专利名称：吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物鉴别领域。更具体地，本发明涉及适合海水养殖的新品种一吉鲡 罗非鱼(尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼的属间远缘杂交和选育子代)的遗传特性的甑别方法及 其应用。
背景技术：
目前在我国的咸、海水水域中，养殖生产存在一些亟待解决的问题，比如，海水网 箱养殖缺少适合的养殖对象和适宜我国国情的养殖模式，现有的养殖对象几乎全部是肉食 性鱼类，苗种来源困难，饵料不易解决，不仅养殖成本高昂，养殖风险大，而且由于大量、长 期投喂冰鲜杂鱼也容易产生生态和环境问题；而中西部咸水养殖的主要问题是缺乏优良的 养殖对象，现有的鱼类，大多生长缓慢、经济价值低。罗非鱼类原产非洲，属热带性鱼类。其中尼罗罗非鱼因个体大、肉厚色白、质嫩刺 少、富有弹性、细腻味美，含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁和维生素等营养成分，同时含有多种 不饱和脂肪酸等特点，是老少皆宜的健康食品，符合人类追求健康食品的要求。随着世界鳕 鱼和野生鲑鳟鱼类资源的减少，美国、欧洲、日本、韩国白鱼肉市场正在寻找新的替代品种。罗非鱼因其具有生长速度快、抗病能力强、饲料易解决、养殖周期短、易加工保鲜、 生产成本低、营养价值高，市场前景广等特点，成为联合国粮农组织向世界推荐的最有发展 前景的水产优良养殖对象之一。同时由于肉质洁白而少刺，而被称为“白色三文鱼”，可替代 短缺的鳕鱼等海洋优质鱼，成为人类的“21世纪的鱼”。目前罗非鱼总产量为200万吨。其 中养殖产量约占3/4，而尼罗罗非鱼占90%以上。海水中养殖的罗非鱼，不仅没有淡水养殖 罗非鱼常有的土腥味，而且肉质紧密富弹性，商品品质高，但因缺少良种，产量很少。萨罗罗非鱼(Sarotherodonmelanotheron Ruppell,1852),又叫黑颊罗 非鱼(Blackchin tilapia),鲈形目(Perciformes)，丽鱼科(Cichlidae)，萨罗属 (Sarotherodon)，它自然分布于西非从象牙海岸到塞内加尔河海湾和内陆泻湖的广大咸淡 水水域中。在罗非鱼类中，萨罗罗非鱼是耐盐性最强的种类。据报道，在盐度为35时可正 常繁殖，目前萨罗罗非鱼已被引种到美国、日本和前苏联等国家，在除南极洲以外的五大洲 都有分布。但这种罗非鱼生长速度慢，养殖价值不大。上海海洋大学以耐盐性强的萨罗罗非鱼和生产长快的尼罗罗非鱼(“新吉富”品 系)为主要遗传材料，通过杂交和选育，产生了耐盐性和生长速度兼优的罗非鱼新品种-吉 鲡罗非鱼(简称为“吉鲡”鱼)。杂交鱼吉鲡罗非鱼具有保留了亲本的优势、兼具优良生长性能和耐盐性能、能在 海水中正常养殖。从性状特征来看，本发明的方法获得的杂交鱼形似“萨罗”鱼，但有部分 可数性状与“新吉富”鱼相似。并且，所述的吉鲡罗非鱼的后代性状稳定，具有良好的耐盐 性，可正常繁育，且生长速度较快，肉质鲜美。同时，吉鲡罗非鱼在盐度为20度的条件下的 生长速度是父本“萨罗”鱼的4倍多，耐盐性能较其母本尼罗罗非鱼(在20盐度下不能存 活)有了极大的提高，且肉质似海鱼，无泥腥味。因此，吉鲡罗非鱼是一种应用前景极为广阔的鱼类。然而，虽然吉鲡罗非鱼的外形介于父母本之间，有经验的专业人员可以辨认，但一 般科技人员和消费者则难以辨别。为了便于学术界的研究、养殖界的保种制种，罗非鱼产业 的追溯，以及商业界的新品种推介，本领域迫切需要开发可靠的、准确地鉴别吉鲡罗非鱼的 鉴别技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可靠的、准确地鉴别吉鲡罗非鱼的鉴别技术。在本发明的第一方面，提供了一种确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的 方法，包括步骤对待检测的鱼类进行同工酶检测，并将检测结果与阳性对照或标准品进行比较， 从而确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶。在另一优选例中，所述的检测同工酶包括对鱼组织进行勻浆，然后离心获得上 清，再通过电泳法检测同工酶。在另一优选例中，所述的待检测的鱼类包括吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼 或其组合。在另一优选例中，所述的鱼组织包括选自下组的组织肌肉组织、肝组织、肾脏组 织、心组织、眼、或其组合。在另一优选例中，所述的鱼类组织是肾脏组织或肝脏组织。在另一优选例中，所述的阳性对照是吉鲡罗非鱼的乳酸脱氢酶的同工酶图谱，或 者标准品包括以下鱼类的乳酸脱氢酶的同工酶图谱吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非
