专利名称：一种基于gc-ms技术诊断早期肝癌的模型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，是一种可用于早期诊断肝癌的模型，为肝癌的早期诊断提供了实验基础。
背景技术：
肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，肝癌起病常隐匿，多在肝病随访中或体检普查中应用AFP及B型超检查偶然发现肝癌。此时病人既无症状，体格检查亦缺乏肿瘤本身的体征，此期称之为亚临床期。早期症状肝癌从第一个癌细胞形成发展到有自觉症状，大约需要2年时间，在此期间，病人可无任何症状或体征，少数病人会出现食欲减退，上腹闷胀、乏力等，有些病人可能轻度肝肿大。肝癌一旦出现症状，而来就诊者其病程大多已进入中晚期。中、晚期症状肝癌的典型症状和体征一般出现于中、晚期，主要有肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低，因此做到肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗具有非常重要的意义。系统生物学包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学等。后者是效仿前两者的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。代谢组学的分析技术包括GC-MS (气相色谱-质谱联用)、LC-MS (液相色谱-质谱联用)、NMR (核磁共振)等。气相色谱主要是让混合物由氦气流动相携带通过一根长长的内壁涂有薄薄的一层液态固定相的毛细柱。由于混合物的不同组分与固定相的结合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各个组分会逐个地被洗脱出来而达到分离的目的。然后进入质谱仪，质谱是先将物质离子化，变为气态离子混合物，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的。具有较高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。本发明利用代谢组学中GC-MS这一技术，建立了一种可用于早期诊断肝癌的模型，为肝癌的早期诊断提供了实验基础。
发明内容
本发明利用Agilent GC-MS系统，检测早期肝癌患者和正常人血清的代谢物轮廓，利用软件分析早期肝癌患者与正常人血清不同的代谢产物，发现新的早期肝癌相关性有机物，用于诊断早期肝癌。本发明将早期肝癌患者和健康人血清分别利用Agilent公司GC-MS上机检测，得到原始数据，根据质荷比m/z从OTST质谱库中找出相匹配的化合物。采用峰面积归一化方法进行数据校正，数据校正后运用统计学的方法计算每种化合物在不同组样品中差异的显著性，以P值0. 05为阈值，判断ρ值小于阈值的化合物为检测含量有显著性差异的化合物，筛选出在两组中有显著差异的Peak。然后进行PCA分析，PCA是可以将分散在η维变量上的代谢指纹图谱信息集中到某几个综合指标(主成分)上的统计分析方法。通过这个分析可以初步判断样品之间的关系，并可以判断是否有个别样品的数据偏离较大而需要被剔除掉。最后确定出差异的标志性代谢峰有3个，其质荷比分别为m/Z246、m/Z278、m/Z549。利用这3种代谢物，将受检人血清中相应的物质的浓度与本发明模型的平均浓度逐一进行比对，可为早期肝癌的诊断提供指导。模型的检测方法如下1.样品采集分别采集早期肝癌患者和正常人对照外周静脉血，静置，离心后，取上清液置于-80°C保存备用。2.色谱条件优化包括色谱流动相的选择，流动相梯度条件的优化，以及色谱柱温度和最佳流速的优化，以达到最佳的分离效果。3.质谱条件优化包括离子源类型的选择及其参数的设定，使得峰图更加优化。4.预实验及上样检测取预处理后的血清样品注入进样孔，进行相关系数的设置。5.测试报告的分析获得的原始数据经数据校正后，运用统计学方法找出含量明显差异的物质，运用PCA分析，将偏离较大的物质剔除掉，最后得到标志性差异代谢物。
图1三个峰在各样本中的峰高灰色直线左侧为正常组，右侧为早期肝癌组。Peak6. 653表示m/z246的代谢物，peak7. 358表示m/z278的代谢物，peak6. 764表示m/z549的代谢物。图2发现的三个特征峰对正常组(normal)和早期肝癌组(cancer)的分类图中圆圈为正常组，方形为早期肝癌组。
具体实施例方式1.材料1. 1样品采集分别使用抗凝管采集正常组和早期肝癌组静脉血2ml，在4°C冰箱中静置30min后离心GOOOrpm，5min).取200ul上清液分装于低吸附离心管中，_80°C冰箱中保存，备用。1. 2所需主要试剂与仪器乙腈、氯苯丙氨酸、甲醇、硅烷化衍生试剂等均购自上海化学试剂公司。AgilentGC-MS系统购自Waters公司。2.方法2.1高丰度蛋白的去除样品室温下融化，加入IOOul的乙腈，涡旋混勻Imin后超声波萃取^iiin。形成的悬浮液再离心14000rpm，IOmin, 10°C。最后取200ul上清液置于GC-MS进样瓶中，在氮气下将溶液完全吹干。
2. 2样品衍生化加入IOOul的硅烷化衍生试剂，90°C下反应lh，冷却至室温。2. 3GC-MS 预实验取Iul的样品量进行预实验，调整相关系数，得到最佳的质谱图。2. 4正式实验将样品一个一个地注入GC-MS系统，打出图谱，得到原始数据。2. 5数据分析对原始数据进行校正，以0. 05的ρ值为阈值，运用统计学方法找出差异明显的物质，利用PCA分析，将偏差较大的物质剔除掉，最后得到3种标志性差异代谢物分别为m/z246、m/z278、m/z549。利用这3种物质，将受检人血清中相应的物质的浓度与本发明模型逐一进行比对，可为肝癌的早期诊断提供辅助指导。实验实例取受检者血清，经检验得到其代谢产物图谱，得到质荷比分别为m/Z246、m/Z278、m/z549的特异代谢物的含量，与本实验中的对应样品的平均含量进行比较，若含量近似为本模型平均含量的2倍，则为早期肝癌组，否则为正常组。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.用于早期肝癌诊断的模型，其特征在于由气相色谱-质谱联用系统检测的代谢物图谱，经过软件统计分析得到早期肝癌患者多个特异代谢物的浓度，所说的特异代谢物的质荷比分别为 m/z246、m/z278、m/z549。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，是一种可用于诊断早期肝癌的模型。本发明运用气相色谱-质谱联用系统，检测正常人及早期肝癌患者的外周血清样品，找出与早期肝癌患者差异显著的特异代谢产物，根据各代谢产物的浓度与正常人含量的平均值，建立一个诊断模型。只要将检测人血清中三种相应的代谢产物的浓度与本发明的模型进行比较分析，就可以初步用于早期肝癌诊断。
文档编号G01N30/72GK102375039SQ20101025807
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者曾华宗 申请人:曾华宗