单细胞的多转录物的高通量测序的制作方法
【专利说明】单细胞的多转录物的高通量测序
[0001] 本申请要求2012年6月15日提交的美国临时申请号61/660, 370的优先权权益， 所述案的所有内容以引用的方式并入本文中。
[0002] 发明背景
[0003] 1.发明领域
[0004] 本发明大体上涉及分子生物学和免疫学的领域。更具体地说，本发明涉及用于高 通量分离CDNA编码免疫细胞受体和抗体的方法。
[0005] 2.相关领域的描述
[0006] 存在对以高通量从单个细胞鉴别两种或更多种转录物的表达的需要。具体地说， 对于许多生物技术和医学应用来说，以极高通量从单个细胞鉴别并且测序编码包括适应性 免疫受体的两条链的基因对以准确测定表达于患者或实验室动物中的免疫受体的完整组 库是重要的。由B淋巴细胞和T淋巴细胞表达的免疫受体分别由VH和VL抗体基因以及由 TCRa/β或γ/δ链基因编码。人具有基于表面标志（⑶蛋白）和转录因子（例如Treg T淋巴细胞亚群的FoxP3)的表达被分类成不同亚群的数万或数百万种不同的B淋巴细胞和 T淋巴细胞。高通量DNA测序技术已用以测定相关于具体疾病状态的淋巴细胞亚群的VH或 VL链的组库，或替代地，TCRa和β的组库，或更一般地说，以研宄适应性免疫系统的功能 (Wu等，2011)。免疫学研宄人员对一次高通量分析多转录物具有尤其大的需求。
[0007] 目前可获得的用于免疫组库测序的方法涉及从所关注的细胞群体，例如骨髓的 记忆B细胞或浆细胞，分离出mRNA，然后大批进行RT-PCR以合成用于高通量DNA测序的 cDNA(Reddy等，2010 ;Krause等，2011)。但是，重抗体链和轻抗体链（或a和βΤ细胞受 体）在分开的mRNA链上编码并且必须分开测序。因此，这些可获得的方法具有单独地揭开 全部重链免疫组库和轻链免疫组库的可能，但还不能解决以高通量的重链和轻链配对。在 不以单细胞水平的多转录物分析以收集重链和轻链配对数据的情况下，包括两条链的全适 应性免疫受体不能测序或重建并且表达用于进一步研宄。
[0008] 发明概述
[0009] 在第一实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法包括（a)将单细胞和mRNA捕 获剂隔离到单独隔室中；(b)使细胞裂解并且收集具有mRNA捕获剂的mRNA转录物；（c)使 用mRNA捕获剂从隔室分离mRNA ; (d)进行逆转录，然后对捕获的mRNA进行PCR扩增；以及 (e)测序从单细胞扩增的至少两个不同cDNA产物。在某些方面中，细胞可为B细胞（例如， 浆细胞或记忆B细胞）、T细胞、NKT细胞和癌细胞。
[0010] 因此，在特定实施方案中，本发明提供一种用于获得多个成对抗原受体序列的方 法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸将单哺乳动物细胞分离于单独隔室中用于引发 逆转录；(b)使细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；（c)进行逆转录，然 后进行PCR扩增以获得对应于单细胞的mRNA转录物的cDNA ; (d)测序cDNA ;以及（e)基于 测序鉴别多个单细胞的多mRNA转录物（例如成对抗原受体序列）。例如，在一些方面中，提 供一种用于获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸 将单B细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使B细胞裂解并且允许mRNA转录物与 固定化寡核苷酸缔合；（C)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单B细胞的mRNA转 录物的cDNA ;⑷测序cDNA ;以及（e)鉴别多个单B细胞的成对抗体VH和VL序列。在另 外方面中，提供一种用于获得多个成对T细胞受体序列的方法，所述方法包括（a)用固定化 寡核苷酸将单T细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使T细胞裂解并且允许mRNA 转录物与固定化寡核苷酸缔合；（c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单T细胞 的mRNA转录物的cDNA ;⑷测序cDNA ;以及（e)基于测序鉴别多个单T细胞的成对T细胞 受体序列。
[0011] 在另外方面中，所述方法包括获得至少10, 000个、100, 000个或1，〇〇〇, 000个单 个细胞（例如，在约100, 〇〇〇个与一千万个或一亿个之间的单个细胞）的序列。因此，在一 些方面中，所述方法包括获得至少5, 000个、10, 000个或100, 000个个体成对抗体VH和VL 序列（例如，在约10, 〇〇〇个与100, 〇〇〇个、一百万个或一千万个之间的个体成对序列）。在 某一方面中，获得如VH和VL序列的成对序列可包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链 式反应来连接cDNA(例如，VH和VL cDNA)以连接单分子中的cDNA。在替代方面中，实施方 案的方法不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。例如，两个（或更多个）cDNA序 列可通过测序不同分子，如通过测序不同分开的VH和VL cDNA分子获得。
