一种筛选公共引物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选公共引物的方法，具体为选择待扩增靶序列作为模板，设计一对特异引物与m条正向公共引物、n条反向公共引物，在特异引物的5'端分别连接公共引物、酶切位点和保护碱基组合成“长引物”，然后用“长引物”对模板进行PCR扩增，得到与公共引物序列同源的PCR产物，将这段模板序列导入质粒载体，通过转化将质粒转移进入大肠杆菌感受态细胞，获得公共引物的质粒模板；利用此质粒模板，通过排列组合可实现m×n对公共引物的敏感性筛选。因此，本发明可以达到高效筛选公共引物的目的，具有高效、快速和操作简单的优点。
【专利说明】一种筛选公共引物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学领域，具体涉及一种筛选公共引物的方法。
【背景技术】
[0002] 多重 PCR (multiplex polymerasechainreaction，MPCR)是在常规 PCR 基础上改 进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，即可以在一个反应体系中加入两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段。但是由于各种条件的限制(如引物之间二聚体概率增加、产物大小 难以区分等)，每个反应体系中能扩增的引物对数量是有限的。针对多重PCR的技术瓶颈， 现已有在多重引物5'端添加公共引物的方法改善其检测通量。"公共引物"即在每条多重 PCR引物的5'末端添加一段10-30个碱基的单链寡核苷酸片段，公共引物与扩增靶序列 的特异引物连接构成嵌合引物。在常用的多重PCR反应混合体系中（PCR反应液、Taq酶、 dNTP)，加入公共引物、嵌合引物、模板，进行PCR扩增。公共引物的使用降低了嵌合引物的 用量，减少了引物之间二聚体的形成，因此可提高多重PCR的检测通量。该多重PCR方法最 终是由公共引物进行大量扩增的，公共引物作为整个体系的核心技术，其质量好坏决定整 个多重PCR体系的成败，因此，公共引物的设计和选择对多重PCR体系至关重要。 目前引物的设计大都通过计算机程序进行，运用相应的软件和数据库，如Primer5. 0、 〇 I i go6、NCBI数据库等，遵循引物设计的基本原则和注意事项，经过b I as t比对分析确定引 物的碱基序列，然后进行合成和实验验证。但实验过程中，由于各种原因（如模板问题，引物 可行性、敏感性和特异性等)，理论合成的引物与实际操作的结果总会出现不符。
[0003] 目前，对于引物的分析，都要有明确的靶序列，才可以构建质粒模板进行检测分 析。公共引物的设计不依赖于靶序列，因此，现有的分析方法不适用于公共引物的筛选。同 时，在多重PCR反应中，公共引物贯穿整个实验，对整个PCR体系起决定作用，当建立"公共 引物"介导的多重PCR体系时，首先需要考虑公共引物的选择，一般不会轻易变动公共引物， 但如果实验过程中发现公共引物不合适，除了更换公共引物，还要考虑体系中其它特异引 物的调动，很容易"牵一发而动全身"，因此，对于公共引物，如果没有合适的筛选方法，既容 易耗费财力，又费时费力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种筛选公共引物的方法，由此可以高效、准确的选出适合 具体多重PCR扩增体系的公共引物。
[0005] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种筛选公共引物对的方法，包 括以下步骤： (1) 针对待扩增靶序列，设计1对特异引物以及m条正向公共引物和η条反向公共引 物;m+n 为 3~10 ; (2) 在特异引物对的正向引物序列的5'末端依次连接m条正向公共引物、酶切位点序 列、保护碱基序列，得到长引物对中的正向引物； 在特异引物对的反向引物序列的5'末端依次连接η条反向公共引物、酶切位点序列、 保护碱基序列，得到长引物对中的反向引物； 长引物对中的正向引物与长引物对中的反向引物组成长引物对； (3) 以待扩增靶序列为模板，用步骤（1)的特异引物对进行第一次PCR扩增，得到第一 PCR产物；然后以第一 PCR产物为模板，用步骤（2)的长引物对进行第二次PCR扩增，得到第 二PCR产物；然后将第二PCR产物导入质粒载体；再通过转化将该质粒载体转入大肠杆菌 感受态细胞；然后培养菌种，再提取质粒模板； (4) 通过排列组合，将步骤（1)的m条正向公共引物和η条反向公共引物配对成mXη 对公共引物； (5) 以步骤（3)的质粒模板为模板，分别对步骤（4)的各个公共引物对进行敏感性分 析，完成公共引物的筛选。
[0006] 上述技术方案中，步骤（1)中特异引物的设计为现有技术，根据引物设计的常用规 则设计，如碱基数目在15_30bp，GC含量一般为40%-60%，3'末端尽量避免以碱基A结尾， 退火温度基本一致，避免引物内或引物间二聚体的产生等；针对所要扩增的靶序列设计一 对特异性引物。
[0007] 上述技术方案中，步骤（1)中公共引物的设计参照中国专利申请 CN201410153342. 7中的公共引物设计原理和方法。
