003]其中样本处理，即rtBV—I)NA的提取，是影响PCR测定准确性和重复性的一项重要因素。目前，样本处理过程中厂tBV—I)NA提取为常用的酚一氯仿法，操作繁琐，耗时费力且易引起交叉感染，而使PCR扩增失败。现市场上有许多提取}]BV一])NA的试剂盒，虽操作简单1省力，但费用太高，不易推广到一般实验室。强碱溶液(如Na。H溶液)能裂解细胞膜和核膜，使I)NA释放出来，并使核酸酶变性失活，保持I)NA一级结构的稳定性，故碱裂解法已广泛用于细菌中质粒I)NA的分离和植物组织中I)NA的分离。
本发明在传统的碱裂解法的基础上进行改良，目的在于提供一种经济1简便1易行的试剂及方法，从乙型肝炎患者的血清样本中提取高质量的病毒I)NA。发明内容[o005]本发明的目的是，提供一种更为简便1经济1易行的分子生物学中基因组I)NA提取试剂及方法。技术方案如下[o006]一种乙型肝炎病毒I)NA提取试剂盒，包括裂解液l和裂解液2，所述的裂解液l组成如下[o007] lo—100mMTri S—HCl pH7．5—8．5[o008]o．5一o．9％SDS[o009]l o一200mMNa。H[oo]0] 40一300mMNaCl[oo]]] l一5mMEDTApH8．o；[oo12] 所述的裂解液2组成如下[oo13] 卜2mg蛋白酶K[oo]4] 50mMTri S—HCl pH7．6[oo]5] 10mMCaCl。[oo16] 本发明还提供一种乙型肝炎病毒])NA提取方法，包括以下操作
1)将15ul上述的裂解液1加入到装有50ul血清样本的反应管中，振荡混勻；2)在上述反应管中加入5ul上述的裂解液2，振荡混勻，3000rpm离心Imin ；3)将上述反应管置于56°C水浴锅中保温30min，再将反应管置于100°C金属浴中 保温 lOmin，然后 13000rpm 离心 IOmin ；4)取上清液于4°C保存备用。采用本发明提供的提取方法，所得的病毒DNA用于PCR时，所述的血清样本来源为 非EDTA抗凝血。本发明依据血液和病毒的特殊性质，采用了碱裂解技术，无须预先去除蛋白质、多 糖、脂质等杂质，直接通过裂解液1和裂解液2将病毒DNA提取出来。本方法具有高效、快 速、简洁、不易污染的特点，整个操作过程只需要50分钟。得到的乙肝病毒DNA可满足普通 PCR反应和荧光定量PCR反应等分子生物学试验的要求。
附图样本提取检测电泳图，1为提取的HBV的扩增产物，2为检测提取效果的 Marker。
具体实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂 商所建议的步骤和条件。所用的一般试剂为化学分析纯，购自上海国药。实施例1 乙肝病毒DNA提取试剂的制备1.裂解液 l(Lysis Buffer 1)配制用DEPC水，配制以下溶液IO-IOOmM Tris-HCl ρΗ7· 5-8.5
SDS NaOH NaCl
EDTA ρΗ8· O ；2.裂解液 1 (Lysis Buffer 1)配制用DEPC水，配制以下溶液l-2mg 蛋白酶 K50mM Tris-HCl ρΗ7· 6IOmM CaCl2。注意试剂盒中以上两种溶液不可直接混合用于样本DNA的提取。实施例2 乙肝病毒DNA提取试剂的使用1.血清和血浆样本的采集将含HBV病毒样本的全血样品收集到不含任何抗凝剂的采血管中，室温静置30分 钟，台式离心机4000rpm离心5分钟，收集上层血清样品，混勻，室温静置30分钟，收集上层0. 5-0. 9%10-200mM40-300mMl-5mM血浆样品。用本发明的试剂进行HBV的DNA提取时，如果所提取的DNA要进一步PCR处理的 话，其血清样本不可来自EDTA抗凝血。2.样品制备吸取50ul血清样品到已灭菌的EP管中，加入15ul Lysis Buffer 1，混勻。再加 入5ul的Lysis Buffer 2，在振荡器上振荡混勻，3000rpm离心1分钟。将混合液置于56°C 水浴中加热30分钟。取出擦干管壁，置于100°C金属浴中加热10分钟。室温下13000rpm 离心10分钟。取2ul上清作为HBV PCR反应模板。3. HBV PCR 扩增检测1)PCR扩增用引物根据HBV Database，在HBV DNA高度保守区设计引物，由上海 生工生物工程服务有限公司合成。dNTP、Taq酶、PCR Buffer、Marker均购于宝生物工程 (大连)有限公司。引物序列上游5:TCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTAT-3、下游5~-TAGAGGACAAACGGGCAACATACC-3~2)HBV PCR扩增混合物40ul 反应混合物内含4ul PCR Buffer, 200uM dNTP，0. 5uM 上游引物和0. 5uM下游引物，0. 4ul Taq酶，及2ul制备好的模板。3)扩增条件95°C 5分钟
940C 30 秒、
600C 40秒纟35循环
72 0C 30 秒72 0C 5 分钟4)检测结果扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，获得样本提取检测电泳图。见 附图可知提取成功。序列表<110>上海裕隆临床检验中心有限公司<120>乙型肝炎病毒DNA提取试剂及提取方法<160>2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用以扩增乙肝病毒DNA 的上游引物，可检测乙型肝炎病毒DNA提取试剂及提取方法的结果。<400>1tcgctggatg tgtctgcggc gtttat 26<210>2
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用以扩增乙肝病毒DNA 的下游引物，可检测乙型肝炎病毒DNA提取试剂及提取方法的结果。<400>2tagaggacaa acgggcaaca tacc2权利要求
1.一种乙型肝炎病毒DNA提取试剂，包括裂解液1和裂解液2，其特征在于，所述的裂解液1组成如下 IO-IOOmM Tris-HCl 0. 5-0. 9% SDS 10-200mM NaOH 40-300mM NaCl l-5mMEDTA所述的裂解液2组成如下 l-2mg蛋白酶K50mMTris-HClIOmMCaCl2。
2.—种乙型肝炎病毒DNA提取方法，其特征在于，包括以下操作1)将15ul如权利要求1所述的裂解液1加入到装有50ul血清样本的反应管中，振荡 混勻；2)在上述反应管中加入5ul如权利要求1所述的裂解液2，振荡混勻，3000rpm离心 Imin ；3)将上述反应管置于56°C水浴锅中保温30min，再将反应管置于100°C金属浴中保温 lOmin，然后 13000rpm 离心 IOmin ；4)取上清液于4°C保存备用。
3.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒DNA提取方法，其特征在于，所述的血清样本非 EDTA抗凝血。ρΗ7· 5-8. 5ρΗ8· 0 ；ρΗ7· 全文摘要
本发明公开了一种乙型肝炎病毒DNA的提取方法，属于分子生物学核酸提取领域。本方法是依据血液和病毒的特殊性质，采用了碱裂解技术，无须预先去除蛋白质、多糖、脂质等杂质，直接通过Lysis Buffer 1和Lysis Buffer 2将病毒DNA提取出来。具有高效、快速、简洁、不易污染的特点，整个操作过程只需要50分钟。所得的乙肝病毒DNA可用于普通PCR反应和荧光定量PCR反应等分子生物学试验。
文档编号C12N15/10GK102094002SQ20091020039
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东, 黎飒 申请人:上海裕隆临床检验中心有限公司