作为血清和组织生化标志物的bag3的制作方法
【专利说明】作为血清和组织生化标志物的BAG3
[0001] 说明
[0002] 本发明涉及用作病理状态的诊断中的生化标志物的BAG3RNA或其片段。 现有技术
[0003] BAG3(RefSeq :NP_004272 ;基因 ID 9531)为74kDa的细胞质蛋白，特别是集中在 粗糙型内质网中。BAG3蛋白属于通过称为BAG域的结构域（110-124个氨基酸）与热激蛋 白HSP70的ATPase域相互作用的共分子伴侣（co-chaperones)家族。除了 BAG域，BAG3 包括Wff域以及可介导与其它蛋白结合的富含脯氨酸的重复（PXXP)。此外，两个保守的 IPV(Ile-Pro-Val)基序位于Wff和PXXP区域之间，并介导BAG3结合到分子伴侣HspB家 族的成员HspB8。因此，由于它的多结构域结构的衔接性质，BAG3可与不同的伴侣蛋白相 互作用。bag3基因表达在包括肌细胞的少数正常的细胞类型中和数个原发瘤或肿瘤细胞 系中是组成性的。此外，它可被各种应激源诱导：事实上应激的刺激物激活热激转录因子 (HSF) 1，HSFl 负责应激激活的基因包括 bag3 的表达（Rosati A, Graziano V，De Laurenzi V, Pascale M, Turco MC. BAG3:a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2011 ;2:el41)。证据表明，BAG3通过根据细胞的环境以依赖或 不依赖Hsp70的方式调节细胞凋亡调节的蛋白质例如IKK γ、Bax或BRAF的水平或定位，具 有维持细胞存活的功能。
[0004] BAG3蛋白质表现为在心肌成肌细胞分化期间表达，并且维持成肌素的表达。这 些发现表明BAG3参与心脏的后期发育（De Marco M，Turco MC，Rosati A，BAG3protein is induced during cardiomyoblast differentiation and modulates myogenin expression. Cell Cycle. 2011 ;10:850-852)。此外，在心肌细胞中，BAG3 已经显示位于 Z-盘，并且与肌动蛋白加帽蛋白CapZ β 1相互作用，稳定肌原纤维结构，并且在机械应激过 程中可能保持肌纤维的完整性。BAG3突变可损害Z-盘的组装，并提高对应激诱导的细胞凋 亡的敏感性。与BAG3在心肌细胞并且通常在肌细胞中的存活和肌纤维的完整性中的作用 一致，bag3基因的突变已经与一些形式的肌纤维肌病和扩张型心肌病相关联。
[0005] 到目前为止，已经检测到了细胞质BAG3和可溶的串行形式的BAG3二者，并且发现 它们与不同的病理，以及更广泛地与细胞存活相关联。
[0006] 对允许快速鉴定这样的病理，而不具有以意外的特殊方式以及敏感的方式与创伤 性诊断相关联的缺点，和/或可允许早期检测病理，监测治疗的效果，预测并发症的风险， 进行信息追踪的生物学标志物的鉴定日益感到需求及重要性。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及用作病理状态的诊断中的生化标志物的BAG-3RNA或其片段。
[0009] 优选地，所述 BAG3RNA 为 BAG3mRNA。
[0010] 根据本发明优选的实施方式，所述诊断是体外的（in vitro)或离体的（ex vivo)。
[0011] 本发明的另一方面为，所述诊断的接受者为哺乳动物，优选人类。
[0012] 如在本发明的详细说明中进一步描述的，本发明的BAG-3RNA或其片段的用途具 有对选自由心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾 病组成的组的病理状态特异性的优点。
[0013] 根据本发明优选的实施方式，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、 心力衰竭、局部缺血（ischemia)、急性冠心病（acute coronary disease)、急性心力衰竭、 慢性心力衰竭和医源性心脏病。
[0014] 根据本发明的另一个优选的实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺 癌。
[0015] 本发明的另一个实施方式为用于在生物样品中检测和/或定量BAG3基因表达的 试剂盒，特征在于包括由bag3核苷酸序列（SEQ ID NO 18)包含的一对单链寡核苷酸引物。
[0016] 优选地，所述试剂盒包括一对引物，所述一对引物选自具有包含在bag3核苷酸序 列的核苷酸1至核苷酸360、核苷酸466至核苷酸1570或核苷酸1801至核苷酸2533的区 域之一中的核苷酸序列的引物。
[0017] 本发明的另一个优选的实施方式为，所述试剂盒包括选自具有下述序列的引物中 的一对引物：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。
