专利名称：：miRNA在预测早期原发性肝癌病人术后复发的应用及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发的试剂盒，属于生物医学诊断领域。
背景技术：
：肝癌是我国第二大癌症死因，根治性手术是目前主要治疗手段。部分肝癌病人因早期发现、早期诊断、早期综合治疗而获得长期生存。然而肝癌根治性切除后5年转移复发率为61.5%，即使小肝癌也达43.5%，肝癌转移复发已成为进一步提高肝癌治疗效果的最主要障碍。若能对肝癌早期患者术后进行转移复发的预测，及时给予干预治疗，有利于提高患者生存率，具有一定的社会效益和经济效益。目前临床尚无足够敏感和特异的预测指标来预测肝癌患者术后转移复发的情况，甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等虽与转移复发有关但总体来说其预测准确率还很低。近年来研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)作为一类新型调节因子在肿瘤的发生发展中起重要作用。应用基因芯片或实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术对raiRNA表达谱研究发现miRNAs可有助于多种癌症的分型和预后判断。肿瘤及其转移特异相关的miRNAs的鉴定和其表达阈值的确定属于肿瘤分子标记物预测诊断的应用范畴。早期肝癌病人如能对其术后复发情况进行早诊预测，采取适当的干预治疗，将十分有利于改善其预后生存。
发明内容本发明的目的是提供一种试剂盒，用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发的试剂盒，其特征在于，由反转录系统、扩增系统和引物探针系统组成，其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，引物探针系统由has-miR-34a茎环结构引物、has-miR-34a扩增引物、has-miR-34a荧光标记探针、RNU6B茎环结构引物、RNU6B扩增引物和RNU6B荧光标记探针组成。本发明通过以下方法证明确定了has-miR-34a为早期原发性肝癌转移复发的分子标志物1、组织总RNA的抽提和纯化收集91例在复旦大学肝癌研究所进行肿瘤根治性切除手术原发性肝癌病人进行研究。将冰冻的肝癌及癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，应用Ambion公司mirVanaraiRNA分离试剂盒，提取组织中富含小分子RNA(《200bp)的总RNA。使用DU800紫外分光光度计测定RNA的A260值(波长为260纳米的吸光度值)和A260/A280的比值(1.9-2.1)，以评估其浓度和质量，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。符合定量检测要求的样本置于-8(TC保存备用。2、has-miR-34ac腿的合成将0.15ti1lOOraM脱氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，1.00y150U/uL反转录酶，1.50ul10X反转录体系缓冲液，0.19ul20U/iiLRNA酶抑制剂，4.16"1无核酸酶水，3.00u1miRNA茎环结构引物，和组织样本模板RNA5.00u1(总量为50ng)充分混合均匀，冰上孵育5分钟。miRNA反转录反应程序如下16°C，30分钟；42°C，30分钟；85°C，5分钟。所用试剂组分来源于TaqMa，MicroRNA反转录试剂盒(AppliedBiosystems公司，USA)。3、has-miR-34a实时定量PCR的检测将L00iilhas-miR-34a20X扩增引物和TaqmanMGB(MinorGrooveBinder,一种非荧光淬灭基团)标记探针，与10.OOul基因表达定量检测混合液(TaqMar^Geneexpressionmastermix,AppliedBiosystems公司，USA)混合，力口入l:100稀释的反转录产物9ul。miRNA实时定量PCR反应程序如下95。C,10分钟；95。C15秒；60°C,60秒(40个循环)。实验选取RNU6B为内参，RNU6B的检测使用与hasiiR-34a相同的反转录和定量PCR反应体系以及RNU6B的引物和探针系统。4、has-miR-34a在早期原发性肝癌病人术后复发情况分析通过2-AACt法计算has-miR-34a在肿瘤及瘤旁组织中的表达量，并计算两者的比值(表示该小分子在病人机体内的动态差异)。如图1所示，为has-miR-34a在三年内复发与未复发的早期原发性肝癌病人中的相对表达水平，两独立样本非参数检验发现，术后三年内复发的病人其has-miR-34a上调表达水平明显高于术后未复发的病人(/M).023)。接受者操作特性曲线(ROC曲线)分析获得阈值为1.27，高于1.27的病人定为高水平表达，低于1.27的病人定为低水平表达。高水平病人明显复发率升高(f0.003)。如图2所示，a线为has-miR-34a对早期原发性肝癌病人复发预测情况(代O.05)，曲线下面积为0.661，b线为参考线，检测灵敏度(复发组高表达率)为79.8%。Kaplan-Meier生存和复发分析如图3所示，为hasiiR-34a的无瘤生存曲线(/M).0Q3)，其中a线为高表达组，b线为低表达组，has-miR-34a上调表达与病人总生存情况无关(卢0.324)，而与复发(无瘤生存)密切相关(ZM).003)。Cox风险比例模型多因素分析表明has-miR-34a是术后无瘤生存(术后复发)差的独立相关因子(尸=0.008，HR(HazardRatios,危险度)=3.25,95%C.I(ConfidenceInterval,可信区间)=1.37-7.7。与性别，有无包膜，及AFP(甲胎蛋白)指数无关。