[0008] 上述方案中，步骤（2)酶切位点和保护碱基的选择，参照一般双酶切的方法和原 贝1J，如目的基因片段内部不能含有所选择的酶切位点，所使用的载体应含有所选择的酶切 位点，两个酶切位点不能靠的太近，避免选择同尾酶，尽量使用有共同buffer的酶等。
[0009] 上述技术方案中，步骤（3)中，第一次PCR扩增与第二次PCR扩增条件一样，都 采用25yL反应体系：10μΜ的正向引物与反向引物各lyL，5U/yL的Taq polymerase 0· 15 μ L，25mM 的 MgCl2 2 μ L，IOmM 的 dNTP 0· 5 μ L，IOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L， 灭菌ddH2016. 85 yL;PCR反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0010] 上述技术方案中，步骤（3)中，所述质粒载体为PMD19-T。将第二PCR产物导 入质粒载体具体为：首先对PMD19-T载体和回收的第二PCR产物进行双酶切，琼脂糖凝 胶电泳，纯化回收载体大片段和目的片段，然后将二者连接起来。采用50 μ 1酶切体系， 包括：10Xbuffer 5yl，DNA 2yg，XbaI lyl，SphI Ιμ?，灭菌 CldH2O 至 50yl，37°C水 浴 1.5-2h;采用 25μ1 连接体系，包括：10XT4 DNA ligase buffer 2·5μ1，目的 DNA 0.3pmol，载体 DNA 0.1pmol，T4 DNA Iigase Ιμ?，灭菌 ddH20 至 25yl，16°C连接过夜。
[0011] 上述技术方案中，步骤（3)中通过转化将质粒载体转移进入大肠杆菌感受态细胞 具体为：取10 μ 1连接反应液加入50 μ I DH5 α感受态细胞中，冰中放置15min。然后42°C 加热45s，再在冰中放置5min，加入800 μ I Amp阴性LB液体培养基中，37°C震荡培养lh。 然后将全部转化产物涂布于含Amp的LB固体培养基上，待菌液吸干后，倒置培养皿，于37°C 恒温箱中培养过夜。挑取单个菌落，分别接种于5ml Amp阳性LB液体培养基中，37°C震荡 培养过夜，然后取2μ 1菌液进行PCR检测，取结果阳性的菌液进行测序验证。
[0012] 上述技术方案中，步骤（3)中提取质粒模板按照质粒DNA提取试剂盒的说明书进 行操作。
[0013] 上述技术方案中，步骤（5)中，敏感性分析具体为：将公共引物经过排列组合后得 到mXn对公共引物，分别对mXn对公共引物进行敏感性检测。更具体为将含公共引物序 列的质粒从大肠杆菌中提取后得到质粒模板，再用去离子水进行10倍梯度稀释，依次得到 ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、10 2、10 copies/ μ 1稀释度的质粒模板溶液。每个稀释度取1 μ 1作为 模板，分别对mXη对公共引物进行PCR反应。反应体系25 μ 1包括：10 μ M的正向公共引 物与反向公共引物各 1 μ l，5U/y L 的 Taq polymerase 0.15 μ L，25mM 的 MgCl2 2 μ L，IOmM 的 dNTP (λ 5 μ L，IOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L，灭菌 ddH20 16. 85 μ L。反应条件为： 95°C预变性5min;95°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；72°C延伸 IOmin0
[0014] 上述技术方案中，根据步骤（4)的各个公共引物对的敏感性分析结果可以筛选适 合的公共引物对。为了使结果更准确，可以对各个公共引物对分别进行2?5次敏感性分 析，筛选出结果最接近，尤其是相同的公共引物对，即为适合多重PCR扩增体系的公共引物 对。
[0015] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点： (1)、本发明首次公开了一种筛选公共引物对的方法，用少量的公共引物条数（m+n 条），就可以实现对多数公共引物对(mXn对）的筛选工作，达到降低成本，高效筛选目的。
[0016] (2)、本发明将多条公共引物序列导入同一质粒载体中，避免模板差异影响的同 时，可以一次性区分多对公共引物扩增的敏感性，根据分析结果的优劣顺序有效筛选合适 的公共引物对，既减少了工作量，又缩短了时间，具有操作简单、快速、有效等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是实施例一中含公共引物序列的目的DNA片段的结构示意图； 图2是实施例一中构建的质粒模板部分测序结果图； 