[0012] 在一个方面中，所述方法还包括使用概率分析测定天然成对转录物。在这个方面 中，鉴别成对转录物可包括比较原始测序读长计数（read count)。例如，概率分析可包括进 行图9的步骤。在特定方面中，方法可包括通过进行序列的概率分析鉴别成对抗体VH和VL 序列。在某些方面中，概率分析可基于⑶R-H3和/或⑶R-L3序列。在一些情况下，鉴别成 对抗体VH和VL序列可包括比较原始测序读长计数。在另一方面中，概率分析可包括进行 图9的步骤。
[0013] 本实施方案的某些方面涉及mRNA捕获剂。例如，mRNA捕获剂可为如珠粒的固体 支持物，其包括固定化寡核苷酸或如葡聚糖和琼脂糖的聚合物网络。在一个方面中，珠粒为 二氧化硅珠粒或磁性珠粒。mRNA捕获剂可包括杂交mRNA的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可包 括至少一个Poly(T)和/或对所关注的转录物特异的引物。在某些方面中，实施方案的珠 粒小于分离的单个细胞（例如B细胞）。
[0014] 在一些方面中，实施方案的单独隔室可为凝胶或微量滴定板中的孔。在一个方 面中，单独隔室可具有小于5nL的体积。在一些方面中，孔可在使细胞裂解之前或在进行 RT-PCR之前用透性膜密封。在又另一方面中，单独隔室可为乳液中的微泡。
[0015] 在另外方面中，隔离单细胞（和mRNA捕获剂）和裂解细胞裂解（步骤（a)和（b)) 可同时进行。因此，在一些方面中，方法可包括分离单细胞和mRNA捕获剂到乳液中并且存 在细胞裂解溶液的单独微泡中。
[0016] 在另外方面中，实施方案的方法可包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反 应来连接cDNA以将至少2个转录物连接到单DNA分子中（例如，在步骤（e)中）。在替代 方面中，步骤（e)可不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。在某些方面中，步骤 (e)可包括通过进行重组来连接cDNA。
[0017] 在又另外方面中，隔离单细胞可包括将细胞引入到包括多个微孔的装置，以使得 大部分细胞以单细胞的形式（与mRNA捕获剂一起，如珠粒）捕获。在另外方面中，方法可 包括共价连接到同一珠粒的两个或更多个转录物的测序。
[0018] 因此，在一些实施方案中，提供用于获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，其中 细胞为B细胞。在一个方面中，方法为用于获得结合到关注抗原的抗体的成对抗体VH和VL 序列的方法。在某些方面中，珠粒可缀合到所关注抗原，并且寡核苷酸在结合到所关注抗原 的抗体的存在下仅缀合到珠粒。例如，珠粒可包覆有所关注抗原，并且mRNA捕获剂（例如， oligo-T)可与仅在结合到抗原的抗体的存在下的珠粒缔合（参见例如，图10)。例如，mRNA 捕获剂可与蛋白A缔合或以其它方式起作用以结合到抗体（若存在）。
[0019] 实施方案的某些方面可涉及从受试者获得样品（例如，包括用于实施方案的方法 中的细胞的样品）。样品可直接取自受试者或可获自第三方。样品包括但不限于血清、粘膜 (例如唾液）、淋巴、尿液、粪便，和实体组织样品。类似地，实施方案的某些方面涉及生物体 液和来自生物体液的抗体和/或核酸。例如，生物体液可为血液（例如，血清）、脑脊髓液、 滑液、产妇母乳、脐带血、腹腔液、粘膜分泌物、泪液、鼻分泌物、唾液、乳汁、或泌尿生殖器分 泌物。在某些方面中，根据实施方案使用的细胞为哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或 猴子细胞。在优选的方面中，细胞为人细胞。
[0020] 在一些方面中，实施方案中所用的细胞为B细胞，如来自所选器官如骨髓的B细 胞。例如，B细胞可为成熟B细胞，如骨髓浆细胞、脾浆细胞或淋巴结浆细胞，或外周血或淋 巴器官的细胞。在某些方面中，B细胞是基于细胞表面标志（例如，Blimp-U⑶138、CXCR4 或⑶45)的差异表达来选择或富集。在一些情况下，获得所选类别抗体的序列，如IgE、IgM、 IgG或IgA序列。
[0021] 在另外方面中，实施方案的方法可包括使受试者免疫（例如，在获得细胞样品之 前）。所述方法可还包括分离淋巴组织。淋巴组织分离可在免疫之后至少或约1、2、3、4、5、 6、6、8、9、10天或任何中间范围。所述方法可还包括获得淋巴组织的核酸群体，优选地未将 B细胞从淋巴组织中分开。淋巴组织可为初级淋巴组织、次级淋巴组织或三级淋巴组织，如 骨髓、脾或淋巴结。受试者可为任何动物，如哺乳动物、鱼、两栖动物或鸟。哺乳动物可为人、 小鼠、灵长类动物、兔、羊或猪。
[0022] 为了测定核酸序列（例如，在B细胞中或在淋巴组织中），可使用本领域中已知 的任何核酸测序方法，其包括高通量DNA测序。高通量测序方法的非限制性实例包括合 成测