用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作和使用方法

专利名称：：用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作和使用方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作方法，属于基因芯片
技术领域：
。
背景技术：
：癌转移是影响肿瘤病人生存的首要因素，也是攻克肝细胞癌OfepatocellularcarcinomiHCC)(简称肝癌)的重要关键。目前尚无足够特异、敏感的转移复发预测指标及预测模型，而早期准确预测转移复发是及时有效防治的前提，也是进一步延长病人生存的保证。本预测芯片可对肝癌转移潜能进行准确预测，从而能对根治术后肝癌患者转移、复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，减少复发、转移，进一步改善患者预后。癌转移是本世纪生命科学要迫切解决的重大问题，也是攻克肝癌的重要关键。肝癌是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第5位、死因第3位；每年新发病564，000例，死亡549，000例，我国占其中一半以上，是我国恶性肿瘤中第2位的杀手。虽然部分肝癌病人因早诊、早治及积极、综合治疗而获得长期生存，但转移、复发已成为进一步提高肝癌治疗效果的最主要障碍。如何及早预测、诊断、防治肝癌转移就成为进一步提高肝癌治疗效果的关键。近年肝癌转移复发研究备受关注，虽有所进展，但仍存在许多问题转移机理不明是缺乏有效防治手段的关键原因目前临床的主要困惑在于无法早期判断和预测哪些病人已经或将会发生转移复发、更无有效防治措施。如能了解调控癌转移的分子机制，将有助于早期识别或预测高危患者，有助于探索有效的干预措施、及时有效的治疗，从而进一步延长肿瘤病人生存。目前已知肿瘤转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，涉及癌细胞本身及其与癌周微环境和宿主免疫状态间的相互作用。但其确切机制尚不清楚。尚无足够特异、敏感的转移复发预测指标及预测模型早期准确预测转移复发是及时有效防治的前提，也是进一步延长病人生存的保证。传统的肿瘤诊断、分级、分型方法仅以肿瘤细胞组织来源、细胞形态学和蛋白标记物等为标准，不能充分反映肿瘤的真实情况，无法解决肿瘤的异质性问题。临床上适合手术治疗的肝癌患者绝大多数具有相同的病理分级(II-III级)和临床分期(MI-II期)，给予相同治疗后，病程和预后却截然不同。目前临床应用的病理分级和临床分期(如TNM分期)无法对临床复发、转移作出准确预测，无法解释为何临床分期同期、病理分级同级患者给予相同治疗但预后可以截然不同。加上病理医师的人为因素(主观性)等原因，具有严重的局限性，往往要在肿瘤转移之后才能作出诊断，而无法在肿瘤转移之前作出正确的诊断和预测。近年，随着分子生物学技术的进步以及对肿瘤生物学的更多了解，已探索了许多与肿瘤侵袭转移相关的分子标记物，但以往研究的另一个重大缺点是这些研究大都为单因素研究模式，每次研究都集中在一个或少数几个基因，无法全面了解整个基因组多个基因的变化情况，不能反映肝癌转移的确切分子生物学特征。且由于肿瘤转移是由多因素参与调节的复杂过程，既往的单因素研究难以反映复杂转移过程的整体本质，难以准确预测临床转移过程。所以至今没有一个指标能在临床上用作肝癌转移复发的预测、诊断。90年代后期以来发展的基因组与转录组学技术，改变了传统的单基因研究模式，使我们能从全基因组水平分析相关基因表达水平及其结构异常，以及相互作用网络、途径及调控机制等。也使研究肿瘤转移过程中多基因改变的模式及其调控机制成为可能。最近，基因表达谱已被用于多种肿瘤的分子分期、以及对治疗反应及预后判断等，如关于乳腺癌患者术后复发转移多基因预测模型已经过美国FDA批准作为诊断工具进行临床应用。但在肝癌转移及其预测中尚无相关报道。
发明内容本发明的目的是提供一种基因芯片，用于对术后肝癌患者转移与复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，进一步降低术后转移复发，改善患者预后。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的基因检测探针，其特征在于，所述探针共有146个，其特异寡核苷酸序列如下—基因名称探针序列ABL2ACTTTGCCAGCTGTGTGGAGGATGGATTTGAGGGAGACAAGACTGGAGGCAGTAGTCCAG_ADD2__CAAGGGAGACGAGGATACCAAAGACGATTCAGAGGAGACGGTGCCCAACCCCTTCAGCCAACTCACTGACAKR1C4CACAGCCTCTGGTTAAATCCCTCCCCTCCTGCTTGGCAACTTCAGCTAGCTAGATATATCCATGGTCCAGALDH3B1AACTGTGTGGTGCTGMGCCATCGGAGATTAGCMGAACGTCGAGAAGATCCTGGCCGAGGTGCTGCCCCALDH3B2GGAACCAAAATGGAGTCACTTATGCCAAACTCTAATAAAATGGAGTCGGGGGGCCACATAGAAGCCCTCAANKRDlTACAAGACCTCTCGCATAGCTACATTCTGAGGCAAACGACAGACTCTTMTCAGTAAATGTTCACTGGCAPlSlTTGGCTTTTATTCCCTGCCTTTGCAGMCTGATGTCACCCCAGATGTCCTTCCCTCCCTAATAACTGTAARPP-21TCCCATTTGACAAGGTACCAGGAGGAAATTTTTTAAGGGATCMCTGTATCACAGTGCCCACTCTGGAC<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>WWTRlCCTTAGACTGCCAGGCACAGAGTCGGGTCGGGATTTGTCAGCCAAGCCTCGGCTCCAGCTCCGCAATCTCYESl__TTCTGTTTACGTAACCTGCTTAGTATTGACACTCTCTACCAAGAGGGTCTTCCTMGAAGAGTGCTGTCYRDCCTCCTCTCTGGTGGGTGGTGGCATTTAAGGTTCAAACCAGCCAGAAGTGCTGGTGCTGTTTAAAAAGTCZC3H12AGCTCCCAACCTGGAGCCTCCACTCCCAGAAGAGGAAAAGGAGGGCAGCGACCTGAGACCAGTGGTCATCGZNF415TATTATCCTATGTGGGAGCACAGGAAAGAGCCCTGGACCATAGAAAGCCAAGTACGAGTAGCAAGAAAACZNF646GGGAGCGCGTGCAGGGAGGGGCTTGATCTCCACATTTTCTCAGGAfrTAGTTCGGGCATCCCCATATCTT所述的基质为玻璃基片。本发明还提供了上述基因芯片的制作方法，其特征在于，具体步骤为第一步用寡核苷酸合成仪制备探针；第二步使用基因芯片点样仪将合成好的探针点在玻璃基片上，制成基因芯片。本发明还提供了上述基因芯片的使用方法，其特征在于，具体步骤为第一步对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzoI法进行总RNA抽提将患者切除的肝癌组织和癌旁组织与TRIzoI试剂按比例50-100毫克1ml混合，用勻浆器勻浆；将勻浆液在室温下孵育5分钟，按10.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2-3分钟；于12000Xg、4°C条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每ImlTRIzol试剂加入0.5ml的比例加入异丙醇，混勻，15-30°C下静置10分钟，于12000Xg、4°C条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照ImlTRIzol试剂加入Iml的比例加入75%乙醇，振荡混勻；于7500Xg,4°C条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5-10分钟；用DEPC处理过的水重新溶解RNA；取1μ1RNA溶液用199μ1ρΗ7.4的TE缓冲液稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度；第二步采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测将IOXMOPS缓冲液IOml、0.1%DEPC(焦碳酸乙二酯)水70ml、37%甲醛20ml与RNA琼脂糖1.Og混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用DEPC处理过的水将IOXMOPS缓冲液稀释成IXMOPS缓冲液配制电泳缓冲液；将RNA样品5.5μ1、IOXMOPS缓冲液1.0μ1、37%甲酸3.5μ1以及去离子甲酰胺10.0μ1混合，配成电泳样品，65°C孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μ1IOXRNA加样缓冲液以及0.ΙμΕΒ，混合均勻后加入上样孔内，电压100V条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；第三步将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用MonoreactiveCy5Dye(AmershamPharmaciaBiotech,#PA23001)标记月中瘤组织cDNA,用MonoreactiveCy3Dye(AmershamPhamaciaBiotech,#PA25001)标记癌旁组织cDNA；分另Ij用MicroconYM-30(MILLIP0RE,Amicon,Cat#42410)离心柱对cDNA进行纯化(1)将组织总RNA、浓度为2μg/μ1OligodT20-mer以及DEPC处理过的水按比例40μg2μ123μ1混合，总体积为25μ1，65°C孵育5分钟，冷却至室温得到RNA样品混合液；配制20XdNTP混合液，所述混合液中含有IOmMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP，4mMdTTP以及6mM氨基修饰的dUTP；将5XRTbuffer10μ1、20XdNTP混合液2.5μ1、0.IMDTT5μ1、superRNaseIN1μ1以及DEPCtreatedwater4.5μ1混合得到逆转录反应混合液；将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合，加入2μ1浓度为200U/μ1的逆转录酶SuperscriptII，42°C孵育60分钟，70°C孵育5分钟，短暂离心，加入2μ1浓度为2U/μ1的RNA酶H，370C孵育30分钟；加入0.5μ1浓度为0.5ΜEDTA终止反应，加入10μIQuickcleanenzymeremoveresin，振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟；收集滤液，加入5.5μ13Μ醋酸钠溶液，137.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，_20°C放置1小时，使cDNA沉淀；4°C以14000转/分的速度离心15分钟；弃上清，用500μ170%的乙醇洗涤沉淀两次；37°C孵育4-6分钟；用20μ10.IM碳酸氢钠溶液重新溶解cDNA；(2)用10μ1去离子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暂离心备用；取2ul染料溶液加入用碳酸氢钠溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混勻，用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA；室温下于暗处放置1小时，每20分钟振荡混勻一次，使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA；(3)在标记过的cDNA混合液中加入2.5μ13Μ醋酸钠溶液，62.