Cd166作为肝癌诊断血清标志物的应用及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床诊断技术领域，具体地说，涉及一种诊断肝癌的试剂盒以及应用。
【背景技术】
[0002]肝癌即肝脏恶性肿瘤，是外科疾病中的常见病和多发病，肝脏恶性肿瘤可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。由于肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要代谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤将导致危及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富的血流供应，与人体的重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤发病隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。因此，早期发现、早期诊断、早期治疗。
[0003]目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查等方法，然而这些检测方法均具有一定的局限性。例如即使是很好的细针穿刺仍取材有限有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。癌症的血清学检测技术一直是研究的重点。然而，目前现有的针对癌症(如HCC)检测尚缺乏令人满意的血清标志物，更缺乏可用于血清检测或肝癌预后检测的血清标志物。
[0004]血清CD166又称为白细胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhes1nmolecule)，是淋巴细胞抗原⑶6的配基，主要在白细胞和胸腺上皮细胞上表达。
[0005]中国期刊《南方医科大学》2013年刊出的论文“⑶133及⑶166在脑膜瘤中的表达及临床意义”，作者通过一系列实验研究得出以下结论:1、⑶133与⑶166在不同级别的脑膜瘤均有表达，⑶133及⑶166阳性细胞表达水平随脑膜瘤病理级别增高而增高。并且在不同级别组脑膜瘤中⑶133阳性细胞(p=0.001)与⑶166阳性细胞(p=0.000) 1D值差异均有显著性。2、⑶133及⑶166表达成正相关关系。经Spearman直线相关分析表明，⑶133阳性细胞与⑶166阳性细胞1D值呈显著正相关(p=0.000)。3、切片染色可观察到⑶133与⑶166共定位表达情况AD166可能为脑肿瘤干细胞标记物之一，与目前公认的脑肿瘤干细胞标记物⑶133可共同作为肿瘤干细胞的标记物。4、⑶166高表达组复发率较高，⑶166与脑膜瘤复发相关。
[0006]然而，目前关于⑶166作为肝癌诊断标志物还未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种CD166蛋白或其特异性抗体的用途。
[0008]本发明的再一的目的是，提供一种用于检测肝癌的诊断试剂盒。
[0009]本发明的另一的目的是，提供所述的诊断试剂盒的用途。
[0010]本发明的第四个目的是，提供一种⑶166蛋白的用途。
[0011]为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是:
CD166蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。
[0012]所述的检测是血清检测。
[0013]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含测定血清中CD166蛋白含量的试剂。
[0014]所述的测定血清中⑶166蛋白含量的试剂为⑶166蛋白的特异性抗体。
[0015]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的诊断试剂盒的用途，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。
[0016]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种CD166蛋白的用途，它被用作检测肝癌的标志物。
[0017]所述的检测是血清检测。
[0018]本文中，所检测的血清中肝癌标志物⑶166蛋白在NCBI上的GenBank序列号是GENE.1D 214。本领域技术人员知道，凡是能捕获和测定血清中上述⑶166蛋白的试剂(如CD166蛋白的特异性抗体)均能用于制备肝癌检测的试剂或试剂盒。
[0019]本发明优点在于:本发明首次证实了 CD166蛋白可以作为肝癌诊断的标志物，可以通过检测血清中的CD166蛋白浓度来诊断和预示肝癌疾病，取样方便、易于检测，且具有特异性和灵敏度高等优点。由于CD166是细胞表面分子，因此不仅可以用来诊断肝癌，而且有望成为治疗肝癌的分子靶点。
【附图说明】
[0020]附图1:免疫印迹(Western Blotting)检测2组正常人和8组肝癌患者血清中CD 166 的浓度(HI 是 Healthy individual, H 是 HCC)。
[0021]附图2:不同疾病人群血清中⑶166的含量，箱式图显示正常人、肠癌、肝癌、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、胃癌、乳腺癌和肺癌患者血清中CD166的浓度。
[0022]附图3:配对T检验结果显示肝癌患者术前和术后血清中⑶166浓度的变化。
[0023]附图4:卡方检验结果显示⑶166的浓度和肝癌患者的临床病理分期有关。
[0024]附图5 =ROC曲线显示⑶166和AFP诊断肝癌的特异性和灵敏度。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0026]实施例1 I实验材料
