专利名称：一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法
技术领域：
本发明涉及一种医学检测方法。
甲胎蛋白(AFP)检测是用于肝癌早期诊断的首要方法，甲胎蛋白异质体的检测是目前用于区分肝癌和非癌所产生的甲胎蛋白的唯一方法。在第四届全国肝癌学术交流会上，已作为原发性肝癌的诊断标准，推荐给医师使用。崔贞福等(中华医学检验杂志，1986，9(3)154-155)介绍了亲和交叉免疫电泳自显影法检测甲胎蛋白糖链异质体。关赛芳等(肿瘤，1990，10(1)38-39)介绍了Western免疫酶标印迹法鉴别异源性AFP分子变异体。韩玲，等(上海免疫学杂志，1993，13(4)227-228)介绍了人甲胎蛋白异质体直接固相时间分辨荧光免疫测定。目前使用的检测方法，主要存在的问题是1)检测花费时间多，需要3天才能出结果。
2)需要使用放射性同位素，因此无论在试剂制备(125-碘标记抗甲胎蛋白抗体)，还是在医院使用，都存在同位素污染的问题。
3)在制备含凝聚素的琼脂糖胶时，质量不容易控制；因为凝聚素是一种植物蛋白，对热敏感，而琼脂糖胶在50℃以下，就会凝固。因此，制备时要在不低于56℃时加入凝聚素，质量不容易控制。此外，受不同批号的凝聚素、琼脂糖和聚合度的影响，使检验结果不稳定。
4)检验结果是通过放射自显影来获得，需要胶片冲洗设备。曝光不足或显影不良都会影响结果。
5)由于琼脂糖胶的保存问题难以解决，故试剂标准化问题难以解决，无法进行工业化生产。
本发明的目的在于提供一种不存在放射性污染、不需要专门设备、有利于标准化、便于医院检验结果质量控制、检测快速的用于检测甲胎蛋白异质体的方法。
用于检测甲胎蛋白异质体的方法是1)将醋酸纤维素膜条带的两端浸泡于巴比妥缓冲液中，取出后吸干。
2)取待检血清1～2μL与1～5mg/mL的植物凝聚素1～10μL预先混合，在室温下放置待用。
3)将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在其另一端滴加标记抗甲胎蛋白抗体，再吹干。
4)将加好待测样品的醋酸纤维素膜放在电泳槽上，加入电泳缓冲液，并通电电泳。
5)电泳后取下醋酸纤维素膜，用生理盐水浸泡洗涤，洗去未结合的物质，吸干后观察结果若为甲胎蛋白异质体阳性的肝癌血清，则有2条带，而其他甲胎蛋白阳性的肝病病人血清，则仅有1条带；不产生甲胎蛋白的肝病病人，则不出现条带。
在已有技术中，是将凝聚素加入到琼脂糖胶中，使其在电泳过程中完成甲胎蛋白异质体与植物凝聚素的结合，从而达到区分的目的。而本发明的技术关键是血清与植物凝聚素预先混合，让甲胎蛋白异质体与植物凝聚素预先结合，再用电泳分离此结合物。因此本发明从根本上克服我们在背景技术部分所指出的困难，其主要优点是1)可以快速检测，一小时可获得结果。
2)若使用了荧光素标记物，不存在放射性污染，同时也就不需要放射自显影，节省了胶片和冲洗设备，医院减少了设备投资，可通过紫外灯(如验钞仪)直接观察，降低了检验费用。
3)由于通过免疫电泳方法浓缩荧光素标记物，不需要专门设备(用荧光显微镜或荧光分光光度计检测荧光)，使基层医院都可以使用，有利于肝癌的早期检测和早期诊断。
4)通过检测试剂标准化生产，有利于对各医院的检验结果的比较，使医院检验结果质量控制得以实现。
5)节省植物凝聚素，因为植物凝聚素是价格昂贵的制品，每克高达1800元，因此可降低试剂成本。
6)由于采用预先混合凝聚素的方法，就没有必要用琼脂糖胶分离甲胎蛋白异质体，可以用醋酸纤维素膜代替琼脂糖，从而降低成本。
7)不需要制备琼脂糖，解决了试剂的保存问题(以往都是临时制备)，因此有利于甲胎蛋白异质体检测方法标准化，可以进行大规模的工业化生产。
实施例1为了进行甲胎蛋白异质体的快速检测，需先准备有关试剂和材料1)巴比妥缓冲液，PH8.6，用于电泳，巴比妥钠10.3g，0.25N HCl 38.2mL，NaN30.1g，加无离子水至1000mL；2)醋酸纤维素膜；3)标记抗甲胎蛋白抗体；4)植物凝聚素；5)电泳仪和平板电泳槽。以下给出具体方法1)将8cm×10cm醋酸纤维素膜用铅笔划成1cm宽的条带，并在两端各1cm处划线，浸入巴比妥缓冲液中浸泡后取出，用滤纸吸干。
2)取待检血清3μL，与2mg/mL的伴刀豆凝聚素ConA 1μL混合，室温下放置待用。
3)将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在另一端滴加荧光素标记抗甲胎蛋白抗体5μL，用电吹风吹干。
4)将加好待测样品的醋酸纤维素膜放到电泳槽上，其中血清端为阴极，荧光素标记抗甲胎蛋白抗体端为阳极，用滤纸作电极桥，按15～20V/cm调整电压，通电电泳25～30min。
5)电泳结束后，关闭电源，取下醋酸纤维素膜，用生理盐水浸泡洗涤，洗去未结合的物质，取出后用滤纸吸干，置于紫外灯下观察。
6)结果甲胎蛋白异质体阳性的肝癌血清有二条带，而其它甲胎蛋白阳性的肝病病人血清，仅有一条带；甲胎蛋白阴性的病人不出现条带。
实施例2将8cm×12cm醋酸纤维素膜用铅笔划成1.2cm宽的条带，并在两端各1.2cm处划线，浸入巴比妥缓冲液中浸泡后取出，用滤纸吸干。取待检血清15～2μL，与4～5mg/mL的植物凝聚素ConA 8～10μL混合，室温下放置待用，将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在另一端滴加常和的酶联免疫标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶1～5μL，用电吹风吹干。将加好待测样品的醋酸纤维素膜放到电泳槽上，按10～15V/cm调整电压，通电电泳45～60min。电泳结束后，取下醋酸纤维素膜，用生理盐水浸泡洗涤，取出后吸干再观察。可通过酶底物系统显色。