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，-20°c放置1小时，使标记后的cDNA沉淀；4°C以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底；吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗涤沉淀；37°C孵育4-6分钟；用80μ1TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织cDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均勻；加入550μ1的PB缓冲液，混合均勻；将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟，弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μ1的PE缓冲液，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；弃过滤液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇；在纯化过滤离心柱中加入50μ1的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA；(4)在MicroconYM-30离心柱中加入400μ1ρΗ7·4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱；将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心8-10分钟，至液体剩余体积为20-40μ1；加入400μ1ρΗ7.4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心8-10分钟洗涤cDNA，重复3_4次；最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μ1，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA；加入ρΗ7.4的TE缓冲液使体积为17μ1；第四步将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交按下列比例配制预杂交缓冲液20XSSC15ml、10%SDS0.6ml、10%BSA6ml以及去离子蒸馏水38.4ml；将预杂交液倒入预杂交槽中，于42°C水浴箱内预热10分钟；将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上；用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟；将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟；于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥；将芯片置芯片盒内保存；将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交1-3小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；第五步基因芯片杂交将去离子甲酰胺250μ1、20XSSC250μ1以及10%SDSlOμ1混合配制2ΧF-杂交缓冲液；震荡摇勻后42°c保存；将1μ1浓度为10μg/μ1的HumanC0T-1DNA、1μ1浓度为8-10μg/μ1的polyA及1μ1浓度为4μg/μ1的yeasttRNA加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μ1；震荡混勻、短暂离心，将杂交样品置100°C加热器中变性2分钟，置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42°C加热器内5分钟；加入20μ1的2ΧF-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均勻，短暂离心，最后总体积为40μ1；将杂交样品加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内；将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μ1双蒸水；盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42°C水浴箱内孵育过夜；第六步杂交后芯片的洗涤和扫描分析将杂交芯片浸入含有IXSSC及0.SDS的洗涤液中，洗涤芯片2分钟；在IXSSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2XSSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2XSSC洗涤液中洗涤1分钟；在0.05XSSC洗涤液中洗涤30秒；于700rpm离心芯片5分钟；用GenePix4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。本发明的原理如下过去经典肿瘤转移理论认为转移是肿瘤细胞高度克隆选择的过程，在原发瘤中仅少数癌细胞具有转移潜能，而且转移发生在肿瘤晚期(Fidler.NatRevCancer2003)。这些理论对指导肿瘤转移研究起到重要作用。但这些理论大多从动物实验模型中得出，缺乏人类肿瘤转移的直接证据。临床上常见肿瘤很小，但很早已出现远处转移，甚至原发瘤隐匿不现而全身转移者；并且许多病理特征、临床分期相同的肿瘤病人却具有完全不同的疾病过程和预后(Ramaswamyetal.NatGet2003)。这些是经典肿瘤转移理论所难以解释的。本发明应用cDNAmicroarrays技术在全基因组范围比较研究40例伴或不伴肝内播散的肝癌组织中9，180个基因表达谱的变化，发现伴转移肝癌与不伴转移肝癌之间基因表达差异明显(153个基因有显著差异，ρ<0.001)，而肝癌原发瘤与其转移灶间基因表达谱差异并不非常显著(P>0.05)；且这种差异与肿瘤大小等临床病理特征并无明显关系。不同临床分组间基因表达谱差异分析(CCP法)如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由此提示促使肝癌转移的基因改变可能在原发肿瘤阶段就已经发生，高转移倾向肝癌与低转移倾向肝癌具有完全不同的基因谱。这可能就是临床上为何肝癌的临床病例特征(肿瘤大小、病理分级及临床分期等)相似、而治疗效果和生存期差异明显的原因之一。据此，该研究在国际上首次提出促使肝癌转移的基因改变主要发生在原发瘤阶段的新观点，回答了有关肿瘤转移潜能是在原发瘤阶段即已存在、还是在肿瘤转移过程中逐渐获得的这一长期存在争论的问题，有助于转移前肿瘤的及早发现。此为肝癌转移理论的重要创新，这一发现丰富了经典转移理论，也为肝癌转移复发的早期预测、诊断和防治奠定了理论基础。提示转移复发可早期预测及发现、转移防治应从“源头”抓起。研究结果以封面文章形式发表在“自然医学杂志”(NatMed2003，IF28.9)。如何及早、准确地预测肝癌的转移潜能是困扰临床的一大难题。根据上述研究发现的伴转移肝癌与不伴转移肝癌之间153个显著差异基因，在国际上首次建立了能正确预测病人有无肝内转移的多分子预测模型，可将20例(100%)建立模型标本进行准确分类，经小样本验证，可以准确预测另外20例待测标本中的至少18例，预测准确率达90%(NatMed2003)。最近，本发明采用AffymetrixU133A基因芯片(不同平台)对该预测模型进行了241例大样本独立验证，在新基因芯片中，对153个预测基因进行优化，应用优化后其中146个基因组成的预测模型对患者进行生存预测分析并分组，发现高风险组生存预后比低风险组显著差(P=0.0014，如图1所示，为肝癌转移预测模型对241例术后肝癌患者生存预测分析结果图)，可以对患者生存进行准确预测。更重要的是该预测模型可以对单发肿瘤肝癌(P=0.0006,如图2所示，为肝癌转移预测模型对189例单发肿瘤肝癌患者生存预测分析结果图)和小肝癌(肿瘤小于5cm)(P=0.0029，如图3所示，为肝癌转移预测模型对154例小肝癌患者生存预测分析结果)进行准确的生存预测。此外应用该预测模型还可以对肝癌患者术后早期复发进行准确的预测(P=0.0006，如图4所示，为肝癌转移预测模型对186例肝癌患者早期复发预测分析结果图)。这是国际上第一个经过不同试验平台和不同病例分组(大样本)验证可用于肝癌临床转移复发及预后预测的分子诊断模型。这是肝癌转移预测方法的重要进展，揭示了肿瘤细胞分子生物学特性是决定肿瘤转移的重要因素，经大样本量的进一步验证，证实其具有重要的临床应用价值。146个预测基因列表及其权重如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>预测计算公式如下P=ΣWiXi-O.166532其中，Wi表示i基因的权重，Xi表示i基因的表达结果的对数值。预测结果的判定如下根据预测计算公式计算每个病例的预测值P值，如果P>-0.055761，则判定为高风险，如果P彡-0.055761，则判定为低风险。本发明的优点是采用基因组比较研究，经大样本量独立验证，证明该预测模型可对肝癌患者转移潜能进行准确预测和评估，从而可对患者术后生存和转移、复发进行准确预测(即使早期肝癌患者也可进行准确预测)，将有助于早期识别或预测高危患者，对其进行重点监测和有效干预，从而进一步延长肿瘤病人生存。图1为肝癌转移预测模型对241例术后肝癌患者生存预测分析结果图；图2为肝癌转移预测模型对189例单发肿瘤肝癌患者生存预测分析结果图；图3为肝癌转移预测模型对154例小肝癌患者生存预测分析结果图4为肝癌转移预测模型对186例肝癌患者早期复发预测分析结果图。具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的基因检测探针，所述的基质为玻璃基片。所述探针共有146个，其特异寡核苷酸序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>\<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>上述基因芯片的制作方法如下第一步用寡核苷酸合成仪制备探针；第二步使用基因芯片点样仪将合成好的探针点在玻璃基片上，制成基因芯片。实施例1患者洪某，男，39岁，因患原发性肝癌于2002年8月21日于我院进行根治性手术切除治疗，术后我们收集患者手术标本，使用实施例1制成的基因芯片按下述方法进行检测第一步对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzoI法进行总RNA抽提1.取50毫克组织，加入ImlTRIzol试剂(GIBC0公司生产)，组织的体积不应超过加入TRIzol体积的10%。使用勻浆器充分勻浆。2.将勻浆液在室温下孵育5分钟，使核蛋白复合体充分裂解。3.按10.2(TRIzol氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃15秒钟，室温下孵育2分钟。4.于12000Xg、4°C条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚_氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入TRIzol体积的60%o5.将水相移入一个干净的离心管中，按照每ImlTRIzol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混勻，15-30°C静置10分钟。6.于12000Xg、4°C条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。7.RNA洗涤倒掉上清液，按照ImlTRIzol加入Iml的比例加入75%乙醇，振荡混勻。8.于7500Xg、4°C条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5分钟，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。9.用DEPC处理过的水重新溶解RNA。10.用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度取1μ1RNA溶液用199μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及纯度。11.当证实RNA样品纯度良好时进入下一步。第二步采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测1.甲醛变性琼脂糖凝胶的制备(1%琼脂糖，IOOml)组成成份体积(ml)IOXMOPS缓冲液100.1%DEPC水7037%甲醛20RNA琼脂糖1.Og2.电泳缓冲液的制备用DEPC处理过的水将IOXMOPS缓冲液稀释成IXMOPS缓冲液。3.按下列组成配制电泳样品，650C孵育5分钟，冰上冷却。RNA样品5.5μ(2μ§)IOXMOPS缓冲液1.0μ37%甲醛3.5μ去离子甲酰胺10.0μ4.力Π2μ110ΧRNA加样缓冲液、0·1μ1EB,电压100V条件下电泳约30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照。