试剂盒买自上海丽臣生物科技有限公司，试剂盒全称:human⑶166 ELISA KIT，货号:LC9012,组成:微孔酶标板12孔*8条、标准品(4ng/ml )0.6ml、标准品稀释液6ml、样本稀释液6ml、检测抗体-HRP、洗涤缓冲液25ml、底物A、底物B、终止液、封板膜、说明书、自封袋。
[0027]2、实验方法
血清样本中CD166的检测方法为:双抗一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法。具体步骤:(I)实验前准备洗涤缓冲液，ELISA板在室温平衡20分钟。(2)设置标准孔、样品孔、空白孔(什么也不加)。标准孔分别加入不同浓度的标准品50ul ;样品孔提前摸条件，血清样品稀释5倍(样品孔加40ul样本稀释液，1ul待测血清样本)。(3)标准孔和样品孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体lOOul，37度恒温箱60分钟。(4)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液，洗涤5次。(5)标准孔、样品孔和空白孔都加入底物A和B各50ul，37度避光孵育15分钟。(6)所有孔加入终止液50ul，15分钟内在450nm波长处测定各孔的吸光值。结果判定:首先标准孔和样品孔的吸光值都要减去空白孔的吸光值；其次根据标准孔的吸光值和浓度，绘制标准品的线性回归曲线；根据标准曲线和样品孔的吸光值算出待测血清中CD166的浓度，再乘以稀释倍数5倍，得出血清样品CD166的最终浓度，单位是 ng/ml0
[0028]3、实验结果
(I)图1为免疫印迹(Western Blotting)检测2组正常人和8组肝癌患者血清中⑶166的浓度的结果，其中HI是Healthy individual, H是HCC。结果表明8组肝癌患者血清(每组为8人份肝癌病人血清等量混合)中CD166的浓度明显高于2组正常人(每组为8人份正常病人血清等量混合)。
[0029](2)分别在85例正常人、89例肠癌、51例肝癌、48例乙型肝炎、40例丙型肝炎、41例肝硬化、21例胃癌、25例乳腺癌和21例肺癌患者血清中使用试剂盒检测CD166的浓度，结果如图2所示，发现肝癌患者血清中⑶166的浓度显著高于正常人、其他肝脏疾病和其他系统癌症。
[0030](3)检测肝癌患者(7例)肝癌切除术前后血清中⑶166浓度，结果图图3所示，发现术后患者血清⑶166含量下降明显。
[0031](4)检测不同肝癌分期患者血清中⑶166浓度，结果如图4所示，行X列表卡方检验显示⑶166的浓度和肝癌患者的分期有关系，分期越高⑶166的浓度越大。
[0032](5)甲胎蛋白(AFP)是经典的早期辅助诊断肝癌的血清学指标，AFP和⑶166的受试者工作曲线(ROC)如图5所示，显示⑶166的灵敏度和特异性都较好。
[0033]4.结果分析
正常人血清中几乎检测不到⑶166，但是肝癌患者血清中⑶166的表达明显升高(图1)。为了证明肝癌患者血清中⑶166的升高是特异性的，我们分别检测了 85例正常人，CD 166平均浓度是216.8±577.lng/ml。89例肠癌平均浓度是636.2±488.5ng/ml,男/女0.82/1。51例肝癌平均浓度是7138.89±5434.68ng/ml,男/女18/1。48例乙型肝炎平均浓度是883.66±1139.32ng/ml，男/女1.4/1。40例丙型肝炎平均浓度是327.5±145.3ng/ml，男 / 女 1.35/1。41 例肝硬化平均浓度是 964.99±1275.136ng/ml，男 /女2.73/1。21例胃癌平均浓度是156.8±55.47ng/ml，男/女6/1。25例乳腺癌平均浓度是369.3±638.48ng/ml和21例肺癌平均浓度是332±94.59ng/ml，男/女1.63/1等病人血清中⑶166的浓度(图2)，发现肝癌患者血清中⑶166的升高是比较特异的。同时我们也分析了同一个肝癌患者肝癌切除术前和术后血清中⑶166的表达情况，发现术后⑶166明显下降(图3)。最后，在上述正常人和肝癌患者血清中同时检测AFP的浓度，并且和⑶166绘制了 ROC曲线，⑶166曲线下面积是0.9860，AFP曲线下面积是0.9142(图5)，发现⑶166的特异性和灵敏度都非常好。
[0034]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.CD166蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是血清检测。3.一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含测定血清中⑶166蛋白含量的试剂。4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的测定血清中CD166蛋白含量的试剂为CD166蛋白的特异性抗体。5.权利要求3或4所述的诊断试剂盒的用途，其特征在于，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。6.一种CD166蛋白的用途，其特征在于，它被用作检测肝癌的标志物。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测是血清检测。
【专利摘要】本发明涉及CD166作为肝癌诊断血清标志物的应用及其试剂盒。本发明首次证实了CD166可以作为肝癌诊断的标志物，因此可以通过检测血清中的CD166浓度来诊断和预示肝癌疾病，取样方便、易于检测，且具有特异性和灵敏度高等优点。由于CD166是细胞表面分子，因此不仅可以用来诊断肝癌，而且有望成为治疗肝癌的分子靶点。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/574
【公开号】CN105628919
【申请号】CN201410594965
【发明人】孙奋勇, 王佳谊
【申请人】上海市第十人民医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月30日
【公告号】WO2016065877A1