实施例3将长为8cm的醋酸纤维素膜处理后浸入巴比妥缓冲液中，取待检血清1～2μL，与3～4mg/mL的小豌豆凝聚素2～4μL混合，室温下放置待用。将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在另一端滴加常用的酶联免疫标记物如酸性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，D-半乳糖苷酶或生物素等标记抗甲胎蛋白抗体1～5μL，用电吹风吹干，也可以用小滤纸条滴加血清或抗体后放到上面。将加好待测样品的醋酸纤维素膜放到电泳槽上，按2～5V/cm调整电压，通电电泳20～25min，电泳后的做法与实施例2相同。
实施例4将10cm×14cm醋酸纤维素膜划成1cm宽的条带，并在两端划线，浸入巴比妥缓冲液中浸泡后取出吸干。取待检血清5～10μL，与2～3mg/mL的小扁豆凝聚素5～7μL混合，室温下放置待用，将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在另一端滴加荧光素标记抗甲胎蛋白抗体1～5μL，吹干，也可用小滤纸条滴加血清或抗体后放到上面。将加好待测样品的醋酸纤维素膜放到电泳槽上，按6～10V/cm调整电压，通电电泳35～40min，电泳结束后取下醋酸纤维素膜，用生理盐水浸泡洗涤，取出后吸干置于紫外灯下观察，即可得出结果，不需进行底物显色。
用荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体是用荧光素取代125-碘标记的抗甲胎蛋白抗体，常用荧光素如异硫氰酸荧光素(FITC)、二氯三嗪基氨基荧光素(DTAF)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)等。制备荧光素标记的甲胎蛋白抗体的方法以荧光素FITC为例说明如下取30mL的抗甲胎蛋白抗体溶液，配制3mg(相不于甲胎蛋白抗体蛋白量为1/100)的FITC，将FITC缓慢滴加入抗体溶液中，注意测定溶液的PH保持在9.0～9.5。荧光素加毕，将反应物移入冰箱搅拌。将标记溶液装入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0.01mol/L PH7.2磷酸缓冲液(PBS)中，在冰箱中继续透析。用葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25(或G-50)柱(1.2×30cm)，在0.01mol/L PH7.2磷酸缓冲液(PBS)平衡后，加入透析液，用相同的PBS溶液洗脱，收集第一着色峰，即为所需的产物。
权利要求
1.一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于1)将醋酸纤维素膜条带的两端浸泡于巴比妥缓冲液中，取出后吸干；2)取待检血清1～20μL与1～5mg/mL的植物凝聚素1～10μL预先混合，在室温下放置待用；3)将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端，在另一端滴加标记抗甲胎蛋白抗体，再吹干；4)将加好待测样品的醋酸纤维素膜放在电泳槽上，并通电电泳；5)电泳后取下醋酸纤维素膜，用生理盐水浸泡洗涤，吸干后观察结果若为甲胎蛋白异质体阳性的肝癌血清，则有2条带；而其他甲胎蛋白阳性的肝病病人血清，则仅有1条带；甲胎蛋白阴性的病人不出现条带。
2.如权利要求1所述的一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于所说的待检血清为3μL-与2mg/mL的植物凝聚素1μL预先混合。
3.如权利要求1所述的一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于所说的植物凝聚素为伴刀豆凝聚素，小豌豆凝聚素或小扁豆凝聚素。
4.如权利要求1所述的一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于所说的抗甲胎蛋白抗体用酶联免疫标记物，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，D-半乳糖苷酶或生物素标记，电泳后用各自的酶底物显色。
5.如权利要求1所述的一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于所说的抗甲胎蛋白抗体用荧光素标记物，电泳后醋酸纤维素膜用紫外灯观察。
6.如权利要求3所述的一种用于检测甲胎蛋白异质体的方法，其特征在于所说的植物凝聚素用伴刀豆凝聚素ConA。
全文摘要
涉及一种医学检测法。检测甲胎蛋白异质体的方法是将醋酸纤维素膜条带两端浸泡于缓冲液中,后吸干,取待检血清与植物凝聚素预先混合,再将混合血清滴加到醋酸纤维素膜的一端,另一端加标记抗甲胎蛋白抗体,通电电泳,后观察结果。因血清与植物凝聚素预先混合,即让甲胎蛋白异质体与植物凝聚素预先结合,再用电泳分离此结合物,故检测快速,不需制备传统的琼脂糖,有利于标准化和工业化生产,不存在放射性污染,节省设备,降低成本。
文档编号G01N33/53GK1278065SQ0011937
公开日2000年12月27日 申请日期2000年7月13日 优先权日2000年7月13日
发明者廖绵初, 干侣仙 申请人:厦门大学