佳.ο在另一优选例中，所述的图谱是电泳图谱和/或扫描图。在另一优选例中，所述的吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼的乳酸脱氢酶的 同工酶图谱如图3所示。在另一优选例中，如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待 检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检 测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测 鱼类是萨罗罗非鱼。在另一优选例中，所述的同工酶检测按中华人民共和国国家标准(GB/ T18654. 13-2008)进行。在另一优选例中，所述方法还包括对待检测的鱼类进行染色体组型检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类 是否是吉鲡罗非鱼；和/或对待检测的鱼类进行微卫星标记检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类 是否是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，如果检测结果显示染色体组型公式为2n = 6sm+24st+14 ；则 提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n = 2m+4sm+24st+14t ；则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n = lm+km+Mst+14t，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，直接判断染色体组型种是否出现了一对m+sm的染色体，如存在 m+sm的染色体，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，用选自下组的一对或多对引物对，通过PCR扩增微卫星标记 SEQ ID NO 1 和 2、3 和 4、5 和 6、7 和 8、9 和 10,11 和 12,13 和 14,15 和 16,17 和 18,19 和 20,21 和 22。在另一优选例中，根据扩增获得的微卫星标记，计算以下一种或多种指标①有效 等位基因数；②平均遗传杂合度；和③多态信息含量(PIC)，并根据指标的高低来确定或判 断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中高指标则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非 鱼；高指标则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；低指标则提示或初步判断待检测 鱼类是萨罗罗非鱼。具体地，①有效等位基因数吉鲡罗非鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼；②平均 遗传杂合度吉鲡罗非鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼；③多态信息含量(PIC)吉鲡罗非 鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼。在本发明的第二方面，提供了一种用于甑别吉鲡罗非鱼(即确定或判断待检测的 鱼类是否是吉鲡罗非鱼)的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括(a) 一容器，所述的容器内包括进行鱼类同工酶检测所需的试剂，其中所述的同工 酶是乳酸脱氢酶；(b)说明书，所述的说明书说明了基于乳酸脱氢酶的同工酶检测结果判定鱼类是 否是吉鲡罗非鱼的标准。更佳地，所述的试剂盒还包括任选的用于染色体组型检测的试剂和/或用于微 卫星标记检测的试剂。在另一优选例中，所述的说明书中记载如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢酶， 则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶，则 提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则提 示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括用于染色体组型检测的试剂和/或用于 微卫星标记检测的试剂。在另一优选例中，所述的用于微卫星标记检测的试剂是下组的一对或多对引物对 进行PCR扩增微卫星标记SEQ ID NO :1禾口 2、3禾口 4、5禾口 6、7禾口 8、9禾口 10、11和12、13和 14,15 和 16,17 和 18,19 和 20,21 和 22。在本发明的第三方面，提供了鱼类的乳酸脱氢酶同工酶的用途，它们用作鉴定吉 鲡罗非鱼的遗传标记，或用于制备甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒。在本发明的第四方面，提供了通过染色体组型来确定或判断待检测的鱼类是否是 吉鲡罗非鱼的方法，包括步骤对待检测的鱼类进行染色体组型检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类 是否是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，如果检测结果显示染色体组型公式为2n = 6sm+24st+14 ；则 提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n =2m+4sm+24st+14t ；则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼；如果检测结果显示染色 体组型公式为2n = lm+km+Mst+14t，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，直接判断染色体组型种是否出现了一对m+sm的染色体，如存在 m+sm的染色体，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。