[0018] 优选地，所述引物具有60°C和75°C之间，优选72°C的退火温度。
[0019] 优选地，所述引物组适于通过实时定量RT-PCR检测和/或定量BAG3RNA或其片 段。
[0020] 在本发明优选的实施方式中，所述生物样品为血清、血浆、尿、唾液或组织样品。
[0021] 优选地，所述血清、血浆、尿、唾液或组织样品来自哺乳动物，优选人类。
[0022] 根据本发明另一个实施方式，所述试剂盒特异地诊断病理状态，所述病理状态选 自由心脏病，癌症，糖尿病、皮肤、神经、骨、血管和结缔组织的炎症和炎症相关的疾病组成 的组。
[0023] 根据本发明优选的实施方式，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、 心力衰竭、局部缺血、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
[0024] 根据本发明另一个优选的实施方式，所述癌症选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0025] 本发明的另一个实施方式为检测和定量生物样品中BAG3RNA或其片段的水平的 方法，包括以下步骤：
[0026] a.获得生物样品，所述生物样品由血清、血浆、尿、唾液或组织样品组成，
[0027] b.从所述生物样品提取总RNA，
[0028] c.通过实时定量RT-PCR定量BAG3RNA或其片段。
[0029] 根据优选的实施方式，本发明的方法还包括以下另外的步骤：
[0030] c.比较从所述生物样品获得的值与参考值或从健康供体获得的值。
[0031] 根据本发明另一个优选的实施方式，所述血清、血浆、尿、唾液或组织样品来自哺 乳动物，优选人类。
[0032] 根据本发明的方法的优选的实施方式，所述抗BAG RNA或其片段的存在与病理状 态相关。
[0033] 优选地，所述病理状态选自由心脏病，癌症，糖尿病，皮肤、神经、骨、血管和结缔组 织的炎症和炎症相关的疾病组成的组。
[0034] 优选地，所述心脏病选自：心绞痛、梗塞前心绞痛、心肌梗塞、心力衰竭、局部缺血、 急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
[0035] 优选地，所述癌症疾病选自：胰腺癌、膀胱癌和前列腺癌。
[0036] 本发明还进一步涉及用于检测生物样品中的BAG3蛋白的免疫组织化学（IHC)试 剂盒，其中，所述生物样品优选为组织样品，所述试剂盒包括BAG3-特异的抗体和试剂，所 述试剂包括染色需要的探针。
[0037] 附图简述
[0038] 本发明的特征和优点将从下面记录的详述、为了说明而非限制目的给出的实施例 以及附图1-9中明显，其中：
[0039] 图 1.
[0040] 图IA :在来自培养的心肌细胞的上清液中检测BAG3蛋白质。在5%的CO2气氛下 于37°C使用或不使用10%的FBS培养80%融合的人（HCMa)和大鼠（H9c2)心肌细胞16个 小时。在包含50mM NaCl和0. 05% IGEPAL的缓冲液中透析所述上清液，冻干，并在Iml的 RIPA 缓冲液（50mM Tris HCl pH 7. 6、150mM 氯化钠、2mM 原钒酸钠、4mM EDTA、10mM 焦磷酸 钠、1% NP-40、0. 1%脱氧胆酸钠）中重悬，通过蛋白质印迹用抗BAG3抗体或抗GAPDH抗体 分析。
[0041] 图IB :在胞吐囊泡中检测BAG3蛋白质。从H9c2细胞获得的上清液（Surnatants) 经连续的离心：（i)2' OOOXg 15分钟，以去除细胞；（ii)lO' 000Xg30分钟，以去除细胞 碎片；（iii) 150'OOOXg 90分钟，以使胞吐囊泡成团块。在PBS中以150'OOOXg洗团块 (pellet) 90分钟一次，并通过蛋白质印迹用抗BAG3T0S-2多克隆抗体分析，与全细胞裂解 物比较。Rab-4作为胞吐囊泡的标志物被分析。细胞溶质蛋白GAPDH作为对照被分析。
[0042] 图IC :在蛋白质印迹中用抗BAG3抗体T0S-2多克隆抗体分析来自两个健康供体 和两个受慢性心力衰竭影响的患者的血清。
[0043] 图ID :从凝胶切除在两个受慢性心力衰竭影响的患者中获得的条带，并使用程序 MASCOT通过质谱分析它的身份。
[0044] 图 2.
[0045] 图2A :在来自CHF患者的血清中检测BAG3蛋白质。通过蛋白质印迹用从心力衰 竭患者获得的血清（1:40)分析BAG3重组蛋白和来自HCMa细胞的全细胞裂解物。进行来 自健康供体的血清的分析作为阴性对照。
[0046] 图2B :通过ELISA试验检测抗BAG3抗体。在特异性ELISA试验中比较来自50个 CHF患者（具有〈60 %的射血分数）的血清与来自50个健康供体的血清中抗BAG3抗体的 存在。结果以任意单位绘制。
[0047] 图2C :ELISA试验结果的ROC分析。于0. 083A. U.的截断值导致74%的灵敏度和 68 %的特异性。
[0048] 图 3.
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