当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；第三步将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA；分别用MicroconYM-30离心柱对cDNA进行纯化；(1)肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA1.取组织总RNA40μg,加入2μ1OligodT20-mer(2μg/μ1)，加入DEPC处理过的水到总体积为25μ1，混合均勻。2.65°C孵育5分钟，室温下放置超过3分钟，使样品混合液冷却至室温。3.按以下比例配制逆转录所需20XdNTP混合液10mMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP,4mMdTTP,6mMaminoally-dUTP(氨基修饰的dUTP，可以和N-羟琥珀酰亚胺活化的荧光染料进行偶联反应)。4.按以下列表准备逆转录反应混合液，混合均勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5.将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合。6.加入2μ1逆转录酶(SuperscriptII，200U/μ1)，充分混勻(注意防止气泡形成)。7.42°C孵育60分钟。8.70°C孵育5分钟，使逆转录酶失去活性。9.加入2μIRNA酶H(2U/μ1)，37°C孵育30分钟，降解残余RNA010.力口入0·5μ10.5ΜEDTA终止反应，力口入10μ1Quickcleanenzymeremoveresin，振荡器剧烈振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。11.将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。12.收集滤过液，加入5.5μ13Μ醋酸钠溶液，137.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，-20°C放置1小时，使cDNA沉淀。13.40C以14000转/分的速度离心15分钟。14.弃上清，用500μ170%的乙醇洗涤沉淀两次。15.37°C孵育4分钟，使沉淀干燥。16.用20μ10.IMNaHCO3溶液重新溶解cDNA。(2)cDNA的间接标记1.用10μ1去离子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暂离心，备用。2.取2ul染料溶液加入用NaHCO3溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混勻。用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA(激光激发后显红色荧光)，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA(激光激发后显绿色荧光)。3.室温下于暗处放置1小时，每20分钟柔和振荡混勻一次。使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA。(3)使用Qiagen公司的QIAquickPCRPurification试剂盒进行cDNA纯化1.在探针标记混合液中加入2.5μ13Μ醋酸钠溶液，62.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，_20°C放置1小时，使标记后的cDNA沉淀。2.4°C以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底。3.吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗涤沉淀。4.370C孵育4-6分钟，使沉淀干燥。5.用80μ1TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织cDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均勻。6.加入550μ1的PB缓冲液，混合均勻。7.将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。8.弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μ1的PE缓冲液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均勻)，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。9.弃滤过液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇。10.在纯化过滤离心柱中加入50μ1的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA。(4)用MicroconYM-30离心柱对cDNA进行纯化1.在MicroconYM-30离心柱中加入400μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱。2.将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心8分钟，至液体剩余体积为20μ1。3.加入400μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)，以9000转/分的速度离心8分钟洗涤cDNA，重复3次。4.最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μ1，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA。5.加入TE缓冲液(ρΗ7.4)使体积为17μ1。第四步将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交1.按照下列比例配制终浓度为5ΧSSC、0.1%SDS及i%BSA的预杂交缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>2.将预杂交液倒入预杂交槽中，于42°C水浴箱内预热10分钟。3.将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上。4.用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟。5.将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟。6.于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥。7.将芯片置芯片盒内保存(注意芯片干燥后放置时间不能超过1小时)。将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交1小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；第五步基因芯片杂交1.按以下比例配制新鲜2XF-杂交缓冲液去离子甲酰胺250μ1+20ΧSSC250μ1+10%SDSlOy1。2.震荡摇勻后保存在42°C加热器内。3.1μ1HumanC0T-1DNA(10μg/μ1)、1μ1polyA(8μg/μ1)及1μ1yeasttRNA(4μg/μ1)加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μ1。4.震荡混勻、短暂离心。5.将杂交样品置100°C加热器中变性2分钟，迅速置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42°C加热器内5分钟。6.加入20μ1的2ΧF-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均勻，最后总体积为40μ1。7.将杂交样品小心加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内，注意勿产生气泡。8.将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μ1双蒸水(保持杂交槽内的湿度)。9.盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42°C水浴箱内孵育过夜(12-16小时)。第六步杂交后芯片的洗涤和扫描分析1.将杂交芯片浸入IXSSC及0.SDS洗涤液中，小心使盖玻片从芯片上滑落，洗涤芯片2分钟。2.在IXSSC洗涤液中洗涤2分钟。3.在0.2XSSC洗涤液中洗涤2分钟。4.在0.2XSSC洗涤液中洗涤1分钟。5.在0.05XSSC洗涤液中洗涤30秒。6.于700rpm离心芯片5分钟，使芯片干燥。7.尽快用GenePix4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。各浓度洗涤液的配置方法列表<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>用BRB-T00LS软件对这146个基因的表达情况进行分析，并根据预测公式P=Σ^iXi-O.166532计算，结果P<-0.055761，预测为低风险组。患者随访至今无复发转移情况。实施例2患者朱某，男，44岁，因患原发性肝癌于2002年12月30日于我院进行根治性手术切除治疗，术后我们收集患者手术标本，使用实施例1制成的基因芯片按下述方法进行检测第一步对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzoI法进行总RNA抽提1.取100毫克组织，加入ImlTRIzol试剂(GIBC0公司生产)，组织的体积不应超过加入TRIzoI体积的10%。使用勻浆器充分勻浆。2.将勻浆液在室温下孵育5分钟，使核蛋白复合体充分裂解。3.按10.2(TRIzol氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃15秒钟，室温下孵育3分钟。4.于12000Xg、4°C条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚_氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入TRIzol体积的60%。5.将水相移入一个干净的离心管中，按照每ImlTRIzol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混勻，15-30°C静置10分钟。6.于12000Xg、4°C条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。7.RNA洗涤倒掉上清液，按照ImlTRIzol加入Iml的比例加入75%乙醇，振荡混勻。8.于7500Xg、4°C条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀10分钟，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。9.用DEPC处理过的水重新溶解RNA。10.用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度取1μ1RNA溶液用199μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及纯度。当证实RNA样品纯度良好时进入下一步。第二步采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测1.甲醛变性琼脂糖凝胶的制备(1%琼脂糖，IOOml)组成成份体积(ml)IOXMOPS缓冲液100.1%DEPC水7037%甲醛20RNA琼脂糖l.Og5.电泳缓冲液的制备用DEPC处理过的水将IOXMOPS缓冲液稀释成IXMOPS缓冲液。6.按下列组成配制电泳样品，65°C孵育5分钟，冰上冷却。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>7.力Π2μ1IOXRNA加样缓冲液、0.1μ1EB,电压100V条件下电泳约30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照。当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；第三步将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA；分别用MicroconYM-30离心柱对cDNA进行纯化；(1)肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA1.