在本发明的第五方面，提供了通过微卫星标记来确定或判断待检测的鱼类是否是 吉鲡罗非鱼的方法，包括步骤对待检测的鱼类进行微卫星标记检测，并根据检测结果确定 或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼。在另一优选例中，用选自下组的一对或多对引物对，通过PCR扩增微卫星标记 SEQ ID NO 1 和 2、3 和 4、5 和 6、7 和 8、9 和 10,11 和 12,13 和 14,15 和 16,17 和 18,19 和 20,21 和 22。在另一优选例中，根据扩增获得的微卫星标记，计算以下一种或多种指标①有效 等位基因数；②平均遗传杂合度；和③多态信息含量(PIC)，并根据指标的高低来确定或判 断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中高指标则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非 鱼；高指标则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；低指标则提示或初步判断待检 测鱼类是萨罗罗非鱼。具体地，①有效等位基因数吉鲡罗非鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼；②平均 遗传杂合度吉鲡罗非鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼；③多态信息含量(PIC)吉鲡罗非 鱼>尼罗罗非鱼>和萨罗罗非鱼。本发明的其它方面由于本文的技术公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。此外，应理解，在本发明范围内，本发明上述的以及下述的技术特征(包括实施例中的 技术特征)可以互相组合，从而构成新的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1显示了吉鲡鱼(图1A)、尼罗罗非鱼(图1B)、萨罗罗非鱼(图1C)的染色体 中期分裂相。图2显示了吉鲡鱼(图2A)、尼罗罗非鱼(图2B)、萨罗罗非鱼(图2C)的染色体 核型图。图3显示了吉鲡鱼(图3A)、尼罗罗非鱼(图:3B)、萨罗罗非鱼(图3C)的同工酶 电泳图和扫描图。图4显示了吉鲡鱼(13-18)、尼罗罗非鱼(19- )、萨罗罗非鱼(7_12)的4对微卫 星引物扩增谱带图。其中，M 分子标记(GeneRulerTM IOObp Ladder)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，虽然吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼 和萨罗罗非鱼的外形难以辨别，但是通过其某些特定的遗传特性，可以可靠而准确地将吉 鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼有效地区分开。具体地，适合作为甄别的遗传特性或遗 传特征包括以下(a)染色体组型，(b)同工酶，(3)微卫星标记。其中，尤其以同工酶的检 测更为方便和直观。“萨罗罗非鱼”(Sarotherodon melanotheron)，与“尼罗罗非鱼，，(Oreochromisniloticus)同为倉卢形目(Perciformes)，_ 鱼禾斗(Cichlidae)，但为不 同属。“尼罗罗非鱼”归“罗非”鱼属(Oreochromis)，而“萨罗罗非鱼”归“萨罗”鱼属 (Sarotherodon)，它们的亲缘关系较远。如本文所用，术语“吉鲡鱼”、“吉鲡罗非鱼”、“吉丽鱼”、““吉丽罗非鱼”、等可互换 使用，都是指“尼罗罗非鱼”和“萨罗罗非鱼”的杂交后代，尤其是由“尼罗罗非鱼”(“新吉 富”品系)为母本，“萨罗罗非鱼”为父本，杂交(正交)所获得的罗非鱼品种。在中国专利 申请CN200810042(^9. 0(2008年8月25日申请)中，公开了吉鲡鱼的育种方法。就方法而言，本领域中已有的(1)染色体组型检测方法和试剂，(2)同工酶检测方 法和试剂，(3)微卫星标记的检测方法和试剂，都可用于本发明。以染色体组型检测为例，可用常规方法获得鱼类的染色体显微照片，并用常规方 法进行染色体分类和分组等分析。例如，染色体分类可依据Levan等的标准确定；染色体分 组可参照Biclcham的标准；臂数统计可按Gorman的方法进行，即中部和亚中部着丝粒染色 体的臂数计为2。以同工酶检测为例，同工酶为该酶基因产物的表现型，根据其所带电荷的不同和 分子大小、形状的不同，在电场和凝胶中出现各同工酶组分不同的迁移率，经催化、染色、扫 描，根据酶带迁移距离、数目及吸收强度进行分析比较，判定鱼类物种、种群的遗传特性。通常，同工酶检测时，先对鱼组织进行勻浆，然后离心获得上清，再通过电泳法检 测同工酶。针对不同的类型同工酶的检测，可用相应的染色剂进行染色。例如，对于苹果酸 脱氢酶(MDH)，可用含辅酶I、NBT, PMS的Tris-HCl染色缓冲液(pH9. 5) +苹果酸钠溶液进 行染色；对于乳酸脱氢酶(LDH)，可用含辅酶I、NBT，PMS的Tris-HCl染色缓冲液(pH9. 5) + 乳酸钠溶液进行染色。详见例如中华人民共和国国家标准(GB/T18654. 13-2008)《养殖鱼 类种质检验第13部分同工酶电泳分析》。本发明的主要优点在于(a)通过本发明揭示的遗传标记，能够可靠的、准确地鉴别出吉鲡罗非鱼。(b)本发明的种质检测方法简便，重现性好。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1染色体组型分析1. 1 方法采用植物血球凝集素(PHA)体内注射法制备染色体玻片标本。取健康鱼10尾， 体重IOOg左右。实验鱼在实验前一周暂养于室内控温、充气水族箱中，水温约为30°C。按 10 μ g/g鱼体重胸鳍注射PHA，16 1 后按2 μ g/g鱼体重注射秋水仙素溶液，3h后剪鳃 放血，取头肾置于盛生理盐水的平皿中，磨碎，使其中的细胞游离出来。吸取细胞悬液在
70. 075mol/LKCL溶液中37°C低渗30min。随后用1000r/min离心8min，弃去上清液，加入新 配的Carnoy氏液(甲醇冰醋酸=3 1)固定15min再离心8min，后重复固定并离心2 次。最后一次固定并离心后，弃去大部分上清液，制成悬液并进行冰冻滴片，干燥后，用3% Giemsa氏染液进行扣染，烘干后镜检，显微拍照。染色体分类依据Levan等的标准确定；染 色体分组参照Biclcham的标准；臂数统计按Gorman的方法进行，即中部和亚中部着丝粒染 色体的臂数计为2。1. 2 结果
权利要求
1.一种确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的方法，其特征在于，包括步骤 对待检测的鱼类进行同工酶检测，并将检测结果与阳性对照或标准品进行比较，从而确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测同工酶包括对鱼组织进行勻 浆，然后离心获得上清，再通过电泳法检测同工酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待检测的鱼类包括吉鲡罗非鱼、尼罗 罗非鱼、萨罗罗非鱼或其组合。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鱼组织包括选自下组的组织肌肉组 织、肝组织、肾脏组织、心组织、眼、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阳性对照是吉鲡罗非鱼的乳酸脱氢 酶的同工酶图谱，或者标准品包括以下鱼类的乳酸脱氢酶的同工酶图谱吉鲡罗非鱼、尼罗 罗非鱼、和萨罗罗非鱼。
6.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢 酶，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶， 则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则 提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。
7.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对待检测的鱼类进行染色体组型检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否 是吉鲡罗非鱼；和/或对待检测的鱼类进行微卫星标记检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否 是吉鲡罗非鱼。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，如果检测结果显示染色体组型公式为2n= 6sm+24st+14 ；则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组 型公式为2n = 2m+4sm+24st+14t ；则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼；如果检测 结果显示染色体组型公式为2n = lm+5sm+2ht+14t，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。
9.一种用于甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括(a)一容器，所述的容器内包括进行鱼类同工酶检测所需的试剂，其中所述的同工酶是 乳酸脱氢酶；(b)说明书，所述的说明书说明了基于乳酸脱氢酶的同工酶检测结果判定鱼类是否是 吉鲡罗非鱼的标准；更佳地，所述的试剂盒还包括任选的用于染色体组型检测的试剂和/或任选的用于 微卫星标记检测的试剂。
10.一种鱼类的乳酸脱氢酶同工酶的用途，其特征在于，用作鉴定吉鲡罗非鱼的遗传标 记，或用于制备甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用。具体地，本发明提供了一种适合海水养殖的新品种-吉鲡罗非鱼(尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼的属间远缘杂交和选育子代)的遗传特性的甑别方法及其应用。一种方法包括对待检测的鱼类进行同工酶、染色体组型、和/或微卫星标记检测，并将检测结果与阳性对照或标准品进行比较，从而确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶。本发明方法能够可靠的准确地甄别吉鲡罗非鱼。
文档编号C12Q1/68GK102094069SQ20091020019
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者李思发, 蔡完其, 许映芳 申请人:李思发