图3是实施例一中A公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图4是实施例一中B公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图5是实施例一中C公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图6是实施例一中D公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图7是实施例一中E公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图8是实施例一中F公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图9是实施例一中G公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图10是实施例一中H公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图； 图11是实施例一中I公共引物对的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述 实施例一以人类β-actin基因序列作为待扩增靶序列，筛选公共引物 1.引物的设计合成 选择一段人类β-actin基因序列作为模板，设计一对特异引物，即SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,产物大小为553bp。参照中国专利申请CN201410153342. 7中公共引物设计原理 和方法设计3条正向公共引物（SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5)与3条反向公共 引物（SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8)，在特异引物 SEQ ID No. I 的 5' 端分别依 次连接SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4共3条公共引物序列、限制性内切酶SphI 和保护碱基，构成长引物SEQ ID No. 9;在特异引物SEQ ID No. 2的5'端分别依次连接SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7共3条公共引物序列、限制性内切酶XbaI和保护碱 基，构成长引物SEQ ID No. 10, SphI的保护碱基和酶切位点为ACATGCATGC，XbaI的保护碱 基和酶切位点为GCTCTAGA。公共引物、特异引物和长引物序列见表1。
[0019] 表1公共引物、特异引物和长引物序列
【权利要求】
1. 一种筛选公共引物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 针对待扩增靶序列，设计1对特异引物以及m条正向公共引物和η条反向公共引 物；m+n为3?10 ; (2) 在特异引物对的正向引物序列的5'末端依次连接m条正向公共引物、酶切位点序 列、保护碱基序列，得到长引物对中的正向引物； 在特异引物对的反向引物序列的5'末端依次连接η条反向公共引物、酶切位点序列、 保护碱基序列，得到长引物对中的反向引物； 长引物对中的正向引物与长引物对中的反向引物组成长引物对； (3) 以待扩增靶序列为模板，用步骤（1)的特异引物对进行第一次PCR扩增，得到第一 PCR产物；然后以第一 PCR产物为模板，用步骤（2 )的长引物对进行第二次PCR扩增，得到第 二PCR产物；然后将第二PCR产物导入质粒载体；再通过转化将该质粒载体转入大肠杆菌 感受态细胞；然后培养菌种，再提取质粒模板； (4) 通过排列组合，将步骤（1)的m条正向公共引物和η条反向公共引物配对成mXη 对公共引物； (5) 以步骤（3)的质粒模板为模板，分别对步骤（4)的各个公共引物对进行敏感性分 析，完成公共引物的筛选。
2. 根据权利要求1所述筛选公共引物的方法，其特征在于：步骤（3)中，第一次PCR 扩增与第二次PCR扩增条件一样，都采用25 μ 1反应体系：10 μ Μ的正向引物与反向引物 各 lyl，5U/yL 的 Taq polymerase 0.15yL，25mM 的MgCl2 2yL，10mM 的 dNTP 0.5yL， lOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L，灭菌 ddH20 16. 85 μ L ;PCR 反应条件为：95°C预变性 5min;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
3. 根据权利要求1所述筛选公共引物对的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述质粒载 体为PMD19-T质粒载体。
4. 根据权利要求1所述筛选公共引物对的方法，其特征在于：步骤（5)中各个公共引物 对进行2?5次敏感性分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104293962SQ201410556794
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】孙万平, 段欠欠, 王萃, 胡颖熹, 沈苏南, 朱雪明 申请人:苏州大学