专利名称：中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法
技术领域：
本发明一种用于鉴别塞隆骨的引物及其鉴定方法，涉及中药材鉴定的技术领域。
中药品种繁多，产地广泛。出于历代本草记载、地区用药名称和使用习惯的不同，类同品、代用品和民间用药的不断出现，中药材的同名异物、品种混乱现象普遍存在，直接影响药材的质量。近年来，由于经济利益的驱使，药材伪、混品种的数量有增无减。为确保中药使用安全、有效，对各种中药材进行准确的鉴定十分重要。常用的药材鉴定方法有原植(动)物、性状、显微及理化鉴定，对于形态相似或破碎后失去原来形态，或粉末状药材，或化学成分类似的药材，特别是对于动物类药材，用上述4种方法有时很难甚至不能鉴别。随着现代分子生物学技术的迅速发展，分子遗传标记在医学、农学、动植物品种鉴定等领域中得到越来越广泛的应用。在药材鉴定领域，已建立了位点特异性鉴别聚合酶链反应(PCR)技术，成功地应用于金钱白花蛇、乌梢蛇、龟甲及哈蟆油等的鉴别。药学学报33(12):941-947；刘忠权，王义权，周开亚，等1999.中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究。药学学报34(12):941-945；杨学干，王义权，周开亚，等2000中药材哈蟆油PCR鉴定的初步研究。应用与环境生物学报6(2):166-170；Wang,Y.Q.,Zhou,K.Y.,Xu,L.S.et al.2000 Authentication of an animal crudedrug,Zaocys,by diagnostic PCR.Biol.Pharm.Bull 23(5):585-588.)但这种鉴别并不是对所有的中药材都有统一的方法和引物，对于各种不同的药材，其鉴别的方法、步骤、引物都不一样。
塞隆骨(高原鼢鼠骨)是北京同仁堂集团公司北京同仁堂药酒厂开发的新药材，以它为原料制造的塞隆风湿酒主治风塞湿痹引起的多种疾病。但采用性状、显微及理化等鉴定方法很难区别塞隆骨药材的直伪，急需一种采用分子遗传标记技术的新方法来解决这个难题。
本发明的目的是提供一种对塞隆骨药材能准确鉴别其真伪的中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法。
本发明设计的中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定引物DNA序列有2对第一对引物1-1:5’-gAAACAgCAgTgATAAAAATTAAgCC-3’引物1-2:5’-CTggCgggTAAATTTTgTTggAAATT-3’第二对引物2-1:5’-CATTCTCATCAgTAACCCATATTTgC-3’引物2-2:5’-ATTCATTCTACTAgggAggTTCCTACA-3’用全自动DNA合成仪按上述2对鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物白色粉末结晶。
中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定的方法为采用下列步骤对药材进行位点特异性PCR鉴别①药材DNA提取按常规进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl。
②鉴别PCR引物浓度用无离子水溶解调节至10pmol/μl。以反应体积均为30μl的剂量为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液2-5.5μlMgCl2(25mM) 1.8-2.6μldNTP(2mM) 1.5-2.4μl引物1-1和引物1-2或引物2-1和引物2-2各0.6-2.0μlTaqDNA聚合酶 1-2.0单位受试样品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl混匀后，瞬时离心③PCR循环于PCR仪上，95℃预变性4min，然后按下列参数进入30个循环变性96℃ 10-40秒复性65～72℃ 25-40秒延伸72℃ 1-20秒循环结束后在72℃保持2分钟补齐④电泳观察取出反应混合液5～10μl与载样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果。
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应的剂量的比例为参考点，相应的增加和减少。
如有阳性扩增，则受试样品为正品药材；如为阴性，即无扩增条带，或仅有引物的聚体，受试样品为非正品药材。
本发明的优点在于本发明解决动物中药材塞隆骨(高原鼢鼠骨)真伪鉴别难的问题。我们在对塞隆骨药材的DNA分子标记鉴别研究中，设计了用于鉴别塞隆骨真伪的2对高特异性引物，用每一对引物对药材中的DNA进行一次简单的聚合酶链反应(PCR)，都可准确地鉴定出受试药材的真伪。用这2对引物可以制造用于这种药材鉴定的试剂盒。本发明对于从事中药生产、销售的部门快速准确地鉴定这种药材，搞好原材料质量控制，是十分必要的，对于各地市药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场将是十分有效的。
本发明的实施方案如下