Cox比例风险模型(多因素)分析has-miR-34a术后复发关系见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明首次选取肿瘤、淋巴结、转移分期系统(T醒)I期早期原发性肝癌病人为研究对象，这类早期病人如能进行术后复发情况的预测，将有助于术后治疗方案的确定，改善病人预后状况；首次通过miRNA实时定量聚合酶链式反应(PCR)的方法在肝癌中对has-miR-34a的表达水平进行检测，进一步验证has-miR-34a与早期原发性肝癌的复发转移的关联性，并与临床随访相结合，为肝癌转移复发、预后预测提供可信的分子标志物；所提供的试剂盒及其步骤专门针对于肝组织miRNA的检测优化，结果准确可靠。本发明的优点为(1)本发明确定的miRNA与肝癌转移复发有密切的关系，能够作为生物指标对早期肝癌病人术后复发进行预测，为临床个体化干预治疗提供有效的依据。(2)通过实时定量PCR技术对原发性肝癌病人的组织水平miRNA的检测，定量准确。相对于芯片技术或者分子杂交(NorthernBlot)，该方法简便、快速且经济实用。(3)可能与其他分子指标相结合，为原发性肝癌复发诊断、预后预测提供新的综合性试剂盒，方便于临床应用。图1为has-miR-34a在三年内复发与未复发的早期原发性肝癌病人中的表达情况图；图2为hasiiR-34a对早期原发性肝癌病人复发预测情况图；图3为has-miR-34a的无瘤生存曲线图。具体实施例方式实施例l一种用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发的试剂盒，由反转录系统、扩增系统和引物探针系统组成，其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，引物探针系统由has-miR-34a茎环结构引物、has-miR-34a扩增引物、has-miR-34a荧光标记探针、RNU6B茎环结构引物、RNU6B扩增弓i物和RNU6B荧光标记探针组成。应用该试剂盒来预测早期原发性肝癌病人手术后肝癌复发情况的具体方法如下1、组织总RNA的抽提将早期原发性肝癌病人进行手术后保存的肝癌及癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，应用Ambion公司mirVanaTMmiRNA分离试剂盒，提取组织中富含小分子RNA(《200bp)的总RNA。使用DU800紫外分光光度计测定RNA的A260值和A260/A280的比值，以评估其浓度和质量，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。2、has-miR-34acDNA的合成将0.15ullOOmM脱氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，1.00yl50U/uL反转录酶，L50ul10X反转录体系缓冲液，0.19ul20U/uLRNA酶抑制剂，4.16ixl无核酸酶水，3.00u1has-miRNA-34a茎环结构引物，和模板RNA5.00"1(总量为50ng)充分混合均匀，冰上孵育5分钟。miRNA反转录反应程序如下16°C，30分钟；42°C，30分钟；85°C，5分钟。所用试剂组分来源于TaqManMicroRNA反转录试剂盒(AppliedBiosystem公司，USA)3、has-miR-34a实时定量PCR的检测将1.OOii1has-miRNA-34a(20X)扩增引物和TaqmanMGB(MinorGrooveBinder,一种非荧光淬灭基团)标记探针，与10.00u1含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液(TaqManGeneexpressionmastermix,AppliedBiosystems公司,USA)混合，力口入1:100稀释的反转录产物9u1。miRNA实时定量PCR反应程序如下95°C,10分钟；95°C15秒；60°C，60秒(40个循环)。实验选取RNU6B为内参。RNU6B的检测使用与has-miR-34a相同的反转录和定量PCR反应体系以及RNU6B的引物和探针系统。4、has-miR-34a在早期原发性肝癌病人术后复发预测分析通过2-AACt法计算has-miR-34a在肿瘤及瘤旁组织中的表达量，并计算两者的比值(表示该小分子在病人机体内的动态差异)。高于1.27的病人定为高水平表达，低于1.27的病人定为低水平表达。通过该比值判断病人术后三年内发生肝癌复发的风险。观测该小分子表达变化趋势，如果低水平表达则提示患者复发风险相对低，辅助治疗应适量进行。高水平病人提示二年内复发风险偏高，术后需加强监测，适当加以辅助治疗。权利要求1.一种用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发的试剂盒，其特征在于，由反转录系统、扩增系统和引物探针系统组成，其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，引物探针系统由has-miR-34a茎环结构引物、has-miR-34a扩增引物、has-miR-34a荧光标记探针、RNU6B茎环结构引物、RNU6B扩增引物和RNU6B荧光标记探针组成。全文摘要本发明提供了一种用于预测早期原发性肝癌病人术后肝癌复发的试剂盒，包括反转录系统、扩增系统和引物探针系统，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，引物探针系统包含has-miR-34a茎环结构引物、has-miR-34a扩增引物和荧光标记探针以及RNU6B茎环结构引物、RNU6B扩增引物和荧光标记探针。本发明检测定量准确，简便、快速且经济实用，且可进一步与其他分子指标相结合，为早期原发性肝癌复发诊断、预后预测提供综合性分子标记试剂盒，方便于临床应用。文档编号C12Q1/68GK101418343SQ20081020436公开日2009年4月29日申请日期2008年12月10日优先权日2008年12月10日发明者周海军,董琼珠,贾户亮,越赵,钦伦秀申请人:复旦大学附属中山医院;复旦大学生物医学研究院