取组织总RNA40μg,加入2μ1OligodT20-mer(2μg/μ1)，加入DEPC处理过的水到总体积为25μ1，混合均勻。2.65°C孵育5分钟，室温下放置超过3分钟，使样品混合液冷却至室温。3.按以下比例配制逆转录所需20XdNTP混合液10mMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP,4mMdTTP,6mMaminoally-dUTP(氨基修饰的dUTP，可以和N-羟琥珀酰亚胺活化的荧光染料进行偶联反应)。4.按以下列表准备逆转录反应混合液，混合均勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>5.将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合。6.加入2μ1逆转录酶(SuperscriptII，200U/μ1)，充分混勻(注意防止气泡形成)。7.42°C孵育60分钟。8.70°C孵育5分钟，使逆转录酶失去活性。9.加入2μ1RNA酶H(2U/μ1)，37°C孵育30分钟，降解残余RNA。10.力口入0.5μ10.5ΜEDTA终止反应，力口入10μ1Quickcleanenzymeremoveresin，振荡器剧烈振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。11.将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。12.收集滤过液，加入5.5μ13Μ醋酸钠溶液，137.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，-20°C放置1小时，使cDNA沉淀。13.40C以14000转/分的速度离心15分钟。14.弃上清，用500μ170%的乙醇洗涤沉淀两次。15.37°C孵育6分钟，使沉淀干燥。16.用20μ10.IMNaHCO3溶液重新溶解cDNA。(2)cDNA的间接标记1.用10μ1去离子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暂离心，备用。2.取2ul染料溶液加入用NaHCO3溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混勻。用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA(激光激发后显红色荧光)，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA(激光激发后显绿色荧光)。3.室温下于暗处放置1小时，每20分钟柔和振荡混勻一次。使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA。(3)使用Qiagen公司的QIAquickPCRPurification试剂盒进行cDNA纯化1.在探针标记混合液中加入2.5μ13Μ醋酸钠溶液，62.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，_20°C放置1小时，使标记后的cDNA沉淀。2.4°C以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底。3.吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗涤沉淀。4.370C孵育4-6分钟，使沉淀干燥。5.用80μ1TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织eDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均勻。6.加入550μ1的PB缓冲液，混合均勻。7.将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。8.弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μ1的PE缓冲液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均勻)，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。9.弃滤过液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇。10.在纯化过滤离心柱中加入50μ1的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA。(4)用MicroconYM-30离心柱对cDNA进行纯化1.在MicroconYM-30离心柱中加入400μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱。2.将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心10分钟，至液体剩余体积为40μ1。3.加入400μ1TE缓冲液(ρΗ7.4)，以9000转/分的速度离心10分钟洗涤cDNA，重复4次。4.最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μ1，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA。5.加入TE缓冲液(pH7.4)使体积为17μ1。第四步将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交1.按照下列比例配制终浓度为5ΧSSC、0.1%SDS及1%BSA的预杂交缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>2.将预杂交液倒入预杂交槽中，于42°C水浴箱内预热10分钟。3.将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上。4.用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟。5.将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟。6.于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥。7.将芯片置芯片盒内保存(注意芯片干燥后放置时间不能超过1小时)。将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交3小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；第五步基因芯片杂交1.按以下比例配制新鲜2XF-杂交缓冲液去离子甲酰胺250μ1+20ΧSSC250μ1+10%SDSlOy1。2.震荡摇勻后保存在42°C加热器内。3.1μ1HumanC0T-1DNA(10μg/μ1)、1μ1polyA(10μg/μ1)及1μ1yeasttRNA(4μg/μ1)加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μ1。4.震荡混勻、短暂离心。5.将杂交样品置100°C加热器中变性2分钟，迅速置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42°C加热器内5分钟。6.加入20μ1的2ΧF-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均勻，最后总体积为40μ1。7.将杂交样品小心加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内，注意勿产生气泡。8.将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μ1双蒸水(保持杂交槽内的湿度)。9.盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42°C水浴箱内孵育过夜(12-16小时)。第六步杂交后芯片的洗涤和扫描分析1.将杂交芯片浸入IXSSC及0.1%SDS洗涤液中，小心使盖玻片从芯片上滑落，洗涤芯片2分钟。2.在IXSSC洗涤液中洗涤2分钟。3.在0.2XSSC洗涤液中洗涤2分钟。4.在0.2XSSC洗涤液中洗涤1分钟。5.在0.05XSSC洗涤液中洗涤30秒。6.于700rpm离心芯片5分钟，使芯片干燥。7.尽快用GenePix4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。各浓度洗涤液的配置方法列表<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>用BRB-T00LS软件对这146个基因的表达情况进行分析，并根据预测公式P=ΣWiXi-O.166532计算，结果P>-0.055761，预测为高风险组。术后患者于2003年3月出现肝内复发，2003年12月死亡。序列表<110>复旦大学附属中山医院<120>用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作和使用方法<160>146<210>1<211>60<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>1actttgccagctgtgtggaggatggatttgagggagacaagactggaggcagtagtccag60<210>2<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>2caagggagacgaggataccaaagacgattcagaggagacggtgcccaaccccttcagcca60actcactgac70<210>3<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>3cacagcctctggttaaatccctcccctcctgcttggcaacttcagctagctagatatatc60catggtccag70<210>4<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>4BBctgtgtggtgctgaagccatcggagattagcaagaacgtcgagaagatcctggccgag60gtgctgcccc70<210>5<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>5ggaaccaaaatggagtcacttatgccaaactctaataaaatggagtcggggggccacata60gaagccctca70<210>6<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>6tacaagacctctcgcatagctacattctgaggcaaacgacagactcttaatcagtaaatg60ttcactggc69<210>7<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>7ttggcttttattccctgcctttgcagaactgatgtcaccccagatgtccttccctcccta60ataactgta69<210>8<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>8tcccatttgacaaggtaccaggaggaaattttttaagggatcaactgtatcacagtgccc60actctggac69<210>9<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>9tggagagaggctgcctttctggttccatctccttgggtgtgaggatagaatttcgaacac60caagagtcaa70<210>10<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>10ctgaaacagcttcttctggctcataaagattgccctgtaaccgccatgcagaagaaatct60ggctatcata70<210>11<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>11accacctgctcactggtcaaaacctacacagctgtttcctcacgtccatcactggctctc60taattccact70<210>12<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>12taatataccttcagtcaactttaccaagaagtcctggatttccaagatccgcgtctgaaa60gtgcagtac69<210>13<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>13cagcagctggcgcctcagtccccatctgactcatgtctcttctcatctggttcagaactt60agaagggcg69<210>14<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>14cagcatgtctaccagaaaaatggtttgaaaattctgccatgaggacatctattccacagc60tagaaaactt70<210>15<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>15agggccctgggatggagccaacctgggtattcacaacaggcctgacttgatactaagtga60ttagttttc69<210>16<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>16tacatcccattccttcctagtgagaagctggaaagaaccagctctgtctctccatccaca60gcagagccg69<210>17<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>17acacagtgtgaataaagtgctgcggagcaagaggaggccgttgattcacttcacgctttc60agcgaatga69<210>18<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>18tgctgcctgtaaatatttgtttaatccccagttcgcctggagccctccgccttcacattc60ccctgggga69<210>19<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>19cccactgtagaggacggtgagccgcagctgcatcaacctccttttacctttagataggtg60aatttttaca70<210>20<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>20cacaccctgctgatcaaagtggaaaatgaagacccactcgtacccgacgtctcctacggc60.cccagctcca70<210>21<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>21taaaggcagtcttgagacaggaaagagtgagcttgtaccctttccagatccacagcattg60cactgtcaa69<210>22<211>69<212>DNA<213>A(H.sapiens)<400>22aagagaggctcacaaacaagtaacttgtgagaattctccaaagtctcctaaagtgactgg60aacagcttc69<210>23<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>23atgcccggtcggtgaagctccgaccaggggagcactttgtggaggatgtcactgacacac60tcaaacgctt70<210>24<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>24accctcctatgtgcacccaagatcccaaggcggggcagttactctcagagctatttacaa60accgaaagga70<210>25<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>25catgtgtgtttagtatctgaatttgaaactcatctggtggaaaccaagtttcaggggaca60tgagttttcc70<210>26<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>26tccacaaggtgcgtggaaagagctggacagaaattatctcaactacggtgaggaaggagc60cccagggaa69<210>27<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>27ctctcctcgtctaggtttctttacctccagggatcagctgtgtgtgtgtgacctccctac60cgggctatc69<210>28<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>28ttaacaattcttttccctgtgcttcttatgtaagaatcctcctgtggcctctgcttgtac60agaactggg69<210>29<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>29aatgccaaactagttggccagtctattattgcttatctccagaagaagggctatcctgaa60gtggcactgc70<210>30<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>30tgctacgcagccatgtttgggcctaaaggctttgggcggggcggagccgagagccacact60ttcaagtaa69<210>31<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>31gcccctcgtgctaccaacacttaccctgtgtttaaaaagatcttgtaccaagccaacggc60gttcctggc69<210>32<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>32tcatcctgggcctgttcggcctcctgctgttgctcacctgcctctgtggaactgcctggc60tctgttgcag70<210>33<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>33acctgctccacctccagccctggcgtgtacgcccgtgtcaccaagctcataccttgggtg60cagaagatcc70<210>34<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>34tcatgctgctttctgcgatgtgcgtgtctgttagaataggctctctacccagctagaaca60ccttccagac70<210>35<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>35gcgatggagcagtctcctgccctctcccctgtcctgatggcactctgttgtattttctta60ctgaagttca70<210>36<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>36cactggtgatgttctcggtcgagtctatgctgtcttgtcaaagagagaaggtcgggtact60tcaagaaga69<210>37<211>69<212>DNA　<213>人(H.sapiens)<400>37catgatgacgatcttttgtcttcttctgaagaggagtgcaaggatagggaacgccccatg60tacggccgg69<210>38<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>38ccatcgacaaggctggctacacggaaaagatcgttattggcatggatgttgctgcctcag60agttttatcg70<210>39<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>39aaccaactcatgaggatcgaggaggctcttggggacaaggcaatctttgctggacgcaag60ttccgtaac69<210>40<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>40ctttttgctgccataaatgcctcatgtgtggtctggaagtgctgtgaggatgggacactg60gagttgact69<210>41<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>41cctcagagagagccaaaaatacagaagaggcggagagcgcccctccaaccaggctgttat60tcccctgga69<210>42<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>42ccttaagagctacagctagagaaaccttcacggggtggagagaggattctaaggcttttc60tagcgtgac69<210>43<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>43ggcggcggttcctgtttccgtttcttcctctccgttcggtcgggagtagcatcctccact60cagccaccct70<210>44<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>44gcgcggcgctttcctccgcccggggtggggcccctacagactccgtattttattttttta60aataaaaaa69<210>45<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>45ccaattcaggatattgccctgccatccatgaaaactgttctggcaccaaaagtaatgaca60aatgttaag69<210>46<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>46atggtgtgccaaagacagtttccagaaaatccggaggcagcacttagacttgggttatct60tcccttgact70<210>47<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>47aggagcactacggcgggactgccaccttctacctctctcaagcagccgatggagccaagg60tgctgtgct69<210>48<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>48gacgaactggctacagtaccatgcctctcagcccgtgtgtataatatgaagaccaaatga60tagaactgt69<210>49<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>49agtgctgcctcctgaccacgctgttggacggactaaatacgtccaccaagaactgttaaa60ccacaaaaat70<210>50<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>50aacagatcgctctgaaattagcctactgccttcagacattgacaggtataagaagagatt60tcataagtt69<210>51<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>51gaccctccagggtactaatggggctctgttctgagatggacaaattcagtgttggaaata60catgttgta69<210>52<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>52ggaacgattccaagttacgaagctctgtccattccaagaaaagattcggagacagtattt60aagcacaaat70<210>53<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>53tccagctcagcttctctactctgggcaaggattactctgtggaaggtatgagtgattctc60tgttgaacttv70<210>54<211>69<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>cgctatggc69<210>60<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>60agcatcttctgtttcctggtgagtgattcctgctactttggatggccatgacgggctgga60gctgccttgt70<210>61<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>61ctgtccaatcaggtaggctgggcctgaactagccaatcagatcaactctgtcttgggcgt60ttgaactca69<210>62<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>62tgcattgcctgcggtcaaggccagcaaggtggagtggatgcctcagaacggacgagataa60tgtgaacta69<210>63<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>63ctgccacaccagtcacatgacctgatcactagcctgtcatccttggtctttgtatcttcc60atatttggaa70<210>64<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>64gagatgtatgattcaaacatagatgactggattcctgttccagaattgagaactaaccgt60tgtaatgcag70<210>65<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>65gcacttgaaagagtccccatgcacttggagtccatgagccaatgggatatgcaaagacgc60ttaaacatt69<210>66<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>66aggtctgagttgttaccccaagcgccctggcccccacatggtgatgttgacatcactggc60atggtggttg70<210>67<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>67tttgtcctggatgacctccgccgctattctgtggacctacgctacacagtctttcagacc60acaggctccg70<210>68<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>68aaaagcaagtacaagatcctggatgccacggatcaggaaagcctggagctgaagccaacc60tcccgagcag70<210>69<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>69gttctgcattaacccctgcctcatgtctgtaacatgtgacagtaattccagctcggtccc60tccaggcaa69<210>70<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>70cgggggtgggagggccattttgtcactttgcctcagttgagcatctaggaagtattaaaa60ctgtgaagc69<210>71<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>71gcataatagttgatgccaaaggagatggtgacgtcccttccactgtagttgctgtcacaa60ccttgacgt69<210>72<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>72tctggtagaaaggcctaacccattacaccagaagaccatgggtgaagtctagatggggag60gagaagtgag70<210>73<211>69<212>DNA<213>人(H.sapians)<400>73ctcagaggctatagctgggaacccgactgtgaaagtatgtgatatctgaacacatactag60aaagctctg69<210>74<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>74aagggctataccagtgacttgaactatgattcagaacctgtgcccccacctcccacaccc60cgaagccaa69<210>75<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>75tgccagagctctcctacagagatgtggtgcaattgctgaacaaaccccgattttgttgtt60gttcctcct69<210>76<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>76cctgggtctgacccgagatctaatctctgtgctctgtgtattggcgacgagcagggtgag60aataagtgc69<210>77<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>77ctttctggatcccacagtgtatgggagcccctgactcctcacgtgcctgatctgtgccct60tggtcccag69<210>78<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>78gagcctccaactgctctttcaacggaccagggcctggtgcagtggctacaggaactgaat60gtggattca69<210>79<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>79ctgtggcaggccattcccagcgtccccgactgtgaccacttgctcagtgtgcctctcacc60tgcctcagtt70<210>80<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>80actctttactgggttaccaggttcatacattgctgaggacctgacaggacaacctagggg60cagggctggg70<210>81<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>81tcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggc60gattctctg69<210>82.<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>82caggcaatattggaaggtaatttcacctgagtctcagggaaccacgaagggatatggcaa60tgagtagagc70<210>83<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>83cccaaattctccttatccaccattcacatacgactgacggccaaaggattgcttcgaaac60cttcgacttc70<210>84<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>84cccggaggcggtgggcctggttaaataaggcagggtttatatgcactttcttccgatctg60tacctgagag70<210>85<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>85agtatatcttgaagcagcagcaggaggaggctgagaagcctttacaggtggccgctgtag60acagcagtgt70<210>86<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>86ccgctgtctctggaagtaaaagagccttgtctgaccttaatgcaagcagtctgtttgaac60ccctgtaggc70<210>87<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>87cgagaagagcatcagtgatgtcacgtttggagcaggggtcagttacatcgggacaccacg60gactccgtc69<210>88<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>88atgccttccggctgagtcctgctccttccaaaacacttatggacaactatgaggtctctg60ggggtacag69<210>89<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>89agtacagtctgtcagccagaataaaagctacttggccgtaaggctaaaagaccaagatct60gagagattc69<210>90<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>90agccatgattagacgttgactgcatctccctgatagaccaatcagctgtgtcgcacttaa60actggagaag70<210>91<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>91aggattatattcaaaagttcgatctcgatatagtttcatacaggctcttgtcagacgtat60ccgtggcctc70<210>92<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>92acgtttagcatctggtgaaattacacaggatgacttccttgttgttgtgcatcaaattcg60acagctattt70<210>93<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>93caaagccatttttgagaacacgctgagcacctacccaaagcgcacagatgtctggtcggt60ctatatcga69<210>94<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>94gctctgtcaacagactcaatagaaagactcccagtgtataacaaagctgcctggaagcat60tacaacacca⑴<210>95<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>95tgaatttagcctctgaaccccaggaggtcctgcacataggaagcgcccacaaccgaagtg60ccatgccct69<210>96<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>96tgatttcaaagggatgtcctcagtgtctgacatctttcactacaagtatttctaacagtt60gcaaggaca69<210>97<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>97acactgccccaccccgagaaccctcagctctcaaaggtcactcctgggagtttcttcttc60ccaatggaa69<210>98<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>98ctgcttcggtgtgattcttggagcaaatacccggccagacttggatctccgagaccccat60ctgtgatga69<210>99<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>99ttctagtgtttttgccgaagattaccgctggcctactgtgaagggagatgacctgtgatt60agactgggcg70<210>100<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>100acattttgccaaaaagggccactgtcgatatgaggacctctgtgccttctaccatccagg60cgtcaatgga70<210>101<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>101tgtagcacgaataggggtgtggttcatggcgtgttgacccagcagagcactccctcccac60taacttgtt69<210>102<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>102tctgtcctggctctgcacctggtatatgggtcatggaccagatggggctttccctttgta60gccatccaa69<210>103<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>103ggcagaaatagtgaagtacccggaagaagaaaatcaacataccacctctactcagagtag60aatctgttca70<210>104<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>104cccatccacagttgtcagttgtgaagaggggccagatgacaccctaaagcaggctgatcg60ggcaatggga70<210>105<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>105ggaccaggaagcatcacccaggagatttggcgcccacttccacctcttctctcagttttg60gacaagtga69<210>106<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>106attaagccctaaggtcctaaggcatctatctgtgctaggttaaatggttggcccccaaag60atagacagg69<210>107<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>107gaatgcagtgtactgttgtggagtcttcccgctatctagttccaaaatttcatcacccca60aatggaaatc70<210>108<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>108cagaaagtattaaggctttaggtagatgcaactggcgaaccttggagagggaatgctgat60tgtcttgac69<210>109<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>109gaagctgttcggcctcctttctagcccgctttccagcctcgcaaggttcttctctcacct60[1023]tctccggcga70[1024]<210>110<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>110ggaggagttgctgtgggcacttgtgcggatatggcaattcacccatttggttctatgatt60attgggagca70<210>111<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>111ttgtctccagctctgcatatgtctggccagggggcttctaggaagtaggtttcatctatc60aaatgtctc69<210>112<211>69<212>DNA<213>A(H.sapiens)<400>112actctggagttgaggtgcgagttacaccaaccaggacagaaatcattatcttagccacca60gaacacaga69<210>113<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>113aaagagcggaccttctccttctgtggcaccatcgagtacatggcccccgaaatcatccgt60agcaagacgg70<210>114<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>114agggaggaataccgaggcttcacacaggacttcaaggagaaggacggctacaaacccgac60gttaagatc69<210>115<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)[1063]<400>115tcattctgctctctcttggcacccgacccttggcagcatgtaccacacagccaagctgag60actgtggcaa70<210>116[1067]<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>116tttctttcaataaaagtggcggtggtggagacatccaccagggcttccagtctcttctca60ccgaagtgaa70<210>117<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>117aatgtgttaagagactgaaaataccagccatcagaaactggcctttctgccaataaagtt60gcatggtaaa70<210>118<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>118gatgcctcactactagatgcagtgctgggaccttcctcttttggagctgtcccatgtaca60gtggaccca69<210>119<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>119ccagtgttacgttttcacattgtctgtctcccaccctcactgatcacgcctgccccagag60cagtgtgtg69<210>120<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>120getccggatttaagccatttaagggtggacctccgcgacgattctgaaaatgagctctct60gccaaggtt69<210>121[1102]<211>69[1103]<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>121tggagatctttgctaaagttgaacaatcccggtactgtaccatatcagtcctttgtgggt60agtaggtag69<210>122<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>122tgtgctatagattttgagatctccggagattttgctagtggcgattttcatgaatggact60gatgatgag69<210>123<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>123tgatagtgtggtttatggactgaggtcaaaatctaagaagtttcgcagacctgacatcca60gtaccctga69<210>124<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>124gacagtcgacagggaccgccctcttgtcaggacaactgcctgctgctagggtctgttgcc60aaggtcaac69<210>125<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>125ggccctcctgcctctgtcatggcctcatcagtttcctggggttcttgctgctgttggtca60ccttccccat70<210>126<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>126[1141]gggtgggctgggctgaggccattgccgccactatctgtgtaataaaatccgtgagcacga60ggtgggacgt70<210>127<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>127tagtatcttgagattcacctggtctggaattatgtcataggctactatgcatcagaatca60catggaggg69<210>128<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>128ttttcaaaacgaactgactcagttcagcagaccaccagtaccagactcagaattgtgata60gaggagcat69<210>129<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>129gtgcaatgctggcctgtggtggtctgtgtaatgctttaacttgtatggaggaggccaggc60tcagagctg69<210>130<211>70<212>DNA<213>A(H.sapiens)<400>130agaatttggagggctaaacaactgggactctggagagtctgtgtcctaataatgcctgct60ttggagcact70<210>131<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>131ctgcactgtttctctctgcagacctaggggaaaactgcaggtggaagtgcttttctacta60aggcctctt69<210>132<211>69.[1180]<212>DNA[1181]<213>人(H.sapiens)<400>132agctgctggtggatcagatatacgagaacgccatgattgctgctggacttgttgacgacc60ctagggcca69<210>133<211>60<212>DNA<213>Λ(H.sapiens)<400>133atccaattctcacacacctgtgagacccccaagtacttctagtactggcagtcgaggcag60<210>134<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>134gggcatgtgtttcatcgggaagaggaattttgaacatttccttcttcagtatctgcagcc60tcgacctgg69<210>135<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>135agatctgggcgattctgagccatgccatttttaccttatgtctgctagaaagtgttgtag60ttgattgacc70<210>136<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>136actgacgtagcactggaattcccaagacccactctgcctaatgttgtttatgtaggagga60atcctaacc69<210>137<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>137cacgaggattcctgtggcatcaggtgctgctgtacctggtgtaggagcctaatcattgaa60ccattgtgt69[1219]<210>138<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>138catcgatatacaaaactctcttaccgggtagtttttcctttagaacttcgtctgtttaac60acttcaggtg70<210>139<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>139ttatgcctgcaattaggcattggtcaggggtgaatggctcttttcacagagagtagccaa60ccagagacc69<210>140<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>140tgaatgtacccctcagccttctcagcatttccttatcccaagactagtgtgctttctgct60acactgcta69<210>141<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>141ccttagactgccaggcacagagtcgggtcgggatttgtcagccaagcctcggctccagct60ccgcaatctc70<210>142<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>142ttctgtttacgtaacctgcttagtattgacactctctaccaagagggtcttcctaagaag60agtgctgtc69<210>143<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens).[1258]<400>143ctcctctctggtgggtggtggcatttaaggttcaaaccagccagaagtgctggtgctgtt60taaaaagtc69<210>144<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>144gctcccaacctggagcctccactcccagaagaggaaaaggagggcagcgacctgagacca60gtggtcatcg70<210>145<211>70<212>DNA<213>A(H.sapiens)<400>145tattatcctatgtgggagcacaggaaagagccctggaccatagaaagccaagtacgagta60gcaagaaaac70<210>146<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>146gggagcgcgtgcagggaggggcttgatctccacattttctcaggagtagttcgggcatcc60ccatatctt69.权利要求一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的基因检测探针，其特征在于，所述探针共有146个，其特异寡核苷酸序列如下2.如权利要求1所述的用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，其特征在于，所述的基质为玻璃基片。3.权利要求1所述基因芯片的制作方法，其特征在于，具体步骤为第一步用寡核苷酸合成仪制备探针；第二步使用基因芯片点样仪将合成好的探针点在玻璃基片上，制成基因芯片。4.权利要求1所述基因芯片的使用方法，其特征在于，具体步骤为第一步对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIZOI法进行总RNA抽提将患者切除的肝癌组织和癌旁组织与TRIzoI试剂按比例50-100毫克1ml混合，用勻浆器勻浆；将勻浆液在室温下孵育5分钟，按10.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2-3分钟；于12000Xg、4°C条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每ImlTRIzol试剂加入0.5ml的比例加入异丙醇，混勻，15_30°C下静置10分钟，于12000Xg、4°C条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照ImlTRIzol试剂加入Iml的比例加入75%乙醇，振荡混勻；于7500Xg、4°C条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5-10分钟；用DEPC处理过的水重新溶解RNA；取1μ1RNA溶液用199μ1ρΗ7.4的TE缓冲液稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度；第二步采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测将IOXMOPS缓冲液IOmUO.1%DEPC水70ml、37%甲醛20ml与RNA琼脂糖1.Og混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用DEPC处理过的水将IOXMOPS缓冲液稀释成IXMOPS缓冲液配制电泳缓冲液；将RNA样品5.5μ1、10XMOPS缓冲液1.0μ1、37%甲醛3.5μ1以及去离子甲酰胺ΙΟ.Ομ1混合，配成电泳样品，65°C孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μ11OXRNA加样缓冲液以及0.1ulΕΒ，混合均勻后加入上样孔内，电压100V条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；第三步将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA；分别用MicroconYM-30离心柱对cDNA进行纯化(5)将组织总RNA、浓度为2μg/μ1OligodT20-mer以及DEPC处理过的水按比例40yg2μ123μ1混合，总体积为25μ1，65°C孵育5分钟，冷却至室温得到RNA样品混合液；配制20XdNTP混合液，所述混合液中含有IOmMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP，4mMdTTP以及6mM氨基修饰的dUTP；将5XRTbuffer10μ1、20XdNTP混合液2.5μ1、0.IMDTT5μ1、superRNaseIN1μ1以及DEPCtreatedwater4.5μ1混合得到逆转录反应混合液；将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合，加入2μ1浓度为200υ/μ1的逆转录酶SuperscriptII，42°C孵育60分钟，70°C孵育5分钟，短暂离心，加入2μ1浓度为2U/μ1的RNA酶H，370C孵育30分钟；加入0.5μ1浓度为0.5ΜEDTA终止反应，加入10μIQuickcleanenzymeremoveresin，振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟；收集滤液，加入5.5μ13Μ醋酸钠溶液，137.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，_20°C放置1小时，使cDNA沉淀；4°C以14000转/分的速度离心15分钟；弃上清，用500μ170%的乙醇洗涤沉淀两次；37°C孵育4-6分钟；用20μ10.IM碳酸氢钠溶液重新溶解cDNA；(6)用10μ1去离子蒸溜水将MonoreactiveCy3Dye和MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暂离心备用；取2ul染料溶液加入用碳酸氢钠溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混勻，用MonoreactiveCy5Dye标记肿瘤组织cDNA，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA；室温下于暗处放置1小时，每20分钟振荡混勻一次，使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA；(7)在标记过的cDNA混合液中加入2.5μ13Μ醋酸钠溶液，62.5μ1冰预冷的100%乙醇，振荡混勻，-20°C放置1小时，使标记后的cDNA沉淀；4°C以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底；吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗涤沉淀；37°C孵育4_6分钟；用80μ1TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织cDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均勻；加入550μ1的PB缓冲液，混合均勻；将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟，弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μ1的PE缓冲液，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；弃过滤液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇；在纯化过滤离心柱中加入50μ1的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA；(8)在MicroconYM-30离心柱中加入400μ1pH7.4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱；将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心8-10分钟，至液体剩余体积为20-40μ1；加入400μ1pH7.4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心8-10分钟洗涤cDNA，重复3_4次；最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μ1，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA；加入pH7.4的TE缓冲液使体积为17μ1；第四步将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交按下列比例配制预杂交缓冲液20XSSC15ml,10%SDS0.6mlU0%BSA6ml以及去离子蒸馏水38.4ml；将预杂交液倒入预杂交槽中，于42°C水浴箱内预热10分钟；将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上；用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟；将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟；于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥；将芯片置芯片盒内保存；将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交1-3小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；第五步基因芯片杂交将去离子甲酰胺250μ1、20XSSC250μ1以及10%SDSlOy1混合配制2ΧF-杂交缓冲液；震荡摇勻后42°c保存；将1μ1浓度为ομg/μ1的HumanCOT-IDNAUμ1浓度为8-10μg/μ1的polyA及1μ1浓度为4μg/μ1的yeasttRNA加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μ1；震荡混勻、短暂离心，将杂交样品置100°C加热器中变性2分钟，置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42°C加热器内5分钟；加入20μ1的2ΧF-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均勻，短暂离心，最后总体积为40μ1；将杂交样品加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内；将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μ1双蒸水；盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42°C水浴箱内孵育过夜；第六步杂交后芯片的洗涤和扫描分析将杂交芯片浸入含有IXSSC及0.1%SDS的洗涤液中，洗涤芯片2分钟；在IXSSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2XSSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2XSSC洗涤液中洗涤1分钟；在0.05XSSC洗涤液中洗涤30秒；于700rpm离心芯片5分钟；用GenePix4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。全文摘要本发明的技术方案是提供一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的探针，所述探针由149个基因组成。本发明的优点是采用基因组比较研究，经大样本量独立验证，证明该预测模型可对肝癌患者转移潜能进行准确预测和评估，从而可对患者术后生存和转移、复发进行准确预测(即使早期肝癌患者也可进行准确预测)，将有助于早期识别或预测高危患者，对其进行重点监测和有效干预，从而进一步延长肿瘤病人生存。文档编号C12Q1/68GK101812507SQ20091019995公开日2010年8月25日申请日期2009年12月4日优先权日2009年12月4日发明者叶青海,汤钊猷,贾户亮,钦伦秀申请人:复旦大学附属中山医院