首先从各原动物样品中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，然后对各纯化后的基因片段进行DNA测序分析，建立塞隆骨药材及其伪、混品原动物的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA段，针对药材伪、混品出现的情况，分别设计塞隆骨的2对鉴定引物第一对引物1-1:5’-gAAACAgCAgTgATAAAAATTAAgCC-3’引物1-2:5’-CTggCgggTAAATTTTgTTggAAATT-3’第二对引物2-1:5’-CATTCTCATCAgTAACCCATATTTgC-3’引物2-2:5’-ATTCATTCTACTAgggAggTTCCTACA-3’用全自动DNA合成仪按上述2对鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物白色粉末结晶。
采用以上任何一对鉴定引物对中药材塞隆骨进行鉴定时，以总反应体积为30μl为例采用下列步骤对药材进行位点特异性PCR鉴别①药材DNA提取按常规进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl。
②鉴别PCR引物浓度用无离子水溶解调节10pmol/μl。以反应体积均为30μl的剂量为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 4μlMgCl2(25mM) 2.2μldNTP(2mM)2μl引物1或引物2 各1μlTaqDNA聚合酶 1单位受试样品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl混匀后，瞬时离心③PCR循环于PCR仪上，95℃预变性4min，然后按下列参数进入30个循环变性96％ 10-40秒复性65～72℃ 25-40秒延伸72℃ 1-20秒循环结束后在72℃保持2分钟补齐④电泳观察取出反应混合液5～10μl与载样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果。
每一对鉴定引物在给定的PCR条件下，只能特异性地扩增正品药材中该基因片段，而对任何非正品药材中提取的DNA均不能扩增出该基因片段。当受试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经凝胶电泳观察有无扩增条带的出现，便可准确地判定样品的真伪。
权利要求
1．一种中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定引物，其特征是按如下设定的DNA序列进行合成其中第一对引物1-1:5’-gAAACAgCAgTgATAAAAATTAAgCC-3’引物1-2:5’-CTggCgggTAAATTTTgTTggAAATT-3’第二对引物2-1:5’-CATTCTCATCAgTAACCCATATTTgC-3’引物2-2:5’-ATTCATTCTACTAgggAggTTCCTACA-3’用全自动DNA合成仪按上述2对鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物白色粉末结晶。
2．一种采用权利要求1所述的任何一对鉴定引物对中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定方法，其特征是采用下列步骤对药材进行位点特异性PCR鉴别①药材DNA提取按常规进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl。②鉴别PCR引物浓度用无离子水溶解调节至10pmol/μl。以反应体积均为30μl的剂量为参考点，各种物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 2-5.5μlMgCl2(25mM) 1.8-2.6μldNTP(2mM) 1.5-2.4μl引物1-1和引物1-2或引物2-1和引物2-2各0.6-2.0μlTaqDNA聚合酶 1-2.0单位受试样品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl混匀后，瞬时离心③PCR循环于PCR仪上，95℃预变性4min，然后按下列参数进入30个循环变性96℃ 10-40秒复性65～72℃ 25-40秒延伸72℃ 1-20秒循环结束后在72℃保持2分钟补齐④电泳观察取出反应混合液5～10μl与载样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果。
全文摘要
中药材塞隆骨聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法是一种专门用于鉴定中药材塞隆骨真伪的鉴定引物及其鉴定方法,引物的DNA序列为:第一对引物1—1:5’—gAAACAgCAgTg ATAAAAATTAAgCC—3’引物1—2:5’—CTggCgggTAAATTTTgTTggAAATT—3’第二对:引物2—1:5’—CATTCTCATCAgTAACCCATATTTgC－3’引物2—2:5’—ATTCATTCTACTA gggA ggTTCCTACA—3’鉴定的方法是:1.药材DNA的提取;2.鉴别PCR;3.PCR循环;4.电泳观察。如有阳性扩增,则受试样品为正品药材;如为阴性即无扩增条带,或仅有引物二聚体,则受试样品为非正品药材。
文档编号G01N33/15GK1305010SQ0011907
公开日2001年7月25日 申请日期2000年10月26日 优先权日2000年10月26日
发明者周开亚, 张绍来, 王义权, 尚颜文, 周材权, 何渭清 申请人:南京师范大学, 北京同仁堂股份有限公司同仁堂药酒厂